一种鲤鱼肝损伤模型及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种用于筛选保肝药物的鲤鱼肝损伤模型及其应用，本发明通过2，3，7，8-四氯二苯-对-二恶英对鲤鱼肝组织切片进行处理，建立鲤鱼肝损伤模型，再用检测药物处理肝损伤模型，判断药物对鲤鱼肝损伤的治疗效果。本发明所建立的鲤鱼肝损伤模型来源一致、培养环境可控、可重复性强，可满足多种药物的同批次筛选，周期短、大大节约药物筛选所需时间和成本。
【专利说明】一种鲤鱼肝损伤模型及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药【技术领域】，具体涉及一种鲤鱼肝损伤模型，及将该模型应用于筛选保肝药物。
【背景技术】
[0002]2，3，7，8_四氯二苯-对-二恶英CTCDD)是一种毒性很强的化合物，主要来源于工业垃圾以及农药滥用等，它不仅给水产和畜牧业带来巨大的经济损失，对生态平衡和人类健康也构成严重的威胁，研究二恶英的毒性机制已经成为当前科学研究热点之一，但是目前关于二噁英的毒性机制研究方面相关报道还比少。T⑶D是一种对鱼产生负效应的稳定持久环境污染物，鱼对水污染特别敏感，鱼组织吸收了污染物会影响其许多生理和生化作用。通常情况下，TCDD是在肝中进行生物转化，所以肝是TCDD的主要储存部位和靶器官。
[0003]精密肝切片技术是一种新兴的技术手段，既保留了肝细胞的功能特点，又维持了组织完整性，使该系统更接近在体情况。精密肝切片培养系统在预测药物的体内代谢和毒性方面比其他体外方法如混合肝细胞培养有更多的优越性。对水产动物而言，国内外没有应用鱼类肝精密组织切片损伤模型来筛选鱼类保肝药物的报道，从而制约了鱼类保肝药物的研究和开发。将精密肝切片技术应用于新鱼药开发方面有很大研究前景，对于研究药物代谢分子机制及临床用药也具有很好的指导意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种鲤鱼肝损伤模型，该模型建立方法重复性强、可满足多种药物的同批次筛选、周期短。
[0005]一种鲤鱼肝损伤模型，由以下步骤制得:
[0006]步骤I，取鲤鱼肝组织进行肝切片；
[0007]步骤2，将步骤I所得肝切片用含浓度为0.1~0.6μ g/L的2，3，7，8_四氯二苯-对-二恶英的L-15培养基，在5% CO2、27°C条件下培养造模3~4小时；
[0008]步骤3，清洗掉2，3，7，8-四氯二苯-对-二恶英，得到鲤鱼肝切片损伤模型。
[0009]作为上述发明的进一步改进，步骤I中鲤鱼肝组织取出后置于预先以氧饱和的冰浴的L-15培养液中，用低熔点琼脂糖进行包被处理。
[0010]作为上述发明的进一步改进，步骤I中肝切片的厚度为300μπι。
[0011]作为上述发明的进一步改进，步骤2所用的L-15培养基中，3，7，8_四氯二苯-对-二恶英的浓度为0.3 μ g/L。
[0012]资料显示，TCDD对小龙奸的半数致死量为0.30 μ g/kg、对鳟鱼的半数致死量为
0.171 μ g/kg，而在鲤鱼上面未见有T⑶D半数致死量相关报道。通过试验中测定切片活力ATP发现，当T⑶D浓度达到0.6 μ g/L时，切片活力极显著下降，引起了切片重度损伤，这可能会造成切片中组织的死亡，从而对后面的给药处理的恢复效果造成严重影响，因此没有将浓度超过0.6 μ g/L。当T⑶D浓度为0.3 μ g/L时，T⑶D实验组精密肝切片培养上清液中的GPT、GOT、SOD、MDA水平和肝切片匀浆液中LDH均有极显著的升高，ATP活性出现极显著降低，精密肝切片受到了明显损伤。因此，0.3 μ g/L为造模的最佳浓度。
[0013]上述鲤鱼肝损伤模型在筛选鱼类保肝药物中的应用。
[0014]本发明与现有技术相比，其显著优点在于:第一，来源一致、培养环境可控，因此可重复性强；第二，切片数量可根据需要进行分离，可满足多种药物的同批次筛选，可比性强；第三，周期短，可大大节约药物筛选所需时间和成本。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
[0016]鲤鱼肝损伤模型的建立
[0017]选取重量为900g左右实验鲤鱼用100mg/L的MS-222进行麻醉，然后将麻醉好的鲤鱼放入超净工作台无菌条件下取肝脏，置于预先以氧饱和的冰浴的L-15培养液中，选取约4mmX 4mm肝组织块用低熔点琼脂糖进行包被处理，将包被好的肝组织块放入含L-15培养液的切片机标本槽中进行切片，切片厚度为300 μ m，持续通氧。切片完成后，选取完整切片置于含ImL L-15培养基(含10%新生小牛血清、2.5 μ g/mL两性霉素、0.lmg/mL链霉素、100IU/mL青霉素，ρΗ7.0)的12孔板中，6片/孔，放入5% C02、27°C培养箱中振荡培养。
[0018]将所得肝切片换用含T⑶D浓度为0、0.1,0.2,0.3,0.6 μ g/L的L_15培养基，在5% C02、27°C培养箱中振荡培养，培养3h后留取上清培养基，并收集精密肝切片(用无菌镊子夹取肝组织切片)制备组织匀浆(将取出的肝组织切片用PBS冲洗2遍，对精密肝切片进行称重，称重结束后加入0.9%生理盐水进行研磨，肝组织与生理盐水比例为1:9，制成10%的组织匀浆，3000r/min离心10min，留取上清液)，分别测定组织匀浆中乳酸脱氢酶(LDH)、三磷酸腺苷(ATP)和上清培养液中谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(S0D)、丙二醛(MDA)指标。
[0019]表1不同浓度T⑶D对鲤鱼肝切片培养液中GPT、GOT、SOD和MDA影响(平均值土 S.D., η = 6)
[0020]
【权利要求】
1.一种鲤鱼肝损伤模型，其特征在于:由以下步骤制得: 步骤I，取鲤鱼肝组织进行肝切片； 步骤2，将步骤I所得肝切片用含浓度为0.1~0.6Pg/L的2，3，7，8-四氯二苯-对-二恶英的L-15培养基，在5%C02、27°C条件下培养造模3~4小时； 步骤3，清洗掉2，3，7，8-四氯二苯-对-二恶英，得到鲤鱼肝切片损伤模型。
2.根据权利要求1所述的鲤鱼肝损伤模型，其特征在于:步骤I中鲤鱼肝组织取出后置于预先以氧饱和的冰浴的L-15培养液中，用低熔点琼脂糖进行包被处理。
3.根据权利要求1所述的鲤鱼肝损伤模型，其特征在于:步骤I中肝切片的厚度为300 μ m0
4.根据权利要求1所述的鲤鱼肝损伤模型，其特征在于:步骤2所用的L-15培养基中，3,7,8-四氯二苯-对-二恶英的浓度为0.3Pg/L。
5.权利要求1-3 中任一项所述的鲤鱼肝损伤模型在筛选鱼类保肝药物中的应用。
【文档编号】C12N5/071GK103992983SQ201410245581
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】杜金梁, 殷国俊, 曹丽萍, 刘英娟, 王加豪 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心