用于治疗肝损伤的组合物和方法与流程

本发明是根据由美国国家糖尿病与消化性肾病研究院(NIDDK，National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)授予的批准号R01 DK079881在政府支持下进行。政府具有本发明中的某些权利。

发明领域

本发明涉及肝疾病和病症，具体地是胆汁淤积的领域。确切的说，披露了用于治疗、抑制和/或预防胆汁淤积的组合物和方法。

发明背景

为了描述本发明所属领域的现状，贯穿本说明书引用了若干公开和专利文件。这些引用文献中的每一份均通过引用结合在此，就好像完全阐述一样。

胆汁淤积是胆汁的合成或排泄受损的状态，并且它是肝脏各种各样的感染性、炎症性、遗传性、毒性、以及血管性疾病的最终常见终点。胆汁组分(具体地是胆汁酸)的累积对于肝脏是有毒的，并且慢性胆汁淤积导致进行性纤维化、肝硬化、肝衰竭、以及死亡(如果未治愈的话)(科斯特斯(Kosters)等人(2008)外源物(Xenobiotica)38:1043-71)。胆汁淤积是由多种感染性、阻塞性、代谢性和发展性肝病症引起的。在肝对胆汁淤积的反应的理解方面的进展因此可以对患有肝疾病的庞大成人和儿童群体具有影响。

胆汁淤积使得肝细胞和胆管细胞暴露于通常分泌到小肠的高水平毒素中，这些毒素包括胆汁酸、重金属和外源物。不意外的是，胆汁酸合成、小管分泌、肠吸收、以及输入到肝细胞中的循环是通过反馈机制调节的(瓦格纳(Wagner)等人(2010)肝病研讨会(Seminars Liver Dis.)，30:160-77)。这些循环大部分是基于核受体转录因子(NR)检测胆汁酸和其他胆汁组分的细胞内浓度的能力。在肝细胞中，NR抑制胆汁酸输入蛋白(importer)和合成酶的表达，同时激活输出基因。主要参与其他代谢途径的NR也可能影响胆汁功能；例如，脂质传感器PPARγ调节了胆汁酸合成中的限速酶CYP7A1以及磷脂转运体MDR3(小鼠中的Mdr2)(马拉波迪(Marrapodi)等人(2000)脂质研究杂志(J.Lipid Res.)，41:514-20；科克(Kok)等人(2003)生物化学杂志(Biochem.J.)，369:539-47)。然而，这些体内平衡途径不能阻止肝脏处于许多胆汁淤积性疾病的环境中。因此，胆汁淤积性损害进展成胆汁性肝硬化和肝衰竭。在治疗患有胆汁淤积性疾病的患者中的进展需要更好地理解调节胆汁流动和对慢性升高的胆汁酸的细胞反应的分子途径。

技术实现要素：

根据本发明，提供了抑制、治疗和/或预防与肝脏相关联的疾病或病症(例如，肝损伤)的方法。在一个特定实施例中，与肝脏相关联的该疾病或病症是肝纤维化。在一个特定实施例中，与肝脏相关联的该疾病或病症是胆汁淤积。在一个特定实施例中，该方法包括向受试者给予抑制特别是在受试者的肝脏中的miR-27a簇和/或miR-182簇的至少一种药剂。在一个特定实施例中，该方法包括给予与miR-27a簇和/或miR-182簇，特别是miR-27a和/或miR-182特异性杂交的至少一种抑制性核酸分子(例如，siRNA、反义物、shRNA等等，具体地是反义寡核苷酸)。该一种或多种反义寡核苷酸可以表达载体诸如AAV载体给予。

附图简要说明

图1示出miR-27a和miR-182是由胆汁淤积诱导的。肝miRNA是通过在8周大的Mdr2^-/-小鼠对比野生型(WT)小鼠、胆管结扎小鼠(BDL)对比假处理小鼠(结扎后15天)、以及来自患有胆道闭锁的儿童的人临床样品或非胆汁淤积性疾病对照样品中进行定量PCR(qPCR)来测量的。对于小鼠n＝4-6；对于人肝脏样品n＝8。对于所有成对组p<0.05。

图2示出反义寡核苷酸(ASO)处理对Mdr2缺失雄性小鼠的影响。用ASO27和ASO182处理相对于对照ASO显著减少了转氨酶升高(transaminitis)。用ASO27处理显著减少了肝肿大。显著性差异以括号表示：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图3A-图3D示出ASO27影响了基因表达并且减少了肝纤维化。图3A示出通过RT-qPCR测定的相对转录物水平。n＝6，*p<0.05；**p<0.01；NS，不显著。当miR-27a在体内被阻断时，MiR-27靶标Foxo1和Ppara显著上调，同时纤维化相关胶原4a1(Col4a1)的表达减小。图3B提供了来自ASO27-处理的Mdr2突变体小鼠的肝切片的三色染色图像。观察到桥连纤维化的定性减少。图3C提供了总胆汁酸的血清水平。图3D示出肝羟脯氨酸水平在ASO27-处理的Mdr2突变体小鼠中相对于ASOctrl处理更低。杂合子(het)：n＝4-8；突变体：n＝6-10；*p<0.05；**p<0.01；NS，不显著。

图4提供了在用0、2、5或10mg/kg ASO27处理的Mdr2突变体小鼠中肝损伤的常用指示物(左图)：乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)；以及丙氨酸转氨酶(ALT)的血清水平的图表和胆汁淤积的常用血清指示物(总胆红素，右图)的图表。

发明详细说明

微小RNA是微调基因表达的调节分子并且是几种疾病中的一类新兴的生物标记物。然而，微小RNA在胆汁淤积中的作用是未知的。在此，已发现几种miRNA在不同胆汁淤积模型中诱导并且具体地说两种miRNA强烈促成发病机理。更确切地说，在此提供的结果表明miR-23a/miR-27a/miR-24-1簇(在下文中为miR-27a簇)和miR-183/miR-96/miR-182(在下文中为miR-182簇)簇促成胆汁淤积性损伤和/或纤维化。另外，miR-27a簇和/或miR-182簇的抑制改善了在进行性家族氏肝内胆汁淤积(PFIC3)的小鼠模型中的胆汁淤积性表型，这表明这些miRNA的诱导是致病的。更确切地说，在用miR-27a和/或miR-182反义寡核苷酸处理的小鼠中肝损伤减少并且观察到较少的纤维化。

在此已发现在肝胆汁淤积模型和人肝脏胆道闭锁样品中诱导了微小RNAmiA-27a和miR-182。胆道闭锁(BA)是一种婴儿的肝脏纤维炎性肝病，其中未知病原学的原发性损伤导致肝外胆管系统的进行性T细胞介导性破坏(贝泽拉，J.A.(Bezerra,J.A.)(2005)儿科学移植(Pediatr.Transplant)9:646-651；哈特利(Hartley)等人(2009)柳叶刀(Lancet)374:1704-1713；施赖伯(Schreiber)等人(2002)儿科胃肠病学和营养杂志(J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.)，35:S11-16；米艾里-维尔加尼(Mieli-Vergani)等人(2009)免疫病理学研讨会(Semin.Immunopathol.)，31:371-381)。为了测试这些微小RNA在胆汁淤积中的功能，将阻断miR-27a或miR-182的反义寡核苷酸注射到胆汁淤积型小鼠中。胆汁淤积型小鼠具有Mdr2基因的突变，从而导致为人类疾病进行性家族性肝内胆汁淤积3型(PFIC-3)两倍的进行性胆汁淤积性疾病。与对照小鼠相比，注射有针对miR-27a或miR-182(特别是miR-27a)的反义寡核苷酸的小鼠具有较少肝损伤证据(例如，较低血清天门冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT))、较少纤维化(在组织学上并且在胶原基因表达的水平上)、以及轻微提高的总胆固醇(仍在正常范围内)。这些小鼠的基因表达谱揭示与星形细胞激活减少一致的广泛基因表达变化。

基因ID:407010和基因库登录号NR_029495提供了人miR-23a的核苷酸序列。更确切地说，基因库登录号NR_029495提供了前体序列：

1ggccggctgg ggttcctggg gatgggattt gcttcctgtc

41acaaatcaca ttgccaggga tttccaaccg acc(SEQ ID NO:1)，

其中miRNA双链体的链(位置9-30和位置45-65)已加下划线。miR-23a的成熟序列是：gggguuccuggggaugggauuu(SEQ ID NO:2)和aucacauugccagggauuucc(SEQ ID NO:3)。

基因ID:407018和基因库登录号NR_029501提供了人miR-27a的核苷酸序列。更确切地说，基因库登录号NR_029501提供了前体序列：

1 ctgaggagca gggcttagct gcttgtgagc agggtccaca

41 ccaagtcgtg ttcacagtgg ctaagttccg ccccccag(SEQ ID NO:4)，

其中miRNA双链体的链(位置10-31和位置51-71)已加下划线。miR-27a的成熟序列是：agggcuuagcugcuugugagca(SEQ ID NO:5)和uucacaguggcuaaguuccgc(SEQ ID NO:6)。

基因ID:407012和基因库登录号NR_029496提供了人miR-24-1的核苷酸序列。更确切地说，基因库登录号NR_029496提供了前体序列：

1 ctccggtgcc tactgagctg atatcagttc tcattttaca

41 cactggctca gttcagcagg aacaggag(SEQ ID NO:7)，

其中miRNA双链体的链(位置7-28和位置44-65)已加下划线。miR-24-1的成熟序列是：ugccuacugagcugauaucagu(SEQ ID NO:8)和uggcucaguucagcaggaacag(SEQ ID NO:9)。

基因ID:406959和基因库登录号NR_029615提供了人miR-183的核苷酸序列。更确切地说，基因库登录号NR_029615提供了前体序列：

1 ccgcagagtg tgactcctgt tctgtgtatg gcactggtag

41 aattcactgt gaacagtctc agtcagtgaa ttaccgaagg

81 gccataaaca gagcagagac agatccacga(SEQ ID NO:10)，

其中miRNA双链体的链(位置27-48和位置66-87)已加下划线。miR-183的成熟序列是：uauggcacugguagaauucacu(SEQ ID NO:11)和gugaauuaccgaagggccauaa(SEQ ID NO:12)。

基因ID:407053和基因库登录号NR_029512提供了人miR-96的核苷酸序列。更确切地说，基因库登录号NR_029512提供了前体序列：

1 tggccgattt tggcactagc acatttttgc ttgtgtctct

41 ccgctctgag caatcatgtg cagtgccaat atgggaaa(SEQ ID NO:13)，

其中miRNA双链体的链(位置9-31和位置52-73)已加下划线。miR-96的成熟序列是：uuuggcacuagcacauuuuugcu(SEQ ID NO:14)和aaucaugugcagugccaauaug(SEQ ID NO:15)。

基因ID:406958和基因库登录号NR_029614提供了人miR-182的核苷酸序列。更确切地说，基因库登录号NR_029614提供了前体序列：

1 gagctgcttg cctccccccg tttttggcaa tggtagaact

41 cacactggtg aggtaacagg atccggtggt tctagacttg

81 ccaactatgg ggcgaggact cagccggcac(SEQ ID NO:16)，

其中miRNA双链体的链(位置23-46和位置67-87)已加下划线。miR-182的成熟序列是：uuuggcaaugguagaacucacacu(SEQ ID NO:17)和ugguucuagacuugccaacua(SEQ ID NO:18)。

根据本发明，提供抑制(例如，减少)、预防和/或治疗肝损伤/病症/疾病的方法。在一个特定实施例中，肝损伤/病症/疾病是纤维化的(例如，纤维化肝病)。在一个特定实施例中，肝损伤/病症/疾病是胆汁淤积和/或胆汁淤积相关疾病或病症。在一个特定实施例中，该方法包括向有需要的受试者给予与miR-27a簇和/或miR-182簇特异性杂交(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多碱基对一致性(互补性))或完全互补(即，100％碱基配对(尽管允许有不同的长度))的至少一种抑制性核酸分子(例如，反义寡核苷酸)。反义寡核苷酸可以包含与成熟或前体微小RNA特异性杂交或完全互补的序列。在一个特定实施例中，反义寡核苷酸包含与主要微小RNA产物而非随从链特异性杂交或完全互补的序列(例如，反义寡核苷酸可靶向miR-27a的5'-uucacaguggcuaaguuccgc(SEQ ID NO:6)或miR-182的5'-uuuggcaaugguagaacucacacu(SEQ ID NO:17))。在一个特定实施例中，反义寡核苷酸与miR-27a和/或miR-182特异性杂交或完全互补。在一个特定实施例中，该方法包括向有需要的受试者给予miR-27a和miR-182各自的至少一种反义寡核苷酸。

通过本发明的方法治疗胆汁淤积性肝损伤具有针对与胆汁淤积性肝相关联的多种病状、疾病或病症的广泛应用。实际上，胆汁淤积性肝是多种疾病和/或病症的症状和/或指征。与胆汁淤积相关联的疾病或病症包括但不限于，胆道闭锁、囊性纤维化、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、病毒性肝炎、胆汁淤积性肝炎(胆小管性肝炎)、阿拉吉欧综合症(Alagille syndrome)、PFIC1-3、以及类似疾病。本发明的方法可以进一步包括给予用于治疗胆汁淤积和/或与胆汁淤积相关联的疾病或病症的至少一种其他药剂、治疗剂或药物。例如，熊去氧胆酸可以共同递送以用于治疗原发性胆汁性肝硬化。

本发明的反义寡核苷酸可以直接给予或者以递送媒介物给予。在一个特定实施例中，反义寡核苷酸以表达载体(例如，质粒或病毒载体)递送。换言之，本发明的反义寡核苷酸可以是在表达载体内编码的。表达载体允许核酸构建体内编码的序列表达和/或允许该构建体的细胞内递送。表达载体的启动子可以特别适合于表达(短)RNA分子。此类启动子的实例包括但不限于，RNA聚合酶II启动子、T7RNA聚合酶启动子、以及RNA聚合酶III启动子(例如，U6和H1)(参见，例如，麦斯林斯基(Myslinski)等人(2001)核酸研究(Nucl.Acids Res.)，29:2502-09)。在一个特定实施例中，该表达载体是一个病毒载体。该病毒载体可以是基于RNA或DNA的。病毒载体的实例包括但不限于，腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、以及痘苗病毒。在一个特定实施例中，病毒载体能够转导所希望的细胞类型(例如，肝细胞)。在一个特定实施例中，病毒载体是腺相关病毒载体(例如，AAV 2/8)。AAV载体可以用于在体内抑制肝miRNA(科塔(Kota)等人(2009)细胞(Cell)137:1005-17；谢(Xie)等人(2012)自然方法(Nat.Methods)9:403-9)。例如，AAV 2/8假型重组病毒载体可以用于将反义寡核苷酸递送到肝脏。自身互补的AAV(scAAV)构建体也可以用于以高效率驱动体内肝细胞中的表达(科塔等人(2009)细胞137:1005-17)。腺相关病毒载体可以具有选自下组的血清型：该组由以下各项组成：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、以及其杂交体(例如，2、3、4、5或更多种血清型的组合杂交体)。腺相关病毒载体可以是具有来自不同AAV的衣壳蛋白(例如，AAV血清型1-12中任一种)和基因组(例如，AAV血清型2)的杂交体AAV载体。在一个特定实施例中，腺相关病毒载体是AAV2/8。合成和制备腺相关病毒载体的方法是本领域已熟知的。其他递送媒介物包括但不限于脂质基媒介物(例如，脂质体)和生物可降解聚合物微球。

如上文所述的，本发明的反义寡核苷酸与一种或多种靶miRNA(成熟或前体形式)特异性杂交或完全互补。反义寡核苷酸可以是RNA或DNA。反义寡核苷酸可以是单链或双链的，特别是单链的(尽管单链寡核苷酸可以形成双链结构诸如发夹结构)。反义寡核苷酸的长度将典型地是从约10至约100个核苷酸，更典型地是从约10个至约50个核苷酸、约10个至约30个核苷酸或约15个至约25个核苷酸。在一个特定实施例中，反义寡核苷酸的长度是至少15个核苷酸。反义寡核苷酸可以与一种或多种靶miRNA、特别是上文所列出的序列(例如，SEQ ID NO:1-18中的任一项)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％互补性。反义寡核苷酸可以与和一种或多种靶miRNA互补的序列、特别是上文所列出的序列(例如，SEQ ID NO:1-18中的任一项)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或100％一致性。反义寡核苷酸可以包含与靶miRNA具有互补性的序列的5’或3’的另外的核苷酸。例如，反义寡核苷酸可以包含与该靶标具有互补性的区域的5’或3’的至少1、2、3、4、5、或多至10或20个核苷酸。另外的核苷酸可以彼此具有互补性(例如，具有同源性的区域)以形成发夹结构。

反义寡核苷酸可以包含至少一种核苷酸类似物。核苷酸类似物可以用于例如增加细胞和生物体中的退火亲和力、特异性、生物利用度、细胞和/或核转运、稳定性、和/或对降解的耐受性。核苷酸类似物包括但不限于，具有磷酸酯修饰的核苷酸(例如，包含一种或多种硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸二酯、磷酸甲酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、焦磷酰胺(phosphoroaridate)、吗啉代、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰胺酯、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、甲缩醛(formacetal)、硫代甲缩醛、和/或烷基甲硅烷基取代的那些核苷酸(参见，例如，汉泽克尔(Hunziker)和列乌曼(Leumann)(1995)在现代合成方法中的核酸类似物：合成和性质(Nucleic Acid Analogues:Synthesis and Properties,in Modern Synthetic Methods)，VCH，331-417；梅斯马克(Mesmaeker)等人(1994)在反义研究的碳水化合物修饰中的寡核苷酸新主链置换(Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides,in Carbohydrate Modifications in Antisense Research)，ACS，24-39))；具有修饰的糖或糖修饰的核苷酸，诸如2'-O-甲基(2'-O-甲基核苷酸)、2’-氟、2′-α-氟和2'-O-甲氧基乙氧基；以及核苷酸模拟物，诸如而不限于，肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、环己烯基核酸、失水己糖醇核酸、乙二醇核酸、苏阿糖核酸、以及锁核酸(LNA)。核苷酸类似物描述于美国专利申请公开号2005/0118605和美国专利号5,886,165；6,140,482；5,693,773；5,856,462；5,973,136；5,929,226；6,194,598；6,172,209；6,175,004；6,166,197；6,166,188；6,160,152；6,160,109；6,153,737；6,147,200；6,146,829；6,127,533；以及6,124,445。在一个特定实施例中，反义寡核苷酸包含选自下组的至少一种修饰，该组由2′-O-甲氧基乙基、2′-氟、2′-α-氟、以及硫代磷酸酯主链组成。

在一个特定实施例中，反义寡核苷酸是antagomir、tough decoy(TuD)、或海绵体(sponge)。antagomir包含单一miRNA靶标(即，它与miRNA互补)。miRNA海绵体包含串联排列的两个或更多个miRNA靶序列(描述于埃伯特(Ebert)等人，RNA(2010)16:2043-2050；该文献通过引用结合在此)。miRNA海绵体可以包含miRNA靶序列中心的凸起(即，可以是凸起的海绵体)。TuD是序列中与感兴趣的成熟miRNA互补的凸起发夹RNA，它在中心具有防止TuD转录物切割的错配区域(例如，4个或更多个核苷酸区域(例如，约4个至约50个核苷酸，特别是约4个至约10、15或20个核苷酸)(埃伯特等人(2010)当代生物学(Current Biol.)，20:R858-61；原口(Haraguchi)等人(2009)核酸研究，37:e43；巴克(Bak)等人(2013)RNA 19:280-293；该文献通过引用结合在此)。TuD包含两个miRNA靶序列周围的同源性区域(例如，至少约5个核苷酸)，由此生成暴露成熟形式的两个miRNA靶序列的内部凸起。TuD还可以串联布置来安排和表达。

根据本发明，提供了检测肝损伤(例如，胆汁淤积)的存在或者发展肝损伤(例如，胆汁淤积)的危险增加的方法。在一个特定实施例中，该方法包括检测miR-27a簇和/或miR-182簇，特别是miR-27a和/或miR-182在从受试者中获得的生物样品中的存在和/或表达。miR-27a和/或miR-182的量与健康样品(例如，来自未患有胆汁淤积的患者的生物样品)相比有所增加指示了胆汁淤积的存在或发展胆汁淤积的危险增加。在一个特定实施例中，该方法进一步包括从受试者中获得生物样品。在一个特定实施例中，微小RNA的检测允许对胆汁淤积进行分类、诊断和/或预后(例如，表达增加较大与胆汁淤积的严重性或危险增加相关)。本发明的方法可以包括检测微小RNA的成熟和/或前体形式。

用于检测微小RNA的任何方法可以用于本发明。例如，可以使用原位方法和/或体外方法。可以使用的检测方法的实例包括但不限于，使生物样品的核酸分子(任选分离)与探针接触、原位杂交、微阵列(例如，探针的微阵列)分析、亲和力基质、RNA印迹分析、以及PCR(例如，RT-PCR、实时定量RT-PCR等等)。因为RNA对降解敏感，所以生物样品的核酸可以在分析之前转化成DNA(例如，通过逆转录)。在一个特定实施例中，该检测方法包括使用与成熟或前体微小RNA特异性杂交(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更大碱基对一致性)或完全互补(即，100％碱基配对(尽管允许有不同的长度))的至少一种探针或引物。

本发明还包括含有1)如在此所述的至少一种反义寡核苷酸和2)至少一种药学上可接受的载体的组合物。反义寡核苷酸可以是在表达载体内编码的。在一个特定实施例中，该组合物包含miR-27a和miR-182各自的至少一种反义寡核苷酸。此类组合物可以治疗有效量给予有需要的患者以治疗胆汁淤积。这些组合物可以进一步包含用于治疗胆汁淤积和/或与胆汁淤积相关联的疾病或病症的至少一种其他药剂。可替代地，用于治疗胆汁淤积或相关疾病或病症的其他药剂可以被包含在具有用于依次给药和/或同时给药的至少一种药学上可接受的载体的单独组合物内。本发明的一种或多种组合物可以被包含在一个试剂盒内。

本发明的组合物可以是通过任何适合的路径给予，例如通过注射(例如，用于局部给予(包括直接注射到肾脏或在肾脏内注射)或全身性给予)、经口、经肺、局部、经鼻或其他给药模式。该组合物可以是通过任何适合的方式给予，包括胃肠外、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、局部、吸入、经皮肤、肺内、动脉内(intraareterial)、直肠内、肌内、以及鼻内给药。在一个特定实施例中，该组合物静脉内给予或直接给予至肝脏。总的来说，该组合物的药学上可接受的载体选自下组，该组由稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体组成。这些组合物可以包含不同缓冲液内容物(例如，Tris HCl、乙酸酯、磷酸酯)、pH和离子强度的稀释剂；以及添加剂，诸如洗涤剂和增溶剂(例如，80、聚山梨酯80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇)以及増量物质(例如，乳糖、甘露醇)。这些组合物还可以结合到聚合化合物的微粒制剂中，这些化合物诸如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚丙交酯/乙交酯共聚物、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚乳酸、聚乙醇酸等等，或者结合到脂质体中。此类组合物可以影响本发明的药物组合物的组分的物理状态、稳定性、体内释放速率、以及体内清除速率(参见，例如，雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，宾夕法尼亚州的费城(Philadelphia,PA.)，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins))。本发明的药物组合物可以例如液体形式制备或者可以呈干燥粉末形式(例如，冻干以用于随后的重构)。

如在此所用的，“药学上可接受的载体”包括可适用于药物制剂希望的给药路径(如上述段落所列举的)的任何和所有的溶剂、分散介质以及类似物。用于药理学上有活性的物质的此类介质的用途是本领域中已知的。除非任何常规介质或试剂与有待给予的分子不相容，否则预期其在治疗性组合物中的用途。

本发明的分子适用于给予特定患者的剂量和给药方案可以是通过医师考虑患者的年龄、性别、体重、一般医学症状、以及正在给予的抑制剂所针对的特定病状及其严重性来确定。医师还可以考虑给药路径、药物载体、以及分子的生物活性。

适合的药物制剂的选择取决于所选择的给药方法。例如，本发明的分子可以是通过直接注射到肾脏组织或者注射到肾脏周围的区域来给予的。在此情况下，药物制剂包含分散在与肾脏组织相容的介质中的分子。

本发明的分子还可以是通过静脉内注射到血流中或者通过皮下、肌内、鞘内或腹腔注射来胃肠外给予。用于肠胃外注射的药物制剂是本领域已知的。如果肠胃外注射被选择为一种给予这些分子的方法，则应采取步骤来确保足够量的分子达到其靶细胞以发挥生物效应。可能必须增加分子或其中递送这些分子的药物制剂的亲脂性，以使得这些分子可以达到其靶位置。用于增加分子亲脂性的方法是本领域已知的。

含有本发明的化合物作为与药物载体紧密混合的活性成分的药物组合物可以根据常规药物混合技术来制备。该载体可以根据给药所希望的制剂形式来采取各种各样的形式，该给药例如是静脉内、经口、局部或肠胃外的。在制备口服剂型的分子时，可以采用任何常见药物介质，例如像，在口服液体制剂(例如像，混悬剂、酏剂和溶液)的情况下为水、二醇类、油类、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂、以及类似物；或者在口服固体制剂(例如像，散剂、胶囊和片剂)的情况下的载体，诸如淀粉、糖、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、以及类似物。由于便于给药，片剂和胶囊代表最有利的口服单位剂型，在此情况下明显采用固体药物载体。希望的话，片剂可以是通过标准技术被糖包衣或肠溶包衣。对于肠胃外，该载体通常将包括无菌水，尽管也可以包括例如有助于溶解或出于防腐目的的其他成分。还可以制备可注射悬浮液，在此情况下，可以利用适当的液体载体、悬浮剂等。

为方便给药和统一剂量，可以将本发明的药物制剂配制成单位剂型。如在此所用的单位剂型是指适于正在进行治疗的患者的药物制剂的物理离散单位。每个剂量应含有经计算产生与所选药用载体相关的所希望的效果的活性成分的量。用于确定适当剂量单位的程序是本领域的技术人员熟知的。剂量单位可以基于患者体重来按比例增加或减小。用于缓解特定病理学病状的适当浓度可以是通过如本领域已知的剂量浓度曲线计算来确定。用于给予本发明的分子的适当剂量单位可以是通过评价这些分子在动物模型中的毒性来确定。不同浓度的药物制剂可以给予患有胆汁淤积的动物，并且最小剂量和最大剂量可以是基于胆汁淤积显著减少和由于治疗产生的副作用的结果来确定。适当剂量单位还可以通过评定治疗与其他标准疗法的组合的功效来确定。这些分子的剂量单位可以根据症状和疾病的显著减少来单独确定或者与各疗法组合来确定。

含有本发明的分子的药物制剂可以适当间隔来给予，例如每天至少两次或更多次直到病理学症状减少或缓解，之后可以将剂量减少至维持水平。在特定情况下，适当间隔通常取决于患者的病状。

定义

提供以下定义以帮助理解本发明：

单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。

“药学上可接受的”表示由联邦或州政府的管理机构批准的、或在美国药典或其他一般公知的药典中列出的用于动物并且更具体地说人的。

“载体”是指与本发明的活性剂一起给予的例如稀释剂、佐剂、防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、增溶剂(例如，80、聚山梨酯80)、乳化剂、缓冲剂(例如，Tris HCl、乙酸酯、磷酸酯)、抗微生物剂、増量物质(例如，乳糖、甘露醇)、赋形剂、助剂或媒介物。药学上可接受的载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油。水或盐水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液优选地被用作具体地用于可注射溶液的载体。适合的药物载体描述于雷明顿：药学科学与实践，(利平科特，威廉斯·威尔金斯出版公司)；利伯曼(Liberman)等人编辑，药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)，马塞尔·德克尔公司(Marcel Decker)，纽约州纽约市(New York,N.Y.)；以及罗维(Rowe)等人编辑，药物赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，Pharmaceutical Pr。

如在此所用的术语“治疗”是指赋予罹患疾病的患者益处的任何类型的治疗，包括患者病状的改善(例如，在一种或多种症状中)、病状进展的延迟等等。

如在此所用的，术语“预防”是指预防性治疗处于发展病状(例如，胆汁淤积)的危险中的受试者，致使受试者发展病状的可能性减小。

如在此所用的，“生物样品”是指从受试者，优选地是人受试者中获得的生物材料样品，包括组织、组织样品、细胞样品、肿瘤样品、以及生物流体(例如，血液、尿或羊水)。

如在此所用的，“诊断”是指检测并鉴定受试者中的疾病或病症。该术语还包括评定或评价已知患有疾病或病症的患者中的疾病或病症状态(进展、消退、稳定、对治疗反应、等等)。

如在此所用的，术语“预后”是指提供关于疾病或病症的存在(例如，如通过本发明的诊断方法确定的)对受试者未来健康(例如，预期的发病或死亡、罹患胆汁淤积的可能性或胆汁淤积的危险)的影响的信息。换言之，术语“预后”是指提供可能的疾病/病症的病程和结果或从疾病/病症恢复的可能性的预测。

化合物或药物组合物的“治疗有效量”是指有效于预防、抑制或治疗特定病症或疾病和/或其症状的量。

如在此所用的，术语“受试者”是指动物，具体地是哺乳动物，具体地是人。

如在此所用的，术语“胆汁淤积”是指其中胆汁从肝脏到十二指肠的流动被阻断或减小/抑制的任何病状。胆汁淤积可以是肝内(即，发生在肝脏内)或肝外(即，发生在肝脏外)。胆汁流动故障可能发生在肝和胆汁系统中的任何位置。

如在此所用，术语“微小RNA”、“miR”和“miRNA”可以是指未加工(例如，前体)或加工(例如，成熟)的微小RNA，除非另外指明。微小RNA(miRNA)是典型地通过与其靶mRNA碱基配对来用作基因表达的转录后调节剂的一类短内源性RNA。通常，成熟miRNA是通过RNA酶III核糖核酸酶由较长发夹转录物(前体miRNA)依次加工(李(Lee)等人(2003)自然(Nature)425:415-419；哈特瓦格纳(Hutvagner)等人(2001)科学293:834-838；克丁(Ketting)等人(2001)基因发育(Genes Dev.)，15:2654-2659)。未加工或前体微小RNA典型地包含具有约70个至约100个核苷酸长度的RNA寡核苷酸。微小RNA前体可以是通过用RNA酶(例如，Dicer、RNA酶III等等)消化成活性(成熟)微小RNA来加工。成熟微小RNA典型地是具有约17个至约25个核苷酸的RNA寡核苷酸。成熟的微小RNA可以是通过天然加工路径(例如，使用完整细胞或细胞裂解物)或者通过合成加工路径(例如，使用分离加工酶)由该前体来获得。成熟微小RNA还可以是通过生物合成或化学合成来直接产生(即，不必由前体加工)。微小RNA可以是单链或双链的，但典型地是单链的。

如在此所用的术语“探针”是指能够与和该探针具有序列互补性的核酸退火或者特异性杂交的寡核苷酸、多核苷酸或核酸(RNA或DNA)，无论是在纯化的限制性酶消化中天然存在或合成地产生。探针可以是单链或双链的。探针的精确长度将取决于许多因素，包括温度、探针来源和方法的使用。例如，对于诊断性应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸探针典型地含有约10-500、约10-250、约10-100、约10-50、约15-30、约15-25或约10-20个核苷酸。在此的探针可以被选择为与特定靶核酸序列的不同链互补。这意味着这些探针必须足够互补以便能够在一组预定的条件下与其对应靶链“特异性杂交”或退火。因此，探针序列不需要反映靶标的精确互补序列，尽管它们可以。例如，非互补核苷酸片段可以连接至探针的5’或3’端，其中探针序列的其余部分与靶链互补。可替代地，非互补碱基或较长序列可以分散到探针中，其条件是该探针序列与和它特异性退火的靶核酸序列具有足够的互补性。探针可以是加标签或标记的(即，连接至一个实体使其可以鉴定它所缔合的化合物(例如，荧光素或放射性标签))。

如在此所用的术语“引物”是指当置于适当环境中时能够功能性地用作模板依赖性核酸合成的引发物的来源于生物系统、通过限制性酶消化生成或合成产生的单链或双链寡核苷酸(RNA或DNA)。当与适当核酸模板、核酸的适当三磷酸核苷前体、聚合酶、适合的辅因子以及诸如适当温度和pH的条件一起提供时，该引物可以在其3'端通过经由聚合酶或类似活性的作用添加核苷酸来延长，以产生引物延长产物。该引物的长度可以根据特定条件和应用要求而改变。例如，在诊断性应用中，寡核苷酸引物的长度典型地是约10-25或更多个核苷酸，但可以显著更长。该引物必须与所希望的模板具有足够的互补性，以引发所希望的延长产物的合成，即能够以足以在适当并排位置提供引物的3'羟基部分的方式与希望的模板链退火，以用于通过聚合酶或类似酶开始合成。不需要引物序列表示所希望的模板的精确互补。例如，非互补核苷酸序列可以连接至另一互补引物的5’端。可替代地，非互补碱基可以分散在寡核苷酸引物序列内，其条件是该引物序列与所希望的模板链具有足够的互补性，以功能性地提供用于合成延长产物的模板-引物复合物。

聚合酶链反应(PCR)已描述于美国专利4,683,195、4,800,195和4,965,188，这些专利的完整披露内容通过引用结合在此。

关于单链核酸，特别是寡核苷酸，术语“特异性杂交”是指足够互补序列的两个单链核苷酸分子之间允许在本领域通常使用的预定条件下进行此类杂交的缔合(有时称为“基本上互补”)。具体地说，该术语是指寡核苷酸与本发明的单链DNA分子内含有的基本上互补序列的杂交，至基本上排除了寡核苷酸与非互补序列的单链核酸的杂交。使具有不同互补性的单链核酸分子能够特定杂交的适当条件是本领域已熟知的。

例如，用于计算实现特定序列同源性的核酸分子之间的杂交所需要的严格条件的一种常用公式列出如下(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))：

Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.63(甲酰胺％)-600/双链体中的#bp

如以上公式所示，使用[Na+]＝[0.368]+50％甲酰胺，在42％的GC含量和200个碱基的平均探针尺寸的情况下，Tm是57℃。DNA双链体的Tm随着同源性每减小1％就减小1℃-1.5℃。因此，使用42℃的杂交温度可以观察到具有大于约75％序列一致性的靶标。

杂交和洗涤的严格性主要取决于溶液的盐浓度和温度。总的来说，为使探针与其靶标的退火速率最大化，该杂交通常在盐和低于计算的杂交体Tm20℃-25℃的温度条件下进行。对于探针与靶标的一致性程度，洗涤条件应尽可能严格。总的来说，洗涤条件被选择为低于杂交体Tm约12℃-20℃。关于本发明的核酸，中等严格杂交被定义为在6X SSC、5X登哈特氏(Denhardt's)溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中在42℃下杂交并且在2X SSC和0.5％SDS中在55℃下洗涤15分钟。高严格杂交被定义为在6X SSC、5X登哈特氏溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中在42℃下杂交并且在1X SSC和0.5％SDS中在65℃下洗涤15分钟。极高严格杂交被定义为在6X SSC、5X登哈特氏溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中在42℃下杂交并且在0.1X SSC和0.5％SDS中在65℃下洗涤15分钟。

如在此所用的术语“多个启动子”或“单个启动子”可以是指位于编码重组产物(核酸分子或蛋白质)的DNA序列附近的DNA序列。启动子优选地可操作地连接至相邻DNA序列。与启动子不存在时表达的重组产物的量相比，启动子典型地增加由DNA序列表达的重组产物的量。来自一种生物体的启动子可以用于增强来源于另一种生物体的DNA序列的重组产物表达。另外，一个启动子元件可以增加针对串联连接的多个DNA序列表达的重组产物的量。因此，一个启动子元件可以增强一种或多种重组产物的表达。多个启动子元件是本领域的普通技术人员所熟知的。

如在此所用的术语“多个增强子”或“单个增强子”可以是指位于编码重组产物的DNA序列附近的DNA序列。增强子元件典型地位于启动子元件上游或者可以位于编码DNA序列(例如，转录或翻译成一种或多种重组产物的DNA序列)的下游或之内。因此，增强子元件可以位于编码重组产物的DNA序列的上游或下游的100碱基对、200碱基对或300碱基对或更多碱基对。增强子元件可以使由DNA序列表达的重组产物的量增加超过由启动子元件提供的增加的表达。多个增强子元件是本领域的普通技术人员容易获得的。

“复制子”是能够在其自身的控制下极大地复制的任何遗传元件，例如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或病毒。复制子可以是RNA或DNA并且可以是单链或双链的。

“载体”是可以连接至另一种遗传序列或元件(DNA或RNA)以便引起连接的序列或元件复制的复制子，诸如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或病毒。

“表达操纵子”是指可以具有转录和/或翻译控制序列诸如启动子、增强子、翻译起始信号(例如，ATG或AUG密码子)、聚腺苷酸化信号、终止子、以及类似序列并且促进多肽编码序列在宿主细胞或生物体内表达的核酸区段。

如在此所用的术语“寡核苷酸”是指本发明的序列、引物和探针并且被定义为包含两个或更多个核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸、优选超过三个的核酸分子。寡核苷酸的精确大小将取决于不同因素并且取决于寡核苷酸的特定应用和用途。

以下实例提供实践本发明的说明性方法，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。

实例

为测试胆汁淤积诱导肝miRNA水平变化的假设，在胆汁淤积的两种小鼠模型中进行肝miRNA的大规模作图：

1)胆管结扎(BDL)模型：其中胆汁淤积通过物理阻塞(经由结扎线)常见导管来诱导的手术模型。

2)Mdr2^-/-遗传小鼠模型：此模型直接类似于儿科学肝病症进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC3)。Mdr2(在小鼠中的MDR3)编码了将保护性磷脂运输到胆小管中的磷脂翻转酶。在Mdr2缺陷中，胆汁中的较低磷脂水平导致阻塞性胆汁淤积和进行性胆管病(雅克曼，E.(Jacquemin,E.)(2001)肝病研讨会，21:551-62)。

图1示出miR-182和miR-27a miRNA簇在BDL和Mdr2^-/-小鼠肝脏中显著上调。值得注意的是，来自两种簇的miRNA在人胆汁淤积性临床样品(患有胆道闭锁的儿童)中相对于年龄匹配非胆汁淤积性对照也有所提高(图1)。提高程度在小鼠和人类二者中是类似的：miR-27a簇成员增加～2.5倍并且miR-182增加～10倍。值得注意的是，miR-27a簇miRNA在肝脏中比miR-182簇miRNA更丰富。另外，确定miR-27a-而不是miR-27b-在Mdr2^-/-小鼠中与野生型小鼠相比显著更丰富。

实验还表明胆汁淤积性肝中这些miRNA的诱导是因为胆汁酸提高。实际上，两种簇的表达均在暴露于胆酸或鹅去氧胆酸的HepG2细胞中诱导。

MiRNA是基因表达的阴性调节物，并且各自可以降低数百种基因的表达。在此观察到的miRNA诱导可以是对胆汁淤积的生理自适应反应的一部分。可替代地，这些miRNA的提高可以是适应不良的并且可以促成疾病进展。为区分这些替代情况，在雄性Mdr2^-/-小鼠中单独地抑制miR-27a和miR182。在8、9、10和11周龄时向小鼠腹膜内注射20mg/kg对照反义寡核苷酸(ASOctrl)、miR-27a的反义寡核苷酸(ASO27)或者反义寡核苷酸miR182(ASO182)。在第12周收集肝组织、肝RNA和血清。血清生物化学揭示了当在体内抑制miR-27a或miR-182b时天门冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)二者的水平降低，如肝质量和肝重体重比率一样(图2)。肝结节和纤维化减少(图3)并且这是由ASO27中的Col4a1基因表达和肝羟脯氨酸相对于对照的2倍减少来支持的。用ASO182处理具有中度效应。未检测到各组之间血清总胆汁酸浓度的显著差异，但是循环胆汁酸池的组成可能存在显著差异，这可能促成纤维化程度的差异(例如，由于疏水性的变化)。

为进一步证实此疗法的有效性，在8、9、10和11周龄向Mdr2突变体雄性小鼠腹膜内注射PBS(0)或含有2、5或10mg/kg ASO27的PBS(每个处理组n＝8)。在12周龄，根据IACUC方案使小鼠安乐死，并且收集肝组织、肝RNA和血清。肝损伤的常用血清指示物(乳酸脱氢酶(LDH)；天冬氨酸转氨酶(AST)；以及丙氨酸转氨酶(ALT))和胆汁淤积的常用血清指示物(总胆红素)显示随着ASO27剂量增加的线性、剂量依赖性减小。这些结果表明肝损伤和胆汁淤积均通过抑制miR-27a簇来改善。

这些结果表明miRNA操纵表示一种用于胆汁淤积性肝病的治疗性干预的新途径。

虽然本发明的某些优选实施例已在上文中描述并特定举例，但是并不意味着本发明限于此类实施例。可以在不偏离如由所附权利要求书列出的本发明的范围和精神的情况下对本发明做出不同修改。