一种用CCl₄诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法

专利名称：一种用CCl₄诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法
技术领域：
本发明涉及一种水产药物的筛选方法，具体涉及一种用四氯化碳(CCl4)诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法。
背景技术：
近年来，由于环境污染，高蛋白、高脂肪或霉变饲料的使用、抗生素和杀虫剂的滥用等因素所造成的鱼类肝胆综合症在全国许多地区频繁发生，造成了鲤、鲫、草鱼、团头鲂和青鱼等多种鱼类的大面积死亡，死亡率高达60-90%，给水产养殖业造成极大的经济损失。鱼类肝胆综合症的病因多样，但其共性都是造成鱼类肝组织损伤，进而引起代谢紊乱并引发细菌和病毒感染而造成鱼类的死亡。各种抗生素、杀虫剂和抗病毒药物都不能有效地控制鱼类肝胆综合症，该病目前还没有有效的治疗方法。哺乳动物抗肝损伤药物的筛选通常选用小鼠(或大鼠)急性肝损伤模型，其中 CCi4S导的小鼠急性肝损伤模型是最经典的实验性肝损伤模型，被广泛应用于保肝药物的研究和开发。鱼类是变温动物，药物在鱼体内与其在哺乳动物体内的代谢有所不同，因此用小鼠急性肝损伤模筛选出的保肝药物对鱼类未必适用。中国专利201010170675. 2公开了一种用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的方法，该专利虽然用水产动物斑马鱼作为模型生物，但是筛选出的抗肝损伤药物对水产养殖中鱼类肝病的预防并不适用。首先，该发明先用CCl4浸泡斑马鱼诱导肝损伤，然后将受试药物加入水中浸泡肝损伤的斑马鱼3天，因此该发明实际上是筛选肝损伤治疗药物而非预防药物，而水产动物病害的防治是以预防为主；其次，该发明给药的方式是药物浸泡3天，在生产上如果也通过浸泡的方式给药且全池使用，势必需要很大的药量，如果将池塘中的鱼集中用药浸泡长达3天，虽然可以降低用药量，但操作难度极大，极易引起鱼类缺氧死亡， 实用性不强；另外，由于斑马鱼小，长度只有3-4厘米，体重不足1克，抽血难度极大，不能通过测量血清中谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的变化来评价受试药物的抗肝损伤活性，只能检测肝勻浆中的GPT和GOT，这样就必须将斑马鱼处死，取出其很小的肝脏，制成肝勻浆，操作难度大。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对水产养殖中日趋严重的以肝损伤为主要特征的鱼类肝胆综合症，克服现有技术的不足，提供一种以肝胆综合症的主要危害对象鲤鱼为模型生物筛选预防鱼类肝损伤药物的方法。为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为一种用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，具体包括以下步骤(1)取具有相同遗传背景的鲤鱼，随机分为正常对照组、CCl4模型对照组、受试药物组，每组鱼的数量相同，饲养在循环水养殖系统中，正常对照组和CCl4模型对照组投喂鲤鱼颗粒饲料，受试药物组投喂添加了受试药物的鲤鱼颗粒饲料，日投喂量为鱼体重的3%， 连续投喂1-2月。(2)用药投喂1-2月后，按照每IOg鱼体重注射0. 05mL浓度为25-30% (ν/ν)的 CCl4植物油溶液，对CCl4模型对照组、受试药物组进行腹腔注射，正常对照组按照同样的剂量注射植物油，48-72h后，将试验鱼麻醉，每条鱼尾静脉采血，离心分离血清，检测血清中的 GPT、G0T和LDH水平，根据GPT、G0T和LDH的变化评价受试药物的保肝功效，筛选鱼类保肝药物。作为优选方案，以上所述的用CCl4S导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其中步骤(2)用CCl4造模时，其浓度为25-30%的植物油溶液。因为CCl4的浓度如果太高，会对试验鱼造成严重的毒性，导致试验鱼的死亡，从而使造模失败；如果CCl4的浓度如果太低，不足以造成对试验鱼的肝损伤，也不能得到符合要求的肝损伤模型，本发明通过对不同浓度的CCl4浓度进行筛选，以试验鱼肝功能(血清中的GPT、G0T和LDH水平)为指标，得出最佳造模所需的CCl4浓度为30%的植物油溶液。作为优选方案，以上所述的用CCl4S导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其中步骤(2)所述的造模时间为48-72小时，因为如果造模时间短，试验鱼血液中的肝功能指标没有发生变化，不符合造模要求，但是如果造模时间太长，试验鱼会出现耐受，血液中的肝功能指标会恢复，也不符合造模要求，本发明通过对不同的造模时间进行筛选，确定CCl4造模的最佳时间为72小时。作为优选方案，以上所述的用CCl4S导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其中步骤(2)所述的注射计量为每IOg鱼体重注射0.05mL 30%的CCl4植物油溶液，因为如果注射剂量太大，注射液容易溢出，且大量的植物油在试验鱼体内也会增加试验鱼的代谢负担，如果注射剂量太小，注射时的误差偏大，也会影响造模的准确性。作为优选方案，以上所述的用CCl4S导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其中步骤( 所述的检测血清中的GPT、GOT和LDH水平而不是肝勻浆中的GPT、GOT和 LDH水平。因为制备血清更方便，而且不必处死试验鱼。作为优选方案，以上所述的用CCl4S导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其中步骤( 所述的尾静脉采血量为1.5mL，因为如果采血量太多，会导致鱼的死亡，如果采血量太少，血清量不足以检测GPT、GOT和LDH三个指标。作为优选方案，以上所述的用CCl4S导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其中步骤(1)中的鲤鱼大小相近、饲养环境相同。作为优选方案，以上所述的用CCl4S导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其中步骤(1)所述的受试药物用少量植物油均勻搅拌在颗粒饲料的外表，对照组投喂的颗粒饲料用相同剂量的植物油搅拌在其表面，风干后保存于4°c。作为优选方案，以上所述的用CCl4S导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其中步骤(1)受试药物包括多种，每种受试药物设2-3个剂量梯度，每种受试药物的每个剂量对应一个受试药物组，对每一个受试药物组投喂添加了对应剂量的受试药物的鲤鱼颗粒饲料。作为优选方案，以上所述的用CCl4S导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其中步骤(1)所述的用MS222(100mg/L)麻醉后采血可有效降低应激对试验鱼血液学指标的影响，并可降低试验鱼的痛苦。作为优选方案，以上所述的用CCl4S导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其中步骤(1)所述的受试药物可为化学药品、中草药或其提取物、中草药或其提取物复方。受试药物用少量植物油均勻搅拌在颗粒饲料的外表(20克植物油/kg饲料)，通过饲喂的方式给药，操作方便，实用性强。本发明提供的CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法和现有技术相比具有以下优点本发明提供的CC14诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法的制备方法， 以生产上肝胆综合症的主要危害对象鲤鱼为模型生物，针对性强；试验鱼个体大，不仅造模成功率高，而且抽血容易，可以利用血清中肝功能指标的变化作为肝损伤和药物保肝功效的评价指标，不必制备肝勻浆，因而不必处死试验鱼，操作方便简单；通过饲喂口服给药，克服了浸泡给药的弊端，实用性强，可操作性强；通过先给药后损伤的方法筛选鱼类预防肝损伤药物，符合水产养殖病害防治以防为主的方针；可成批量进行筛选，效率高。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的物料配比、工艺条件及其结果仅用于本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1急性肝损伤造模筛选实验1、诱导鲤鱼急性肝损伤模型所用CCl4浓度的选择取50条体重150克左右的鲤鱼，随机分为对照组和不同浓度CCl4组(12. 5%、 25 %、30 %和50 % )，共5组，每组10条，饲养在循环水养殖系统5个水族箱中，每个水族箱的水量为150升。饲养2周后，用浓度为0、12. 5%、25%、30%和50% (ν/ν)的CCl4植物油溶液分别腹腔注射对照组和不同浓度CCl4组，剂量为0. 05mL/10g鱼体重。注射72小时后， 各组鱼用3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐MS222(100mg/L)麻醉，每条鱼尾静脉采血1. 5mL, 离心分离血清，用南京建成生物技术有限公司生产的试剂盒检测血清中的GPT、GOT和乳酸脱氢酶(LDH)水平。具体结果如表1所示。
表1不同浓度CCl4对鲤鱼血清GPT、GOT和LDH影响(平均值士 S. D.，样本数η = 10
或7)
CCl4植物油溶液的浓度(％)注射后死亡率(％)GPT (IU/L)GOT (IU/L)LDH对照组014.08±2.3415.40±2.203265.60± 112.6912.5018.63±3.8920.11±3.183347.38 ±152.2625059.49±6.74**43.08±4.74**3762.15±206.84**30064.37±10.16**46.36±4.35**3906.33 ±294.43**503073.09±11.93**56.54±5.76**4213.84±260.06** 与正常对照组比较，t-检验，*P < 0. 05，**P < 0.01o
5
由表1实验结果表明，当CCl4的浓度为12. 5%时，试验鱼血清中的GPT、GOT和LDH 与正常对照组没有显著差异；当CCl4的浓度为50%时，有30%的鱼注射后死亡；当CCl4的浓度为25 30%时，试验鱼血清中的GPT、G0T和LDH与正常对照组有显著差异，且没有出现死亡现象。作为最佳选择，本发明在用CCl4S导鲤鱼肝损伤模型时，选用30%的014植物油溶液。2、用CCl4诱导鲤鱼急性肝损伤模型造模时间的选择取120条体重150克左右的鲤鱼，饲养在循环水养殖系统12个水族箱中，每个水族箱水量为150升，饲养10条。随机分为对照组(6个水族箱)和浓度为30%的CCl4组 (6个水族箱)。饲养2周后，用植物油和浓度为30%的CCl4植物油溶液分别腹腔注射对照组和CCl4组，剂量为0. 05mL/10g鱼体重。注射24，48，72，96，120，144小时后，取对照组和 CCl4组鱼用MS222 (100mg/L)麻醉，每条鱼尾静脉采血1. 5mL,离心分离血清，用南京建成生物技术有限公司生产的试剂盒检测血清中的GPT、GOT和LDH水平。具体结果如表2所示。
表2CC14注射鲤鱼后不同时间对血清GPT、GOT和LDH的影响(平均值士S. D.，样本数 η = 10)
权利要求
1.一种用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于，包括(1)取具有相同遗传背景的鲤鱼，随机分为正常对照组、CCl4模型对照组、受试药物组， 每组鱼的数量相同，饲养在循环水养殖系统中，正常对照组和CCl4模型对照组投喂鲤鱼颗粒饲料，受试药物组投喂添加了受试药物的鲤鱼颗粒饲料，日投喂量为鱼体重的3%，连续投喂1-2月；(2)用药投喂1-2月后，按照每IOg鱼体重注射0.05mL浓度为25-30%的CCl4植物油溶液，对CCl4模型对照组、受试药物组进行腹腔注射，正常对照组按照同样的剂量注射植物油，48-7 后，将试验鱼麻醉，每条鱼尾静脉采血，离心分离血清，检测血清中的GPT、G0T和 LDH水平，根据GPT、GOT和LDH的变化评价受试药物的保肝功效，筛选鱼类保肝药物。
2.根据权利要求1所述的用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于，步骤(1)所述的鲤鱼大小相近、饲养环境相同。
3.根据权利要求1所述的用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于，步骤(1)所述的连续投喂1-2月可根据药物功效的不同延长或缩短。
4.根据权利要求1所述的用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于，步骤(1)所述的受试药物用少量植物油均勻搅拌在颗粒饲料的外表，对照组投喂的颗粒饲料用相同剂量的植物油搅拌在其表面，风干后保存于4°C。
5.根据权利要求1所述的用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于，步骤(2)用CCl4造模的最佳浓度为30%的植物油溶液。
6.根据权利要求1所述的用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于，步骤(2)所述的最佳造模时间为72小时。
7.根据权利要求1所述的用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于，步骤( 所述的试验鱼采血前用MS-222麻醉。
8.根据权利要求1所述的用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于，在步骤(1)中，受试药物包括多种，每种受试药物设2-3个剂量梯度，每种受试药物的每个剂量对应一个受试药物组，对每一个受试药物组投喂添加了对应剂量的受试药物的鲤鱼颗粒饲料。
9.根据权利要求1至8任一项所述的用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于，步骤(1)所述的受试药物包括中草药、其提取物或其提取物复方。
10.根据权利要求9所述的用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，其特征在于，所述受试药物包括黄芪多糖和当归提取物。
全文摘要
本发明公开了一种用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，该方法将受试药物添加到鲤鱼饲料中，口服给药1-2个月后，用优选的浓度为25-30％的CCl4植物油溶液，按每10g鱼体重注射0.05mL的剂量，腹腔注射，48-72小时后，用血清GPT、GOT和LDH活性的变化来评价不同受试药物的保肝活性。本发明以生产上肝胆综合症的主要危害对象鲤鱼为模型生物，针对性强；口服给药，方便实用；通过血液肝功能指标变化评价受试药物的保肝活性，不必处死试验鱼，可操作性强。实验结果表明，本发明提供的用CCl4诱导鲤鱼肝损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法，结果准确，可重复性强，成本低，应用范围广，可成批量进行筛选，效率高。
文档编号G01N33/96GK102360017SQ20111026088
公开日2012年2月22日 申请日期2011年9月5日 优先权日2011年9月5日
发明者曹丽萍, 殷国俊, 贾睿 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心