用于生产包含活益生菌的软凝胶胶囊和包含具有长有效期的活益生菌的软凝胶胶囊的改进方法与流程

发明领域本发明涉及包含益生菌的软凝胶胶囊的领域，并涉及用于生产包含益生菌的软凝胶胶囊的改进方法。
背景技术：
：对于包含益生菌的软凝胶胶囊，惯例是在制造时或有效期结束时提及益生菌的数量。在现有技术中已经描述了生产包含具有长有效期的活益生菌的软凝胶胶囊的各种尝试。如wo2012/021432中所概述的，其通过引用并入本文。wo2012/021432描述了制造含有微胶囊化益生菌的软凝胶胶囊的方法，该胶囊在室温下可稳定至少24个月。该解决方案是为益生菌提供至少一种包衣，所述包衣包含至少一种熔点在35℃与75℃之间的植物脂质。目前可商购的产品的试验表明，通常在分析的产品中，水活度水平相对高，高于0.3。通常所应用的包装系统的水阻隔性能低，例如铝/pvc泡罩，并且在某一时间段之后与无活性的干燥剂材料组合，具有对产品中活细菌数目的有害影响。ca2675892描述了将软凝胶胶囊包装在可重复密封的容器中，在其内壁中，至少在该区域的一部分上嵌入一种吸收剂和至少一种通道形成剂。优选存在于软凝胶胶囊中的湿敏化合物的实例是维生素和益生菌培养物。ca2675892的实例仅显示维生素的数据。上述文献均未描述或指向用于生产包含活益生菌的软凝胶胶囊的方法，也未指向包含本发明的有活益生菌的软凝胶胶囊。本发明的概述本发明涉及一种用于生产和储存包含益生菌的软凝胶胶囊的方法，该方法通过优化生产过程以使生产过程中活细胞的损失最小化来改进。该方法可以通过在储存过程中小心地控制水活度以减少储存期间活细胞的损失而进一步改善，以提供在25℃下储存24个月后包含至少1种e+09活细菌的软凝胶胶囊。益生菌是活的微生物，并且这可能是最终剂型的生产和配制过程中的挑战。益生菌对温度、水分含量和制剂基质中的其他成分特别敏感。使用低填充温度，并相应地使用具有比常规低的凝胶点和熔点的明胶，确保益生菌在生产期间的存活。必须相应地调整楔温度(wedgetemperature)(用于填充和辅助密封)和涂布箱温度(用于使明胶形成适合进入模具辊的片状)。必须避免机械应力。另外，包含益生菌的软凝胶胶囊的包装应通过在储存期间小心控制水活度来优化。本领域技术人员众所周知的是，益生菌的存活可通过低的水活度来提高。然而，如果水活度太低，软凝胶胶囊将变脆和泄漏。因此，最佳水活度是益生菌的存活和完整软凝胶胶囊之间的微妙平衡。已发现，在室温下，如25℃，水活度应优选为至多0.2。发明详细描述本发明涉及用于生产包含未包衣的益生菌的软凝胶胶囊的方法，所述方法包括将未包衣的益生菌与至少一种油混合以在5至15℃的温度下获得填充材料，将填充材料包封在由明胶制成的软凝胶胶囊中，所述明胶具有在11至28℃的范围内的熔点；并在至高25℃的温度下通过一个或多个步骤干燥软凝胶胶囊至水活度至多0.25。水活度(aw)定义为在指定温度下组合物中的水的部分蒸汽压除以标准状态下在相同温度下的水的部分蒸气压。因此，水活度作为组合物中自由(即未结合)水量的量度。它可以计算为：aw＝p/p0其中p是组合物中水的部分蒸气压，并且p0是在相同温度下纯水的蒸气压。可替代地，水活度可计算为：aw＝lwxw其中lw是水的活度系数，并且xw是水的摩尔分数。上面定义aw的两个计算是等效的。水活度可以通过本领域技术人员已知的方法测量，例如通过应用罗卓尼克(rotronic)hygrolab仪器。软凝胶胶囊被定义为包围填充材料的基于软明胶的壳。术语“填充材料”是指封装在壳体内的整个材料。因此，填充材料可以例如是均匀溶液或悬浮液。软凝胶胶囊在递送膳食补充剂或药物产品中是广泛使用的。普通的软凝胶胶囊主要通过所谓的旋转模具封装方法(由罗伯特泡利谢雷尔(robertpaulischerer)发明)来生产，其中两个平的基于明胶的半固体带的壳体材料是由液体明胶溶液生产的，然后两个带在一组旋转模具(模具辊)上聚在一起，其切割明胶带，同时将两部分密封在一起。同时，在软凝胶胶囊的最终密封之前，通过填充楔精确添加适当量的液体填充材料使明胶带膨胀进入模穴。密封后，仍然太软的胶囊在在线过程中或在受控气氛的托盘上干燥，以便实现壳的最佳硬度。填充材料在所使用的生产温度下必须是液体，并且在生产条件下也是稳定的，但是填充材料的组成的灵活性大。最常见和最容易的填充材料是纯油基的，例如鱼油或油载体中的脂溶性维生素。封装的容易性和产品的稳定性将取决于任何填充材料/壳的相互作用，即水溶性物质将与溶解在软凝胶壳中的水相互作用，从而改变壳的特性。油载体中的固体悬浮液也可以掺入到软凝胶中，并且除了活性成分之外，如果认为适当，可以添加载体/悬浮剂以形成均匀的分散体，可以添加抗氧化剂以阻止油和赋形剂氧化。悬浮液中固体的粒径应该低，并且这可以通过在封装之前研磨填充材料来实现。一定量的固体，例如干燥的益生菌可以包括在填充材料中，但是为了将填充材料的粘度保持在可以产生软凝胶的水平，固体的量限制为至多约30％(w/w)的填充材料，优选10％至25％，如15％至20％。进一步增加固体的量将意味着增加填充材料的量，因此增加胶囊尺寸。这只能在一定程度上进行，否则软凝胶胶囊的尺寸对于人的吞咽来说将是不切实际地大。通常，软凝胶胶囊的重量范围在0.05g至2.0g内，优选0.5g至1.5g，例如0.7g至1.0g。最常见的软凝胶胶囊被定义为粒度(例如10椭圆形(oval)、12椭圆形等，或长方形(oblong)4、6等)。因此，为了获得包含具有长有效期的益生菌的软凝胶胶囊，必须在生产过程中确保活细菌的高存活率，并且必须通过小心地控制在生产过程和初始一个或多个干燥步骤后的存储期间的该软凝胶胶囊的水活度来维持该高量。本发明人认识到，通过使用比常规使用的温度更低的填充材料，使生产过程的实质性改进以使生产过程中益生菌的损失最小化是必要的。填充材料的制备和储存是最耗时的单元操作，因此其中益生菌最易受损。已经认识到，当使用比常规使用的低的填充温度时，在其余工艺中的工艺条件的调节也是必要的，以便适应较低的填充材料的温度。最重要的是，所使用的明胶必须适应低填充材料温度。明胶必须具有比常规使用的更低的凝胶点和更低的熔点，使得明胶通过冷填充可保持足够软。这种柔软性对于通过模具辊的最终作用来进行适当的密封是重要的；坏的密封将导致胶囊泄漏。本发明人认识到鱼明胶通常具有低于哺乳动物明胶的熔点(卡里姆(karim)和巴特(bhat)，2009)。不同的已知的鱼明胶通常具有8-25℃的凝胶点，和11-28℃的熔点。较低的值属于冷水鱼明胶，其很少具有足以用于软凝胶生产的凝胶强度。用于软凝胶生产的凝胶强度通常在150-200泊(bloom)之间(珀雅克(podczeck)和琼斯(jones)，2004)，但是基于本发明人的经验，其凝胶强度可以在100-300泊之间。猪和牛明胶的典型凝胶点范围为20-25℃，并且典型的熔点范围为28-31℃，猪明胶展示最高的凝胶和熔点。鱼明胶通常来自冷水鱼(例如鳕鱼、黑线鳕、狗鳕、青鳕、单鳍鳕、鳎目鱼、比目鱼、大菱鲆、大比目鱼、鲽鱼、圆鳍鱼、鲑鱼、梭子鱼、鳟鱼和鲑鱼)或温水鱼(例如罗非鱼、鲨鱼或鲤鱼)。它们的胶凝点和熔点不同，其中冷水鱼明胶(cwfgs)通常具有低于15℃的凝胶点，通常为4至12℃，并且具有低于22℃熔点，通常为12至19℃，而温水鱼明胶(wwfgs)通常具有高于15℃的凝胶点，通常为18至24℃，并且具有在22至32℃的范围内的熔点。就当前的目的而言，冷水鱼可以理解为主要在18℃或以下的水中生活的任何鱼类。本发明方法使用熔点在11至28℃范围内的明胶。优选地，熔点在19至27℃的范围内，甚至更优选在21至26℃的范围内，最优选在23至25℃的范围内。本发明方法优选使用具有凝胶强度在100-300范围内的鱼明胶，例如至少180、至少190，优选200-285或200-250泊。然而，如果满足上述参数的合适的牛明胶适应用于根据本发明的低温软凝胶胶囊生产方法中所必需的参数，那么它也是合适的。任选地，具有在11至28℃范围内的熔点的明胶可以是来自不同来源的明胶的混合物(例如冷水鱼明胶和温水鱼明胶的混合物、鱼明胶和牛明胶的混合物、或鱼明胶和猪明胶的混合物)，条件是整个明胶混合物保持熔点在11至28℃范围内，优选在19至27℃范围内，甚至更优选在21至26℃范围内，最优选在23至25℃范围内，和/或凝胶强度在100-300范围内，例如200-285泊。然而，使用的明胶优选基本上不含哺乳动物明胶的，即相对于总明胶重量含有不超过1％，优选0％wt。特别优选地，明胶是至少90％wt，更优选至少95％wt，特别是100％wt的鱼明胶。如上所述，冷水鱼明胶倾向于具有低或不存在的泊(bloom)值，因此不总是适合于软凝胶生产(例如由于低机械强度和/或差的热稳定性)。然而，如果还使用一定量的温水鱼明胶，则可以使用标准封装设备来制造由大量冷水鱼明胶组成的软凝胶胶囊。冷水和温水鱼明胶的合适共混物描述于wo2009/095670中，其内容通过引用并入本文。因此，例如，在本发明的方法和胶囊中，明胶可以是明胶的共混物，包括至少40wt％的冷水鱼明胶(相对于明胶的总重量)，例如20至80wt％、35至70wt％、40至65wt％或至少55wt％；或者明胶可以包含重量比为99.9:0.1至35:65，特别是65:35至40:60的冷水和温水鱼明胶；条件是整个明胶混合物保持11至28℃范围的熔点和/或100-300范围内的凝胶强度。任选地，本发明中使用的明胶可以进一步包含角叉菜胶(例如κ-角叉菜胶)，例如基于干燥固体基0.01至2％wt的明胶，尤其是0.05至1％wt，特别是0.06至0.5％wt。为了改善胶凝，也可以包括生理上可耐受的金属盐(例如钾盐，如κ-角叉菜胶的氯化钾)。通常，其在明胶中的浓度高达50mm，特别是10至30mm。适合用于本发明的胶囊和方法中的明胶当然可以按照凝胶强度和熔点来定义。因此，考虑具有上述凝胶强度和熔点的任何组合的明胶，例如熔点为11至28℃范围内且凝胶强度为100至300泊的明胶。除了明胶之外，软凝胶胶囊壳可以包含另外的成分，例如增塑剂、水、着色剂、风味剂、遮光剂和/或防腐剂，其全部为本领域技术人员已知的成分(也参见斯坦利(stanley)、jp，第二部分：软明胶胶囊(“parttwo.softgelatincapsules”)，工业药剂学的理论与实践(thetheoryandpracticeofindustrialpharmacy)，拉赫曼(lachmann)、l等人，主编：莱亚(lea)和费比格(febiger)，费城，宾夕法尼亚州，pp.398-412(1986)。增塑剂的实例包括甘油、山梨醇及其混合物。当存在时，增塑剂可以在明胶中以至多35％wt的量存在，例如，5至35％wt或15至30％wt。益生菌定义为活的微生物，当以足够的量施用时可以赋予宿主健康益处(fao/who2001)。在缺乏营养的条件下，某些细菌如芽孢杆菌和梭菌能够形成内生孢子，一种休眠的、坚韧的非生殖结构。内生孢子可以在没有营养物的情况下存活。它们耐紫外线辐射、干燥、高温、极冷冻和化学消毒剂。一些益生菌产品含有芽孢杆菌。如上所述可知，然而，本发明的方法对于孢子形成细菌在封装过程中存活不是必需的。因此，在优选的实施例中，本发明的软凝胶胶囊中使用的细菌是非产孢细菌。所述填充材料包含至少一种干燥的未包衣的非产孢益生菌。细菌可以根据本领域已知的方法干燥。这种益生菌的实例是乳球菌属、乳杆菌属、片球菌属和链球菌属，更优选至少一种选自下组，该组由以下各项组成：双歧杆菌属、短双岐杆菌、动物双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、乳酸乳球菌、乳脂链球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、高加索酸奶乳杆菌、双叉乳酸杆菌、短乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、弯曲乳酸杆菌、保加利亚乳杆菌、清酒乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、乳酸乳杆菌、戴耳布吕克氏乳杆菌、植物乳杆菌、约氏乳杆菌和嗜热链球菌。特别优选的菌株是动物双歧杆菌乳亚属乳酸双歧杆菌。例如分别作为dsm15954(由克里汉森公司(chr.hansena/s)，丹麦，作为出售的)储存；atcc27536和dsm10140的菌株；嗜酸乳杆菌，例如作为dsm13241(由克里汉森公司(chr.hansena/s)，丹麦，作为出售的)储存的菌株，鼠李糖乳杆菌，例如作为atcc53103(由克里汉森公司(chr.hansena/s)，丹麦，作为出售的)储存的菌株，副干酪乳杆菌亚属副干酪乳杆菌，例如分别作为atcc55544(由克里汉森公司(chr.hansena/s)，丹麦，作为l.casei出售的)和cctccm204012储存的菌株，罗伊氏乳杆菌，例如作为atcc55845(由克里汉森公司(chr.hansena/s)，丹麦，作为出售的)储存的菌株，鼠李糖乳杆菌，例如作为atcc55826(由克里汉森公司(chr.hansena/s)，丹麦，作为出售的)储存的菌株，副干酪乳杆菌，例如作为lmg-p-17806(由克里汉森公司(chr.hansena/s)，丹麦，作为出售的)储存的菌株，嗜热链球菌，例如作为dsm15957(由克里汉森公司(chr.hansena/s)，丹麦，作为出售的)储存的菌株和发酵乳杆菌，例如作为nm02/31074(由克里汉森公司(chr.hansena/s)，丹麦，作为出售的)储存的菌株。可以使用益生菌的几种物种或菌株的组合，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或甚至更多个上述种类和菌株。在目前优选的实施例中，在根据本发明的软凝胶胶囊中仅存在一种、两种、三种、四种或五种不同的菌株。术语“活的”是指细胞是活的并且能够在倾注平板或涂布平板期间在培养皿中形成菌落。通过在适于益生菌株生长的条件下孵育倾注平板或涂布平板，活益生菌的数目确定为菌落形成单位(cfu)的数目。通过该方法，可以计数能够生长和形成菌落的细胞。当在本说明书和权利要求中给出数字时，应理解为cfu/软凝胶胶囊，除非上下文另有说明。用于描述微粒制剂的术语有时可能不一致，并且使不熟悉该领域的读者混淆。本文中使用的术语“微粒”是指直径为1-1000μm的颗粒，不管精确的内部或外部结构如何，并且“微胶囊”的子类别适用于具有被材料包围的核的微粒，这与核的材料显著不同。核可以是固体、液体或甚至气体。微胶囊化材料具有核活性成分，被明显不同的材料包围。由于多种原因，物质可以被微胶囊化。实例可以包括保护反应性材料免受其环境影响，安全和方便地处理其它有毒或有害的材料，掩味，控制或改进释放性能的手段，处理作为固体的液体的手段，制备自由流动粉末，以及改变药物的物理性质。wo2012/021432描述了微胶囊化的益生菌，并且定义了用组合物包衣的术语“微胶囊化”。与此相一致，在本说明书和权利要求书中使用的术语“未包衣的”意指益生菌不是微胶囊化的或包衣的。包衣步骤可能导致在包衣过程中的细胞损失和与天然的，未包衣的细胞不同的释放曲线，并且还将通过向制剂中添加包衣材料导致更低浓度的益生菌。当将本发明的实例的结果与wo2012/021432中的实例的结果进行比较时显而易见的是，与wo2012/021432中所述的结果相比，即使不使用益生菌的包衣，本发明提供的益生菌在室温长期储存期间具有改善的存活率。因此，本发明中使用的细菌是未包衣的，即非微胶囊化的。赋形剂可以添加至益生菌中，例如，以获得具有标准浓度的益生菌的干混物。目前优选的实施方案在一种或多种活性成分(例如益生菌)的混合物中具有40-100％(w/w)的终浓度，例如50％、60％、70％、80％或90％，余下的部分是一种或多种赋形剂如麦芽糖糊精。为了具有高浓度的细菌并减少添加到油中的固体的量，目前优选浓度为100％的(即仅干燥的细菌)，添加过多的固体使得悬浮液太粘稠。为了制备用于填充材料的干燥细菌的悬浮液，可以添加总填充材料的1-10％(w/w)的范围内(如1.5-7.5％，例如1.5-5％(w/w))的悬浮剂，例如氢化/部分氢化的植物油、单甘油酯或其混合物、卵磷脂、蜡或二氧化硅。即使细菌以干粉形式添加，悬浮剂的使用有助于通过防止益生菌的沉降来制备均匀的填充材料。基本上所有的食用油都可以适用于本发明。所述油可以被认为是活性成分或仅为载体油，例如mct(中链甘油三酯)、大豆油或向日葵油。根据本发明使用的特别优选的油是含有ω-3脂肪酸的油，例如二十二碳六烯酸(dha)、二十碳五烯酸(epa)、鱼油和磷虾油，以及epa、dha和其它ω-3脂肪酸的组合物，以及植物油例如dha、epa、α-亚麻酸(ala)或γ亚麻酸(gla)，比如油菜籽油、琉璃苣油/月见草油、亚麻籽油、紫苏油或大蒜油。dha，epa和ala的来源包括但不限于鱼油、酵母、藻类或其它微生物或单细胞来源和植物油，主要是亚麻籽油，豆油和菜籽油。gla的来源包括但不限于月见草油/琉璃苣油。适于根据本发明使用的油还包括来自植物，海洋或哺乳动物来源的任何改造油，例如但不限于氢化油、二酰基甘油、单酰基甘油、中链甘油三酯(mct)及其组合物。至少一种油，例如一种、两种、三种、四种或更多种上述油，可以用于本发明的方法中。如上所述，本发明的方法包括将未包衣的益生菌与至少一种油混合，以在5至15℃的温度范围内获得填充材料。因此，所述油(或油混合物，其中使用两种或多种油)在5至15℃的温度下应为液体。这意味着所述油(或油混合物)应具有不超过15℃的熔点，例如，熔点在5至15℃的范围内，或优选熔点在5℃以下。除了益生菌之外，一种或多种其它活性成分，例如一种、两种、三种、四种或更多种活性成分选自下组，该组有以下各项维生素组成，例如维生素a、d、e、k2、c、b2、b6、b12、生物素，烟酸，叶酸；矿物质如锌、硒、铬、铜、钙、氯化物；植物油如菜籽油、琉璃苣油/月见草油、亚麻籽油、紫苏油、大蒜油和蔬菜提取物如蔓越莓提取物/果汁、蜂王浆可包括在软凝胶胶囊中。目前优选的组合物包括动物双歧杆菌乳亚属乳酸双歧杆菌作为唯一的活性成分，例如mct中的动物双歧杆菌乳亚属乳酸双歧杆菌。动物双歧杆菌乳亚属乳酸双歧杆菌和至少一种ω-3油，例如动物双歧杆菌乳亚属乳酸双歧杆菌和ala、动物双歧杆菌乳亚属乳酸双歧杆菌和dha、和动物双歧杆菌乳亚属乳酸双歧杆菌、dha和epa；以及与其它活性成分的组合，如动物双歧杆菌乳亚属乳酸双歧杆菌、dha、维生素b6、叶酸和维生素d3。填充材料与填充材料的封装混合到软凝胶胶囊中应在低湿度环境中进行。在本发明的上下文中，短语“低湿度环境”是指相对湿度(rh)小于50％的环境。优选地，其指相对湿度小于45％的环境。更优选地，相对湿度在10％-40％的范围内，更优选地在20-35％的范围内。可以通过本领域技术人员已知的用于降低相对湿度的任何方法达到低湿度，并且包括使用干燥的压缩空气，冷却，空气调节和用惰性气体例如氮气或氩气吹扫。用惰性气体吹扫也降低了细菌细胞和填充材料的其它组分上的氧化应激。为了确保软凝胶胶囊中的良好含量均匀性，重要的是保持细菌均匀地悬浮在油中。温和搅拌和高粘度，通过例如降低温度获得，可以有助于使细菌均匀悬浮。“温和”是指足以帮助形成均匀悬浮液而不引起导致细菌细胞壁显著破裂的机械力的搅拌。用于温和搅拌/混合的合适方法包括但不限于搅拌或循环泵送。其它方法由本领域技术人员可识别。表1总结了本发明的方法中使用的条件与本领域中通常使用的条件之间的差异。表1生产益生菌软凝胶胶囊的生产参数参数标准值益生菌生产值涂布箱温度50–68℃40–68℃楔温度28–48℃28–36℃室温18–22℃最高20℃填充温度室温或以上8–15℃降低填充材料温度需要使用较低熔点的明胶并且改变整个生产链。最重要的是，必须降低楔温度(涉及胶囊的精确填充和随后的密封)，以便具有胶囊的良好密封(不再熔化明胶)。涂布箱将确保液体明胶块在封装过程之前形成薄膜。涂布箱中的温度不会加热填充材料，并且尽管优选地较低，其温度上限可以与正常生产一样高。从表中可以看出，与常规方法的主要区别是较低的填充温度。实例1清楚地表明，重要的是将填充材料的温度从常规使用的室温降低。根据本发明的方法，填充温度应为5-15℃，优选6至14℃，最优选7至13℃。8至12℃，例如9至11℃也是可行的。该温度取决于所选择的明胶。使用较低熔点的鱼明胶确保了胶囊的密封过程仍然有效；使用较冷的填充材料和楔，该明胶必须足够软以在填充过程后得到固体密封。可以设想，涂布箱的温度可以低至40℃，以便调节到较低的室温和填充温度，优选在45-55℃的范围内。在实例中，使用的最低涂布箱温度为51℃。填充材料的任何固体组分(即干燥的益生菌和可能的赋形剂例如麦芽糖糊精)的粒径对于确保产品的均匀性和实现实际的物理过程是重要的。包含益生菌的组分的平均粒径应小于400微米，例如约150至250微米，且优选小于200微米。必须优化用于顺畅大规模生产的粒径，并且所述粒径可以通过研磨或筛分，小心地减小粒度来获得。由于益生菌是精细的活的微生物，因此，使益生菌/能量输入的应力最小化是重要的。因此，为了维持细菌的活菌计数，应尽可能避免例如研磨填充材料的固体组分的程序。根据本发明的软凝胶胶囊是坚固的，而不脆也不易碎。干燥后胶囊壳的质量通常以牛顿(壳的硬度)测量，其中9-11n的值表示不会导致胶囊泄漏的壳硬度。硬度可以通过本领域已知的方法测定，例如通过使用硬度测试仪如digitestiigelomat(由bareissgmbh制造)和其它类似的装置。在室温(25℃/60％相对湿度(rh))下，软凝胶胶囊具有约4至10％(按重量计)的水含量。如果水含量显著低于此，例如由于过度干燥的储存或干燥，这导致胶囊壳的脆化，其具有增加的胶囊壁的脆性和裂纹的形成的后果。在一个实施例中，软凝胶胶囊因此具有至少4wt％的水含量。如本领域技术人员已知的，水含量是指总水。软凝胶胶囊的总水含量(游离水+结合水，即在细胞和明胶中结合的水)将主要在壳中发现，因为疏水胶囊填充材料不会吸收水。如上所述，胶囊中的总水含量可以在4-10％的范围内，但总百分比与细菌的存活无关。由例如通过壳中的明胶的水合作用紧紧结合的水不能利用或对细菌有害，并且仅仅是需要测量自由利用的水(水活度，aw)。水活性根据定义是产品中的自由的或非化学结合的水，并且可以通过应用罗卓尼克hygrolab仪器在整个软凝胶胶囊上测量。益生菌是休眠的，并且为了保持它们在这种条件下，优选水活度不大于0.2。通常，在标准软凝胶条件下储存的软凝胶胶囊将产生具有对于益生菌保持休眠来说太高的水活度(aw)的环境。因此，需要仔细控制包含益生菌的软凝胶胶囊的干燥，以及对能够重新进入软凝胶的大气水的仔细控制。在干燥过程中，水含量，因此水活度通过干燥剂(如果存在)从壳中除去水的过程达到平衡，并且填充材料中的任何水被壳吸收。壳，填充材料和干燥剂之间的平衡确保了适当的低水活度，而没有壳变得太脆的风险。根据本发明的方法，软凝胶胶囊在一个或多个步骤中在至多25℃的温度下干燥至水活度至多为0.25。本领域技术人员已知的任何干燥方法可用于干燥包含细菌的软凝胶胶囊。在本发明的优选实施例中，胶囊首先通过在例如约18至23℃下的滚筒干燥约10至约40分钟来干燥，然后在约19至22℃，湿度15至22％，持续盘式干燥至少约1或2天至约14天，直到获得9-11n的壳硬度。作为上述方法的替代，可以使用内嵌的干燥隧道。在初始干燥过程之后，将干燥的软凝胶胶囊分类，并且丢弃未被适当填充的、具有气泡的或异常尺寸的胶囊。然后可以将经质量检查的软凝胶胶囊与本领域技术人员已知的足够量的干燥剂一起包装在最终包装中。然而，目前优选的是增加另外的干燥步骤，其中将软凝胶胶囊作为整批保持在具有足够量的干燥剂的合适的包装材料中，以便获得整个软凝胶胶囊上测量的目标水活度(aw)为0.2的进一步缓慢降低的水含量。在该阶段，将胶囊保持在至多25℃的温度下，优选在低温例如2-8℃，以便在包装到最终包装中之前使细菌的损失最小化。如上所述显示，在包装到最终包装中之前不需要达到所需的低水活度，但是在包装到最终包装中之前的适当的水活度将延长最终包装中的干燥剂的寿命，因此也将延长软凝胶胶囊的储存期限。优选地，在最终包装之前水活度应≤0.25。达到这个低的aw所需的时间可以在几天、几周到几个月的范围内，例如3个月，但只要胶囊保持在低温下，其稳定性不受影响。这种整批包装最适合的包装材料是铝箔为基础的包装材料。可以使用其它包装材料，例如hdpe聚合物或其它高水阻挡聚合物，但是然后需要增加量的干燥剂来控制水活度。合适的干燥剂包括任何合适的干燥剂，例如二氧化硅、二氧化硅基干燥剂、分子筛和沸石。在本发明的目前优选的实施例中，软凝胶胶囊在最终重新包装后(即在储存期间)干燥至水活度(aw)为至多0.2，例如0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22或0.23。通过本文所述方法获得或可获得的胶囊形成本发明的另一方面。在另一方面，本发明提供了一种软凝胶胶囊，其包含胶囊壳和填充材料，所述胶囊壳包含至少一种熔点为11至28℃范围内和/或泊值为100至300的明胶，并且所述填充材料包含分散在油中的至少一种未包衣，非孢子形成益生菌菌株，其中所述软凝胶胶囊具有至多0.25的水活度。由包含吸收剂和通道形成剂并且目前优选用于最终包装的聚合物制成的容器描述于，例如，wo97/32663、wo03/086900、wo2008/086852、ep1000873和ep1421991。它们可商购自例如凯匹特特种塑料公司(capitolspecialtyplasticsinc.)，2039麦克米兰街(mcmillanstreet)，欧本，阿拉巴马州，美国，商品名为activ-vial或萨德化工(sudchemie)，奥斯汀里德街(ostenriederstr.)15，85368莫斯堡，德国，商品名为2ap共聚物。本发明提供了一种软凝胶胶囊，其包含干燥的，未包衣的，不形成孢子的益生菌，该软凝胶胶囊在25℃储存12个月后包含至少2种e+09活细菌，更优选至少3种e+09活细菌，最优选至少4种e+09活细菌，甚至更优选至少5种e+09活细菌。在本发明的范围内的是包含干燥的，未包衣的，不形成孢子的益生菌的软凝胶胶囊，所述软凝胶胶囊在25℃储存24个月后包含至少1种e+09活细菌，优选至少2种e+09活细菌，更优选至少3种e+09活细菌，甚至更优选至少4种e+09活细菌，最优选至少5种e+09活细菌。此外，本发明提供了一种软凝胶胶囊，其包含干燥的，未包衣的，不形成孢子的益生菌，该软凝胶胶囊在25℃贮存12个月后含有至少4cfu/g，优选至少5cfu/g，更优选至少6cfu/g，甚至更优选至少7cfu/g，最优选至少8cfu/g。甚至进一步地，本发明提供了一种软凝胶胶囊，其包含干燥的，未包衣的，不形成孢子的益生菌，该软凝胶胶囊在25℃储存24个月后包含至少2cfu/g，优选至少3cfu/g，更优选至少4cfu/g，甚至更优选至少5cfu/g，最优选至少6cfu/g。从实例中提供的结果显而易见，通过本发明的方法制备的软凝胶胶囊是非常稳定的。结果显示，每个软凝胶胶囊的cfu值在储存6个月后为6.8e+09，在储存9个月后为4.0e+09，在25℃下在具有干燥剂衬里的塑料小瓶中为12个月后为5.3e+09。基于储存12个月后的cfu值，可以推断在25℃下储存24个月之后可能存在的活益生菌的数量为至少3e+09。测量软凝胶胶囊的储存稳定性的另一种方法是计算储存期间益生菌的对数损失。本发明的方法提供了储存期间的对数损失，其在25℃下储存12个月后不超过1，优选不超过0.75，更优选不超过0.50，甚至更优选不超过0.33，最优选不超过0.25。实例提供了在25℃下储存在活性塑料小瓶中的软凝胶胶囊在储存6个月后的对数损失可以计算为0.12，并且在12个月后的对数损失为0.23。从图4可以看出，随着时间的推移，精确数的一些变化最可能是由于各个软凝胶胶囊之间的益生菌分布的变化，以及由于cfu方法分析的变化，但总体结果显示根据本发明的软凝胶胶囊保持显著低的对数损失。当具有益生菌的软凝胶胶囊保持在2至8℃时，细胞损失甚至低于25℃，如图3和4所示。图3还示出了可以通过添加另外的干燥剂以控制已经在整批水平上的水活度水平来优化整批储存条件。如图4所示，与软凝胶胶囊在30℃下储存时相比，当将含有益生菌的软凝胶胶囊储存在25℃时，益生菌的存活率高得多。出人意料的是，从25℃到30℃的5℃的储存温度变化可以提供细菌存活的如此显著的差异。根据本发明的优选的储存条件是在室温下储存，例如在温度约20至约25℃，例如约22至25℃，优选约25℃，即25℃±2℃。除非在此另外指示或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在如下的权利要求的上下文中)，术语“一个/种”和“该”以及类似指称对象的使用应解释为包括单数和复数二者。除非另有说明，否则术语“包括”，“具有”，“包含”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。在此引证数值的范围仅旨在用作单独地提及每个单独的数值落在该范围内的速记的方法，除非本文另外说明，并且每个单独的数值被结合到本说明书中就像它被单独地在此引证一样。在此说明的所有方法能够以任何适当顺序进行，除非本文另外说明或另外与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的应用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。说明书中的语言不应当被解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。附图图1显示了在25℃/60％rh下储存多达18个月的试验2中生产的软凝胶胶囊的cfu值。软凝胶胶囊包装在三个不同的包装系统中。(·)铝箔+硅酸盐袋，◇吸塑卡，(●)盒+硅酸盐袋。图2显示了在8-12℃下储存多达18个月的试验2中生产的软凝胶胶囊的cfu值。软凝胶胶囊包装在三个不同的包装系统中。(·)铝箔+硅酸盐袋，◇吸塑卡，(●)盒+硅酸盐袋。图3显示了在模拟整批包装系统中包装并在5℃和25℃/60％rh下储存长达12个月的试验4中生产的软凝胶胶囊的cfu值。(·)5℃，以及(●)25℃/60％rh。图4显示了在5℃，25℃/60％rh和30℃/75％rh下储存多达12个月期间，在装有干燥剂衬里的塑料小瓶中的试验4中生产的软凝胶胶囊的cfu值。(·)5℃，(●)25℃/60％rh，以及◇30℃/75％rh。图5显示了在模拟整批包装系统中包装并在5℃和25℃/60％rh下储存长达24个月的试验4中生产的软凝胶胶囊的cfu值。(·)5℃，(●)25℃/60％rh。图6显示了在5℃，25℃/60％rh和30℃/75％rh下储存长达24个月的期间，在装有干燥剂衬里的塑料小瓶中的试验4中生产的软凝胶胶囊的cfu值。(·)5℃，(●)25℃/60％rh，以及◇30℃/75％rh。实例一般规定：所有试验批次具有65,000个胶囊的批量大小。填充材料将油和油溶性组分通过真空添加至不锈钢混合容器中。将组分在12℃下混合，并添加二氧化硅。将混合物进一步混合并均化直至二氧化硅分散。动物双歧杆菌亚属乳酸双歧杆菌通过真空添加，并将完成混合物混合(无需均化)。然后将成品填充材料通过具有0.7至1.2mm筛孔的筛子排出至预冷却(12℃)的转移罐。然后将转移罐连接到封装机。明胶溶液明胶溶液的批量大小为100kg。在装备用于加热和搅拌的不锈钢生产容器中称量明胶，甘油和水。将混合物加热，搅拌并抽真空直至达到稳定的粘度。然后将明胶过滤(150微米)到预热的不锈钢容器中。然后加入着色剂并缓慢混合直至均匀。在封装期间将明胶保持在50-68℃。干燥第一次干燥在19.0至20.3℃的旋转滚筒烘干机中进行，其中明胶带的润滑剂通过在烘干机中的清洁毛巾除去。通过将胶囊以单层铺在托盘上，并将托盘放置在14-23％rh的受控湿度和21-24℃的温度的空调橱柜中来进行最终干燥。当达到9-11n的壳硬度时，终止干燥。典型的干燥时间为31-130小时，平均为100小时。检验和包装检查和分选软凝胶胶囊以除去变形的胶囊，未适当密封和其它错误的胶囊，并且在含有益生菌的3500软凝胶胶囊的整批包装中与30g干燥剂一起包装在铝袋中并加热密封。在表2中，显示了在五个不同试验中生产的批次的组成。表2五个不同批次生产的组成*氧化铁、氧化钛、核黄素在两个第一批试验的生产期间，在整个封装过程中密切监测温度，以便确定cfu数量发生减少的位置。试验1中生产的软凝胶在生产过程中显示出活细胞的显着损失。改变加工条件和重复试验给出了明显更稳定的生产方法。下面将结果示于表3中：表3前两个试验期间的温度和cfu值的比较填充温度从20℃降低到7.5℃的影响是明显的，益生菌的存活明显更好。更详细地观察结果，表3示出了在试验1中的封装期间cfu/软凝胶胶囊的急剧减少，并且即使在试验2中的低填充温度下，通过封装过程细胞计数减少了。在干燥期间，cfu/胶囊增加，原因是在干燥过程中水损失，使得细菌的总浓度增加(对于试验2最明显)。该温度用于随后的试验，除了填充材料的温度的一些变化(12-14℃)。在随后的试验中，仅发现最小的生产损失。作为实例，在试验4中，如果在软凝胶胶囊生产之后所有细胞都可获得，则相应于的3.0e+10cfu/软凝胶胶囊计算量添加益生菌。当开始稳定性研究时发现的cfu值为9e+09cfu/软凝胶胶囊。这两个值证实当制造包含应用改进方法的益生菌的软凝胶胶囊时观察到的益生菌的最小损失。将试验2的批次分配到具有不同量的干燥介质的不同包装系统中，并且在不同温度下开始可用性和稳定性研究。包装系统是a)包含100个软凝胶胶囊和1g二氧化硅袋的铝箔袋，b)泡罩卡(pvc/pvdc箔，每个泡罩卡10个软凝胶胶囊，c)具有pe塞和pp帽alu/pe内衬的铝瓶，含有60个软凝胶胶囊和0.5g二氧化硅袋。样品在8-12℃和25℃/65％rh下储存长达18个月。结果在图1和图2中示出。图1中的结果显示了在益生软凝胶胶囊的包装系统中存在活性干燥剂的重要性。图2中的结果表明，如果储存温度低——在8-12℃范围内，包装中存在的干燥剂材料对包含益生菌的软凝胶胶囊的cfu值的影响不太重要。来自试验4的软凝胶胶囊已经包括在各种稳定性研究中。在图3和4以及图5和6中显示出了一些结果。已经研究了作为整批软凝胶胶囊的稳定性。在图3和5中，显示了在模拟整批包装系统中在5℃和25℃下储存期间的总细胞计数(铝箔袋，每个包含30个软凝胶胶囊和3.2g干燥剂材料)。为了使软凝胶胶囊在25℃下稳定，软凝胶胶囊的数量和干燥剂材料的量之间的平衡是不合适的。从图中可以看出，在25℃保存1个月后，活细胞数已经开始减少。在表4中给出了在整批储存期间测量的水活度。表4整批存储期间的水活度整批和最终包装数据证明了在储存期间控制软凝胶胶囊的水活度的重要性，以使它们尽可能稳定。已经研究了软凝胶胶囊在最终包装中的稳定性。将30个益生软凝胶胶囊装入具有干燥剂内衬(4.3g分子筛)的塑料小瓶activevial，m-3009-336，凯匹特特种塑料公司，2039麦克米兰街，欧本阿拉巴马州，美国。储存条件为5℃，25℃/60％rh和30℃/75％rh。稳定性研究正在进行，并且储存12个月后的cfu值可用，如图4所示。储存24个月后的cfu值也可用，如图6所示。显然，在5℃或25℃/60％rh下储存的样品具有低对数损失，而在30℃/75％rh储存的样品的对数损失更高。在表5中给出了储存期间测量的相应水活度。由于塑料小瓶中的干燥剂衬里，在储存的第一个月期间水活度降低，并且这对cfu值具有稳定作用。表5储存在塑料瓶期间的水活度参考文献卡里姆a.a.(karima.a)和巴特(bhat)，拉杰夫(rajeev)，鱼明胶：特性，挑战，以及作为替代哺乳动物明胶的前景(“fishgelatin:properties，challenges，andprospectsasanalternativeofmammaliangelatins”)，食品胶体(foodhydroco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