对相关申请的交叉引用
本发明涉及用于在有需要的受试者中诱导饱食和延长饱感的药物和食物组合物。
发明背景
肠道菌群的组成与宿主代谢表型相关(ley等人，2006)并且‘肥胖’微生物群的转移可以诱发肥胖症(turnbaugh等人,2006)和食欲过盛(vijay-kumar等人,2010),提示肠道菌群可以影响宿主摄食行为。尽管肠道菌群对宿主食欲的作用的根本机制还不明确，但有可能它们可以利用宿主的控制进食的分子途径。
目前的进食控制模型涉及肠来源的饥饿和饱腹激素，所述激素将信号传导至几个调节摄食的稳态和快感方面的脑回路(berthoud,2011；inui,1999；murphy和bloom,2006)。在这些中最突出的是起源自下丘脑弓状核(arc)的厌食和促进食欲的途径，下丘脑弓状核包括分别在室旁核(pvn)中中继传递的阿黑皮素原(pomc)和神经肽y(npy)/刺鼠相关蛋白(agrp)神经元(atasoy等人,2012；cowley等人,1999；garfield等人,2015；shi等人,2013)。arc和pvn途径汇聚在外侧臂旁核中，外侧臂旁核将厌食投射发送至中央杏仁核(cea),表达降钙素基因相关肽(cgrp)(carter等人,2013；garfield等人,2015)。
肠道菌群对宿主控制食欲的效应的推定机制可能涉及其能量采集活性(turnbaugh等人,2006)和产生神经活性递质和代谢物(dinan等人,2015；forsythe和kunze,2013；sharon等人,2014)。本发明人证明了直接作用于食欲控制途径的细菌蛋白在肠道局部或全身的意义。事实上，几种细菌蛋白已经证明展示出与调节食欲的肽激素的序列同源性(fetissov等人,2008),并且最近由肠道共生大肠杆菌(e.coli)产生的clpb蛋白被鉴定为α-促黑素细胞激素(α-msh)的抗原-模拟物(tennoune等人,2014)。α-msh是pomc-衍生的神经肽，其通过激活黑素皮质素受体4(mc4r)在饱食信号传导中具有关键作用(cone,2005)。尽管mc4r-介导的α-msh厌食效应已经主要被归因于其作用的中心位点(mul等人,2013),但最近的一项研究表明肠道肠内分泌细胞中mc4r的激活刺激饱腹激素胰高血糖素样肽-1(glp-1)和肽yy(pyy)的释放(panaro等人,2014)。因此肠道细菌衍生的α-msh-样分子可以直接作用于合成饱腹激素的肠内分泌细胞。
技术实现要素：
本发明涉及用于在有需要的受试者中诱导饱食和延长饱感的药物和食物组合物。具体地，本发明由权利要求限定。
具体实施方式
本发明人已经证明clpb蛋白或表达clpb蛋白的细菌能够在有需要的受试者中诱导饱食，延长饱感，减少进食，控制体重增加，和/或促进体重减轻。
因此，本发明的一个方面涉及一种在有需要的受试者中诱导饱食的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的clpb蛋白或有效量的表达clpb蛋白的细菌。
本发明的另一个方面涉及一种在有需要的受试者中延长饱感的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的clpb蛋白或有效量的表达clpb蛋白的细菌。
因此，本发明的一个方面涉及一种在有需要的受试者中减少餐量的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的clpb蛋白或有效量的表达clpb蛋白的细菌。
本发明的另一个方面涉及一种在有需要的受试者中减少进食的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的clpb蛋白或有效量的表达clpb蛋白的细菌。
本发明的另一个方面还涉及一种在有需要的受试者中控制体重增加的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的clpb蛋白或有效量的表达clpb蛋白的细菌。
本发明的另一个方面还涉及一种在有需要的受试者中刺激体重减轻的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的clpb蛋白或有效量的表达clpb蛋白的细菌。
本发明的方法意图用于人、宠物或牲畜,而宠物或牲畜可以选自由下列组成的组：犬、猫、豚鼠、兔、猪、牛、绵羊、山羊、马和/或家禽。在一些实施方案中，所述受试者是雄性或雌性受试者。
在一些实施方案中，所述受试者是不肥胖的。在一些实施方案中，所述受试者是肥胖的。“肥胖症”在本文中是指其中受试者优选bmi>30的医疗状况。“bmi”或“身体质量指数”被定义为受试者的体重除以他身高的平方。在医学中普遍使用的该公式产生了kg/m2的量度单位。通常，不肥胖的受试者具有正常的体重。“正常”和“单纯性超重(uncomplicatedoverweight)”在本文中是指产18.5-30的bmi的体重。
当在本文中使用时，术语“饱感”意指其中个体感觉他们的渴望被满足或最小化的基本上稳态的状态。许多生理因素据信对个体的饱感有影响。例如，味觉或味道，嗅觉或气味，以及胃的胀满感均可以对个体是否感觉“吃饱”有贡献。更具体地，“饱感”是其中抑制进一步的进食并且决定餐间时间以及下一餐时消耗的食物量的状态。“增强的饱食感”或类似用语具有与对照情形相比饱食感更突出和/或更延长的含义。术语“饱食”当在本文中使用时是指在餐内终止进食的状态，通常在进餐开始后的一段时间(例如，20-30min)内发生/被观察到。因此，当在本文中提到“诱导饱食”或类似用语时，其具有激发受试者在进餐过程中停止进食的倾向的含义。对饱食的效应可以通过对进餐终止的时间点评分来确定。如果在进餐终止时消耗的卡路里的量显著比对照小，诸如例如，少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％或更多，则观察到饱食效应。在较长的时期(诸如1、2、3、4、5周或更多)内，还可以与对照饮食相比对体重减轻或体重变化进行评分。与对照受试者相比，给予常规量的测试组合物(例如，一天一次，一天两次或更多次)的受试者的体重优选地显著被控制(减小或增加较少)。当在本文中使用时，“对照受试者”是指不施用本发明的益生菌菌株的受试者。
当在本文中使用时，术语“clpb”具有其在本领域中的通常含义，并且还已知为热休克蛋白f84.1，其是六聚体aaa+-atp酶的hsp100/clpb家族成员。clpb已经被描述为获得性耐热性以及几种革兰氏阴性和革兰氏阳性致病菌(诸如金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、土拉弗朗西斯菌(francisellaturalensis)、单核细胞增多性李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersiniaenterocolitica)、和鼠伤寒沙门氏菌(salmonellathyphimurium))的毒力和感染性的关键因素。在大肠杆菌k12中，分子伴侣蛋白clpb也已知为热休克蛋白f84.1或htpm并且是857个氨基酸的蛋白。通常，分子伴侣蛋白clpb包含来自大肠杆菌k12的分子伴侣蛋白clpb的具有seqidno:1的氨基酸序列(ncbi参考编号:np_417083.1,在2013年11月6日可获得和/或uniprotkb/swiss-prot编号:p63284,在2013年11月6日可获得)或由来自大肠杆菌k12的分子伴侣蛋白clpb的具有seqidno:1的氨基酸序列组成。通常，分子伴侣蛋白clpb的氨基酸序列包含与seqidno:1的氨基酸序列96-100％相同的氨基酸序列或由与seqidno:1的氨基酸序列96-100％相同的氨基酸序列组成。优选地，clpb的氨基酸序列与seqidno:1的氨基酸序列540-550(arwtgipvsr)96、97、98、99或100％相同。在本申请的上下文中，使用全局比对(即，两条序列全长比较)计算同一性百分比。比较两条或更多条序列的同一性的方法在本领域中是公知的。例如可以使用《needle》程序，当考虑两条序列的全长时该程序使用needleman-wunsch全局比对算法(needleman和wunsch,1970j.mol.biol.48:443-453)来找到两条序列的最佳比对(包括空位)。例如needle程序在ebi.ac.uk万维网站点上可获得。根据本发明的同一性百分比优选地使用emboss:needle(全局)程序计算，所述程序使用的“空位开放”参数等于10.0,使用的“空位延伸”参数等于0.5,并使用blosum62矩阵。根据本发明，clpb蛋白模拟α-msh蛋白用于诱导饱食。因此，在一些实施方案中，本发明的clpb蛋白被抗-α-msh抗体识别。通常，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是多克隆抗体诸如多克隆兔抗-α-mshigg(1:1000,peninsulalaboratories,sancarlos,ca,usa)。α-msh的氨基酸序列优选地包含氨基酸序列sysmehfrwgkpv(seqidno:2)(genpept序列id,prf:223274,在2013年12月2日可获得)或由氨基酸序列sysmehfrwgkpv(seqidno:2)组成。
seqidno:1:
mrldrltnkfqlaladaqslalghdnqfieplhlmsallnqeggsvsplltsaginagqlrtdinqalnrlpqvegtggdvqpsqdlvrvlnlcdklaqkrgdnfisselfvlaalesrgtladilkaagattanitqaieqmrggesvndqgaedqrqalkkytidlteraeqgkldpvigrdeeirrtiqvlqrrtknnpvligepgvgktaiveglaqriingevpeglkgrrvlaldmgalvagakyrgefeerlkgvlndlakqegnvilfidelhtmvgagkadgamdagnmlkpalargelhcvgattldeyrqyiekdaalerrfqkvfvaepsvedtiailrglkeryelhhhvqitdpaivaaatlshryiadrqlpdkaidlideaassirmqidskpeeldrldrriiqlkleqqalmkesdeaskkrldmlneelsdkerqyseleeewkaekaslsgtqtikaeleqakiaieqarrvgdlarmselqygkipelekqleaatqlegktmrllrnkvtdaeiaevlarwtgipvsrmmeserekllrmeqelhhrvigqneavdavsnairrsragladpnrpigsflflgptgvgktelckalanfmfdsdeamvridmsefmekhsvsrlvgappgyvgyeeggylteavrrrpysvilldevekahpdvfnillqvlddgrltdgqgrtvdfrntvvimtsnlgsdliqerfgeldyahmkelvlgvvshnfrpefinridevvvfhplgeqhiasiaqiqlkrlykrleergyeihisdealkllsengydpvygarplkraiqqqienplaqqilsgelvpgkvirlevnedrivavq
在一些实施方案中，clpb蛋白以药物组合物的形式施用于受试者。在一些实施方案中，clpb蛋白与药学上可接受的赋形剂以及任选地缓释基质，诸如生物可降解的聚合物组合，以形成药物组合物。术语“药学上”或“药学上可接受”是指当适当时施用于哺乳动物，特别是人时不产生不良反应、变态反应或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指任何类型的无毒性的固体、半固体或液体填充剂，稀释剂，包封材料或制剂助剂。在本发明的药物组合物中，有效成分单独地或与另一种有效成分组合可以以单位给药形式作为与常规药物支持物的混合物施用于动物和人。合适的单位给药形式包含口服途径形式诸如片剂、凝胶胶囊、粉末、颗粒和口服混悬剂或溶液剂、舌下和颊部给药形式、气雾剂、植入物、皮下给药形式、透皮给药形式、局部给药形式、腹膜内给药形式、肌肉内给药形式、静脉内给药形式、真皮下给药形式、透皮给药形式、鞘内给药形式和鼻内给药形式和直肠给药形式。优选地，所述药物组合物包含对能够注射的制剂是药学上可接受的媒介物。这些可以具体地是等渗的、无菌的、盐水溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的、特别是冻干的组合物，根据情况，在添加无菌水或生理盐水后，所述组合物允许配制注射溶液。适合用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体；包含麻油、花生油或含水丙二醇的制剂；和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是达到容易注射的流体。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须被保护免受微生物诸如细菌和真菌的污染作用。包含本发明的化合物作为游离碱或药理学上可接受的盐的溶液可以在水中适当地与表面活性剂诸如羟丙基纤维素混合来制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇、和它们的混合物中以及在油中制备。在储存和使用的普通条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。活性成分可以被配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)，其与无机酸或有机酸形成，所述无机酸诸如，例如，盐酸或磷酸，有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。与游离羧基形成的盐也可以源自无机碱诸如，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及源自有机碱诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。所述载体也可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇，等)、其合适的混合物，和植物油。适宜的流动性例如可以通过使用涂层诸如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒度并且通过使用表面活性剂来保持。防止微生物的作用可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如，尼泊金、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，其优选地包含等渗剂，例如，糖类或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延缓吸收的药剂，例如，单硬脂酸铝和明胶来实现。无菌注射溶液通过在适宜的溶剂中掺入所需量的活性多肽，接着过滤灭菌来制备，所述适宜的溶剂根据需要具有上面列举的其他成分中的多种成分。通常，通过将多种经灭菌的活性成分掺入至无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物包含基础分散介质和所需的来自上面列举的那些的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥技术和冻干技术，所述技术产生活性成分与来自其前面无菌过滤的溶液的任何附加的所需成分的粉末。在配制后，溶液将以与所述剂型可配伍的方式并且以治疗上有效的量给药。所述制剂容易地以多种剂型给药，诸如上述的注射溶液类型，但也可以采用药物释放胶囊和类似物。例如，对于水溶液形式的肠胃外给药，如果必要所述溶液应当被适当地缓冲并且首先利用足量的盐水或葡萄糖使液体稀释剂变成等渗。这些特殊的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。在这一点上，根据本公开，可以采用的无菌水性介质对本领域技术人员来说是已知的。例如，一个剂量可以溶解在1ml等渗nacl溶液中，并且加入至1000ml皮下灌注液中或在推荐的输注部位处注射。根据被治疗的受试者的状况，剂量有必要进行一些改变。无论如何，负责给药的人将决定用于个体受试者的适宜剂量。
当在本文中使用时，表述“表达clpb的细菌”是指表达或过度表达如上面所定义的分子伴侣蛋白clpb或包含与seqidno:1的氨基酸序列96-100％相同的氨基酸序列的多肽或由与seqidno:1的氨基酸序列96-100％相同的氨基酸序列组成的多肽，更优选包含与seqidno:1的氨基酸序列96、97、98、99或100％相同的氨基酸序列的多肽或由与seqidno:1的氨基酸序列96、97、98、99或100％相同的氨基酸序列组成的多肽的细菌。
在一些实施方案中，表达clpb的细菌是益生菌菌株。
当在本文中使用时术语“益生物”意指命名这样的活微生物，它们以充足的量整合在一起，对健康发挥积极效果，在传统营养作用以外还提供舒适和健康。益生微生物已经被定义为“当以足量施用时对宿主赋予健康益处的活微生物”(fao/who2001)。当在本文中使用时表述“益生菌菌株”表示对宿主的健康和福祉具有有益效应的细菌菌株。
在一些实施方案中，本发明的益生菌菌株是有活力的益生菌菌株。表述“有活力的益生菌菌株”意指有代谢活性并且能够定植在受试者的胃肠道的微生物。
在一些实施方案中，本发明的益生菌菌株是由细菌碎片混合物组成的无活力的益生菌菌株。在一些实施方案中，本发明的细菌碎片混合物由来自所述细菌菌株的蛋白组成。
在一些实施方案中，本发明的益生菌菌株选自食品级细菌。“食品级细菌”意指被使用且通常被认为在食品中使用是安全的细菌。
所述细菌菌株可以是天然存在的菌株或其可以是基因工程化的细菌菌株。
在一些实施方案中，本发明的益生菌菌株是组成性表达clpb蛋白的细菌。
在一些实施方案中，clpb蛋白在细菌中过表达。通常当蛋白以高于自然界中在标准条件下存在的给定基线产量的量或产量表达或产生时蛋白表达是“上调的”或该蛋白是“过表达的”。蛋白的过表达可以例如通过改变下述中的任一种或多种来实现：(a)宿主细胞的生长或生活条件；(b)编码所述蛋白的多核苷酸；(c)用来控制所述多核苷酸的表达以及其在细胞中的拷贝数的启动子；和(d)宿主细胞本身。
在一些实施方案中，所述细菌承受应激条件使得在所述细菌中clpb蛋白的表达被上调。应激可以选自由下列各项组成的组：暴露于热量，温度改变，机械应力，或长时间保存，低湿度保存和/或冻干或喷雾干燥。
在一些实施方案中，所述细菌接受营养物供应至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。通常营养物借助于便于细菌生长的培养基(例如，如实施例中所述的muller-hinton)供应。在一些实施方案中，细菌在紧接所述重复的营养物供应的静止期阶段时分离，因为在此期期间clpb蛋白的浓度最大。
在一些实施方案中，所述细菌包含至少一个点突变使得clpb蛋白的表达被上调。术语“点突变”当在本文中使用时意指核酸置换和/或缺失。可选地或同时地，所述至少一个突变位于clpb基因的调控dna序列内，例如，在转录和翻译控制序列中，优选此突变调节所述蛋白的表达。调控dna序列内的突变可以起上调所述蛋白的表达的作用。
在一些实施方案中，本发明的益生菌菌株是已经被遗传工程化以表达clpb蛋白的细菌。通常，所述细菌菌株用编码clpb蛋白的核酸转化。术语“转化”意指将“外来”(即，外部的或细胞外的)基因、dna或rna序列引入至宿主细胞中，使得所述宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生所需的物质，通常被所引入的基因或序列编码的蛋白或酶。接收和表达所引入的dna或rna的宿主细胞已经被“转化”。所述核酸可以在亲代微生物的转化后保留在染色体外或可以适于整合到微生物的基因组中。因此，所述核酸可以包括适于辅助整合的附加核苷酸序列(例如，允许同源重组并靶向整合到宿主基因组中的区域)或适于染色体外构建体的稳定表达和复制的附加核苷酸序列(例如，复制起始点，启动子和其他调控序列)。在一些实施方案中，所述核酸是核酸构建体或载体。在一些实施方案中，所述核酸构建体或载体是表达构建体或载体，然而，本发明涵盖其他构建体和载体，诸如用于克隆的那些。在一些实施方案中，表达构建体或载体是质粒。典型地，表达构建体/载体进一步包括启动子，如本文前面所述。在一些实施方案中，启动子允许在它的控制下组成性表达基因。然而，也可以采用诱导型启动子。要理解本发明的表达构建体/载体除了启动子以外可以含有任何数目的调控元件以及如果需要的话适合于表达clpb蛋白的额外基因。用于利用细胞外核酸转化细菌细胞的方法在本领域中是熟知的。
在一些实施方案中，益生菌菌株是革兰氏阴性菌株。
在一些实施方案中，益生菌菌株是肠杆菌科成员。
在一些实施方案中，益生菌菌株是大肠杆菌菌株。在一些实施方案中，根据本发明的教导使用的益生大肠杆菌菌株包括非致病性大肠杆菌菌株，其发挥益生活性。益生大肠杆菌菌株的实例是益生大肠杆菌菌株bu-230-98,atcc保藏号202226(dsm12799),其是已知的市售的益生大肠杆菌菌株m-17的分离物。非致病性菌的实例是大肠杆菌nissle1917。尚未知晓是益生菌的大肠杆菌菌株的实例是实验室大肠杆菌菌株k12。
通常，本发明的益生菌菌株利用本领域中熟知的任何适宜的培养基制备。根据本发明各种发酵培养基均是合适的，诸如(但不限于)例如首先工业培养基，一种或多种菌株在所述工业培养基中生长，并且所述培养基原样使用或在浓缩后(例如，干燥)使用或在添加到另一食物基或产品中后使用。可选地，可以使用细菌细胞，或带有培养基的细菌细胞(例如，发酵液)，或包含部分这样细胞的培养基(即，具有所述一种或多种细菌菌株的培养基)。细胞或含有所述细胞的培养基包含一种或多种菌株的活的或有活力的细菌细胞和/或死的或无活力的细菌细胞。因此所述培养基可以通过，但不限于，加热或超声作用进行处理。冻干的、或冷冻的细菌和/或无细胞培养基(其可以被浓缩)也涵盖在用于制备本发明的益生菌菌株的方法中。
通常，本发明的益生菌菌株通过摄入(即，经口途径)施用于所述受试者。
在一些实施方案中，本发明的益生菌菌株被包封以便被保护免受胃的影响。因此，在一些实施方案中，本发明的益生菌菌株被配制在包封形式的组合物中以便显著地提高它们的生存时间。在这样的情况下，胶囊的存在可以特别地延缓或防止微生物在胃肠道中的降解。要理解的是本发明的组合物可以被包封在肠包衣的、定时释放(time-released)的胶囊或片剂中。肠包衣允许当胶囊/片剂通过胃肠道时其保持完整(即，未溶解的)，直至它到达小肠的时候为止。包封活细菌细胞的方法在本领域中是公知的(参见，例如，generalmillsinc.的美国专利，诸如美国专利号6,723,358)。例如，利用海藻酸盐和hi-maizetm淀粉微包封接着冻干已经证明成功地延长乳制品中细菌细胞的保质期[参见，例如，kailasapathy等人currissuesintestmicrobiol.2002september；3(2):39-48]。可选地，可以利用葡甘露聚糖纤维诸如从魔芋(amorphophalluskonjac)提取的那些来完成包封。可选地，也可以使用将有活力的益生菌包封在麻油乳液中[参见，例如，hou等人j.dairysci.86:424-428]。在一些实施方案中，用于肠包衣的药剂优选是甲基丙烯酸-丙烯酸烷基酯共聚物，诸如
-聚(甲基)丙烯酸酯,在消化液中是可溶的(通过形成盐)：
-聚(甲基)丙烯酸酯,在消化液中是不可溶的：具有碱性基团的
肠
通常，本发明的益生菌菌株以食物组合物的形式施用于受试者。因此本发明的另一个方面涉及包含一定量的本发明的益生菌菌株的食物组合物。
在一些实施方案中，包含本发明的益生菌菌株的食物组合物选自完全食品组合物、食品补充剂、营养组合物，等。本发明的组合物可以用作食物成分和/或饲料成分。
所述食物成分可以是溶液的形式或作为固体—取决于应用的用途和/或模式和/或给药方式。
本发明的益生菌菌株通常在所述组合物的制备过程期间的任何时间加入，例如，它们可以在制备过程开始时加入至食物基或它们可以加入至最终的食物产品中。
“食物”是指液体(即，饮料)、固体或半固体饮食组合物，特别是不需要额外的营养素摄取的完全食品组合物(食物替代品)或食品补充剂组合物。食品补充剂组合物不能完全代替通过其他方式的营养素摄取。食物组合物和食品补充剂组合物例如是发酵乳制品或基于乳制品的产品，它们优选地经口一天一次或多次地施用或摄入。发酵乳制品可以直接使用根据本发明的细菌在制备过程中使用本身已知的方法制成，例如通过添加到食物基。在这样的方法中，除了通常使用的微生物以外可以使用本发明的一种或多种菌株，和/或本发明的一种或多种菌株可以代替一种或多种通常使用的微生物或部分的通常使用的微生物。例如，在发酵乳制品诸如酸奶或基于酸奶的饮料的制备中，本发明的细菌可以添加到起子培养或用作起子培养的一部分，或可以在这样的发酵过程中适当地加入。任选地，在制备过程后期所述细菌可以被失活或杀死。发酵乳制品包括奶基产品，诸如(但不限于)甜点、酸奶、酸乳饮料、夸克、开菲尔、发酵奶基饮料、酪乳、奶酪、调味汁、低脂酱、新鲜干酪、基于大豆的饮料、冰淇淋等。可选地，食物和/或食品补充剂组合物可以是非乳制的或乳制的非发酵性产品(例如，非发酵奶或另一食物媒介中的菌株或无细胞媒介)。在一些实施方案中，本发明的益生菌菌株被包封并分散在食物(例如，在奶中)或非食物媒介中。非发酵性乳制品可以包括冰淇淋、营养棒和调味汁，等。非-乳制品可以包括饮料粉冲泡饮料和营养棒，等。所述产品可以使用已知的方法制备，诸如向食品基质诸如脱脂奶或奶或奶基组合物和发酵物添加有效量的一种或多种菌株和/或无细胞培养基，如已知的那样。可以添加细菌细胞(包含所述细菌细胞的组合物)和/或无细胞培养基(包含所述无细胞培养基的组合物)的其他食品基质是肉、肉代用品或植物基质。
包含本发明的益生菌菌株的组合物可以是固体、半固体或液体。其可以是食品或食品补充剂的形式，例如，片剂、凝胶、粉剂、胶囊、饮料、棒等的形式。例如，所述组合物可以是包装在小囊中的粉末的形式，其可以溶解在水、果汁、奶或另一种饮料中。
当在本文中使用时术语“食物成分”或“饲料成分”包括被添加到或可以被添加到功能食品或食料中作为营养补充剂的制剂。
“营养食物”或“营养食品”或“功能”食品意指含有对健康具有有益效果或能够改善生理功能的成分的食料。
“食品补充剂”意指具有完善正常食物饮食的目的的食料。食品补充剂是营养素的浓缩来源或当被单独摄入或作为小量的组合摄入时具有营养或生理效应的其他物质。
根据本发明，“功能食品”概括了食料以及以后被开发的相应产品，它们的重要性不仅归因于就营养和味道而言它们是有价值的，而且归因于特定的成分物质。根据本发明，健康的中期或长期维持和促进是很重要的。就此而言，优选非治疗性用途。术语“营养食品”、“食物营养素(foodsceuticals)”、“特制食品”也代表本发明的实施方案，它们部分地用作同义词，然而，还是处于不同的方式。然而，术语功能食品最清晰地表达了产品的预防方面和促进健康以及食物特性。在许多情况下，这些涉及通过分类和选择(在本发明中也是如此)、纯化、浓缩、还通过渐增添加所积聚而成的产品。不包括有效分离的物质，特别是以片剂或丸剂的形式。尽管功能食品并不存在法定的含义，但大多数在此领域中感兴趣的主体同意它们是在市场上销售的除了基本的营养效应以外还具有特定的健康效应的食品。因此，功能食品是其中掺入了对食物施加了特定的功能益处(例如，医学或生理益处)而不是纯营养效应的组分或成分(诸如本文所述的那些)。
在一些实施方案中，饮料是功能饮料或治疗性饮料、止渴剂或普通饮料。借助于实施例，本发明的组合物可以用作软饮料、果汁或包含乳清蛋白的饮品、保健茶、可可饮料、牛奶饮料和乳酸菌饮料、酸奶和酸奶饮品、干酪、冰淇淋、冰糕和甜点、糕点糖果、饼干蛋糕和蛋糕粉、休闲食品、均衡食品和饮料、水果馅、保健釉、巧克力焙烤食品馅、乳酪蛋糕调味馅(cheesecakeflavouredfilling)、水果味蛋糕馅(fruitflavouredcakefilling)、蛋糕和甜甜圈酥皮、即食烘焙用填充馅、曲奇馅、即用型焙烤食品馅、减少卡路里的食品馅(reducedcaloriefilling)、成人营养性饮料、酸性大豆/果汁饮料、无菌/杀菌袋装巧克力饮料、鸡尾酒(barmixes)、饮料粉、钙强化大豆/原味和巧克力奶、钙强化咖啡饮料的成分。
所述组合物可以进一步用作食品诸如下列中的成分：美国芝士酱、用于搓碎和碎干酪的抗结块剂、点心盘、奶油干酪、干混植脂奶油脱脂酸奶油、冷冻/融化的动物性鲜奶油、对冷冻/融化稳定的植物鲜奶油、低脂和清淡天然切达干酪(lowfatandlightnaturalcheddarcheese)、低脂瑞士风味酸奶、充气冷冻甜点、硬盒包装冰淇淋、带环保标签的经济性和嗜好性提高的硬盒冰淇淋、低脂冰淇淋：软质冰淇淋、烤肉调味酱、干酪蘸酱、农家干酪调味汁(cottagechessedressing)、干混阿尔弗雷德酱、混合干酪酱、干混番茄酱和其他食品。
在一些实施方案中，包含本发明的益生菌菌株的组合物用于酸奶生产，诸如发酵型酸奶饮料、酸奶、饮用型酸奶、干酪、发酵奶油、奶基甜点等。合适地，所述组合物可以进一步用作干酪应用、肉制品应用或包括保护性培养物的应用中的一种或多种应用中的成分。
在一些实施方案中，包含本发明的益生菌菌株的食物组合物适合用于制备代餐产品。当在本文中使用时，术语“代餐产品”当在本文中使用时，除非另外指定，否则包括包含蛋白、碳水化合物、脂质、维生素和矿物质的任何营养产品，然后所述营养产品的组合适合作为一餐的单一或基本营养源。通常，所述代餐产品包含至少一种碳水化合物源、至少一种脂质源和/或至少一种蛋白源。作为蛋白源，可以使用任何合适的膳食蛋白质，例如动物蛋白(诸如乳蛋白、肉蛋白和卵蛋白)；植物蛋白(诸如大豆蛋白、小麦蛋白、大米蛋白、和豌豆蛋白)；游离氨基酸的混合物；或其组合。乳蛋白诸如酪蛋白和小麦蛋白，以及大豆蛋白是特别优选的。所述蛋白可以是完整蛋白或水解蛋白或完整蛋白和水解蛋白的混合物。例如对据信处于发生牛乳过敏风险的动物供应部分水解的蛋白可以是合乎需要的(水解度为2-20％)。如果需要水解蛋白，水解过程可以根据需要以及如本领域中已知的那样进行。例如，乳清蛋白水解物可以通过以一步或多步酶促水解乳清级分来制备。如果用作起始物料的乳清级分基本上不含乳糖，则发现在水解过程期间蛋白发生少得多的赖氨酸阻塞。这使得能够将赖氨酸阻塞的程度从约15重量％的总赖氨酸减少到小于约10重量％的赖氨酸；例如约7重量％，这极大地改善了蛋白源的营养质量。如果所述组合物包括脂肪源，则所述脂肪源优选地提供所述组合物的5％-40％能量；例如，20％-30％的能量。使用芥花油、玉米油和高油酸向日葵油的共混物可以获得合适的脂肪谱。碳水化合物的来源优选地提供所述组合物的40％-80％能量。可以使用任何合适的碳水化合物，例如，蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固形物、麦芽糊精、和它们的混合物。通常，利用替餐用低能量膳食代替一日中的一餐促进体重减轻后的体重维持。
包含本发明的益生菌菌株的食物组合物通常包含载体或媒介物。“载体”或“媒介物”意指适合用于给药的材料并且包括本领域中已知的任何此类材料，诸如，例如，任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂或类似物，它们是无毒的并且不以有害的方式干扰所述组合物的任何组分。营养上可接受的载体的实例包括，例如，水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林油、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香精油、脂肪酸单甘油酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮，和类似物。
在一些实施方案中，包含本发明的益生菌菌株的食物组合物包含一定量的膳食纤维。膳食纤维通过小肠，却不被酶消化，并且作为天然增容剂和缓泻药发挥作用。膳食纤维可以是可溶的或不溶的并且通常优选是两种类型的共混物。膳食纤维的合适来源包括大豆、豌豆、燕麦、果胶、瓜儿豆胶、阿拉伯树胶、低聚果糖、低聚半乳糖、唾液基-乳糖和来源于动物奶的寡糖。在一些实施方案中，所述膳食纤维在甘露聚糖中选择。甘露聚糖(诸如葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖)，诸如瓜儿豆胶、刺槐豆胶、蒟蒻、和黄原胶，存在于一些植物细胞壁中。葡甘露聚糖通常由(1-4)-β-连接的葡萄糖和甘露糖单元组成，而半乳甘露聚糖通常由被单一单元的(1-6)-α-半乳糖取代的(1-4)-β-甘露聚糖主链组成。许多胚乳豆科植物，诸如瓜尔豆和槐豆，在种子发育期间在胚乳中包含半乳甘露聚糖。还已经发现葡甘露聚糖是粮食的微量组分。
在一些实施方案中，包含本发明的益生菌菌株的食物组合物含有根据政府机构诸如usrda推荐的矿物质和微量营养素诸如痕量元素和维生素。例如，所述组合物可以包含每天一次剂量的下面的给定范围的微量营养素中的一种或多种：-300-500mg钙、50-100mg镁、150-250mg磷、5-20mg铁、1-7mg锌、0.1-0.3mg铜、50-200μg碘、5-15μg硒、1000-3000μgβ-胡萝卜素、10-80mg维生素c、1-2mg维生素b1、0.5-1.5mg维生素b6、0.5-2mg维生素b2、5-18mg烟酸、0.5-2.0μg维生素b12、100-800μg叶酸、30-70μg生物素、1-5μg维生素d、3-10μg维生素e。
在一些实施方案中，包含本发明的益生菌菌株的组合物含有乳化剂。食品级乳化剂的实例通常包括甘油一酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、卵磷脂和甘油一酯和甘油二酯。类似地可以包括合适的盐和稳定剂。
在一些实施方案中，包含本发明的益生菌菌株的食物组合物含有至少一种益生物质。“益生物质”意指意欲促进本发明的益生菌菌株在肠中生长的食物物质。所述益生物质可以选自由下列各项组成的组：寡糖和可选地含有果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊粉；和/或膳食纤维。
在一些实施方案中，包含本发明的益生菌菌株的组合物含有保护性水状胶质(诸如树胶、蛋白、改性淀粉)、粘合剂、成膜剂、包囊剂/材料、壁/壳材料、基质化合物、包衣、乳化剂、表面活性剂、增溶剂(油、脂肪、蜡、卵磷脂等)、吸附剂、载体、填充剂、辅助化合物(co-compound)、分散剂、润湿剂、加工助剂(溶剂)、助流剂、掩味剂、增重剂、凝胶化剂(jellifyingagent)、胶凝剂、抗氧化剂和抗微生物剂。所述组合物还可以包含常规药物添加剂和辅料、赋形剂和稀释剂，包括，但不限于，水、任何来源的白明胶、植物胶、木质素磺酸钠、滑石、糖类、淀粉、阿拉伯树胶、植物油、聚亚烷基二醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲液、润滑剂、着色剂、润湿剂、填充剂，等等。在所有情况下，这些更多的组分将关于它们对预期受者的适合性来选择。
在一些实施方案中，clpb蛋白(或表达所述蛋白的益生菌菌株)的给药重复例如一天2-3次，持续一天或多天并且通常持续至少4天，或甚至4-15周的周期，在适当时中断一个或多个周期。在一些实施方案中，clpb蛋白与受试者的一餐同时地或相继地给予。在一些实施方案中，clpb蛋白在受试者的餐前给予。
当在本文中使用时，术语“有效量”是指足以实现有益效果(例如，激发饱感，延长饱食，减少进食，控制体重增加,和/或促进体重减轻)的clpb蛋白的量。在本发明的上下文中，施用于受试者的clpb蛋白的量将取决于个体的特征，诸如一般健康、年龄、性别、体重...本领域技术人员将能够根据这些和其他因素确定适宜的剂量。例如，当clpb蛋白以益生物质的形式施用于受试者时，本发明的菌株应当能够生成足以在受试者上产生有益效果的集落。如果益生菌菌株以食品的形式施用，则其通常可以包含103-1012cfu的本发明的益生菌菌株每g干重的所述食物组合物。
本发明将进一步通过下面的附图和实施例来举例说明。然而，这些实施例和附图不应当以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1：在3周管饲开始和结束时分析的在正常c57bl6成年小鼠中每天一次胃内递送大肠杆菌k12野生型(wt)或删除clpb基因的大肠杆菌(δclpb)对体重、24h进食和进餐模式的效应。对照小鼠(ctr)不接受任何管饲。进餐模式测量为餐量，对应于在单餐期间吃掉的食物的平均量，并且作为进餐频率，对应于每24h间隔至少5min的进餐数。减少的摄食量反映了较快的饱食并且减少的进餐频率反映了较长的饱感。a.双因素重复测量anova,邦弗朗尼事后检验*p<0.05。b、d、g、h,anova,tukey事后检验，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。e.学生t检验，*p<0.05。
具体实施方式
实施例1:
材料和方法
在定期营养素供应后体外大肠杆菌生长
在50mlfalcon瓶中在处于25℃、ph为7.3的含有30％牛肉浸液、1.75％干酪素水解物和0.15％淀粉的40mlmh培养基(becton,dickinson,md)中在37℃培养大肠杆菌k12菌。为了建模人中的两种预定的每日用餐，在连续5天期间细菌每12h接受新的mh培养基。细菌生长在第一次提供mh培养基后每2h、第三次提供后每1h以及在第五次提供后每10min通过分光光度计测量为在λ＝600nm的od。在每12h循环结束时，将细菌在室温(rt)以6,000rpm离心5min。弃去上清液并且更换相等体积(～40ml)的新mh培养基。在最后一次补充mh培养基后，在指数期和接下来的静止期中对细菌采样以进行蛋白提取。
蛋白提取
大肠杆菌k12菌在4℃以4,000g离心30min。细菌残余物溶解在2ml三羟基甲基氨基甲烷(tris)缓冲液(ph7.4)中并通过在rt超声作用3min进行匀浆。为了从未溶解的细胞碎片中分离蛋白，将细菌匀浆在4℃以10,000g离心30min。回收上清液，然后在4℃以60,000g超离心45min从而将蛋白进一步分离成细胞质(上清液)和膜(残余物)级分。膜蛋白溶解在tris缓冲液(ph7.4)中。蛋白浓度使用2-dquant试剂盒(gehealthcare,piscataway,nj)测量。
二维聚丙烯酰胺凝胶电泳
对于2d-page，300μg大肠杆菌蛋白提取物用来再水化固定的ph梯度(ipg)条(ph4–7；18cm；bio-rad,hercules,ca)。然后通过使用ipgphor等电聚焦系统(gehealthcare)进行等点聚焦总计85,000v-h以第一维解析蛋白。在聚焦后，将ipg条在平衡缓冲液[尿素6mol/l、30％(vol:vol)甘油、2％(wt:vol)十二烷基硫酸钠(sds)、tris-hcl50mmol/lph8.8、和含有2％(wt:vol)二硫苏糖醇的0.25％(wt:vol)溴酚蓝]中孵育15min，然后在含有4％(wt:vol)碘乙酰胺的平衡缓冲液中烷基化15min。ipg条随后固定到10％聚丙烯酰胺梯度凝胶(20cm·18cm·1mm)上进行sds-page。在ettandaltsix垂直电泳系统(gehealthcare)中利用12ma/凝胶在25℃进行第二维过夜。在sds-page后，将2d凝胶在2％(vol:vol)正磷酸和在50％(vol:vol)甲醇中在rt固定2h。然后将凝胶用水漂洗，并且通过cbbg-250(bio-rad)染料[34％(vol:vol)甲醇、17％(wt:vol)硫酸铵、2％(vol:vol)正磷酸和0.66gcbbg-250/l]可视化蛋白斑点。
对差异蛋白表达的分析
将染色的2d凝胶的图像通过用灰色标度标志物(kodak,rochester,ny)校准并用labscan6.0软件(gehealthcare)数字化的imagescannerii(gehealthcare)扫描。使用imagemaster2dplatinum5.0软件(gehealthcare)进行对差异蛋白表达的分析，包括斑点检测、定量、匹配和对比分析。每个蛋白样品接受2d-page至少3次(膜蛋白)和4次(细胞质蛋白)以使连续运行变化最小化，并且使用imagemaster比较每组3个(或4个)凝胶以确认所述组凝胶内没有出现统计学有差异的斑点。每组的最有代表性的凝胶(凝胶移位、斑点清晰度和斑点数)用来比较指数期和静止期的大肠杆菌蛋白。表达水平由凝胶中每个斑点的相对体积来确定并且表示为％体积，计算为斑点体积/凝胶中解析的所有斑点的σ体积。这种经归一化的斑点体积通过对凝胶中存在的所有斑点均考虑总体积而考虑到了由于蛋白上样和染色引起的变异。丰度变异计算为2期之间斑点组％体积的平均值比率。仅体积变异比率>1.5的斑点被考虑为相关。凝胶内缺失的斑点表明对于该蛋白在所选的试验条件下没有可检测到的表达。在斑点体积对数变换后，相应的p值通过学生t检验(显著性水平p<0.05)确定。
通过液相色谱-电喷射离子化ms/ms进行的蛋白鉴定
使用ettan斑点切取仪(gehealthcare)将感兴趣蛋白斑点从cbbg-250-染色的2d凝胶切下，并且如前所述(goichon等人,2011)在ettan消化器(gehealthcare)上进行蛋白的自动凝胶内消化。然后将蛋白提取物重新悬浮在10μl5％(vol:vol)乙腈/0.1％(vol:vol)甲酸中，然后利用连接到装有nanospray源和hplc-chipcubeinterface(agilenttechnologies,courtaboeuf,法国)的6340离子阱质谱仪的nano-lc1200系统进行分析。简言之，在40nlrp-c18捕获柱上将肽富集并脱盐，并在zorbax(30-nm孔径,5-μm粒径)c18柱(43mm长x75μm内径；agilenttechnologies)上分离。使用9-min线性梯度(在0.1％甲酸中的3％-80％乙腈)以400nl/min的流速，并且利用离子阱质谱仪分析洗脱液。
对于蛋白鉴定，提取ms/ms峰列表并通过使用mascotdaemonversion2.2.2(matrixscience)搜索引擎将其与蛋白数据库进行比较。利用下面的特定参数进行搜索：酶特异性，胰蛋白酶；允许一个未酶切位点；没有固定修饰；可变化的修饰，蛋氨酸氧化，半胱氨酸脲基甲基化，丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸磷酸化；单同位素；肽电荷，2+和3+；前驱粒子的质量公差，1.5da；碎片粒子的质量公差，0.6da；esi-trap作为仪器；分类学，大肠杆菌；国立生物技术信息中心(ncbi)数据库[ncbinr20120531(18280215条序列，6265275233个残基)](bethesda,md)。如果蛋白命中满足下列标准中之一则自动地验证所述蛋白命中：利用至少两个排名最高的肽(粗体的和红色的)鉴定，每个肽的mascot评分大于54(p<0.01)，或利用至少两个排名最高的肽(粗体的和红色的)鉴定，每个的mascot评分大于47(p<0.05)。为了评价假阳性率，使用mascot的“诱饵”选项进行所有初始的数据库搜索。如果假阳性率从来不超过1％则认为结果是相关的。
atp测定
使用atp比色/荧光测定试剂盒根据生产厂商的说明书(biovision,ca)测量体外atp产生。简言之，将来自指数期或静止期的细菌蛋白置于一系列孔中，对于每个浓度一式两份(在atp测定缓冲液中的1、10和25μg/ml)并且利用atp测定缓冲液调整至50μl/孔。然后将10μl不同的营养素溶液、15％蔗糖或mh培养基添加至相应的孔中并且利用atp测定缓冲液调整至50μl/孔；仅50μl/孔的atp缓冲液添加至对照孔中。所述板在37℃孵育2h。在孵育后，将50μlatp反应混合物(含有atp测定缓冲液、atp探针、atp转换剂和显影剂混合物)添加到每个孔中。在rt孵育30min后在570nm测量od，避光。
clpb免疫测定的显影和验证
clpb检测测定的设计基于几个标准，诸如在线性浓度范围内的特异性和灵敏度检测。特定状况是没有α-msh交叉反应性的clpb检测，其可能由于在clpb分子中存在一个或多个α-msh-样表位而发生。为了程序和信号检测的简单性，我们使用了标准的96-孔elisa板以及通过分光光度计进行od读数的选项。clpbelisa和westernblot(wb)的详细规程在分开的章节中给出。
为了防止启示抗体(ab)与捕获ab的结合，我们分别在不同的物种，兔和小鼠中制备了clpb捕获ab和clpb检测ab。为了从复杂的生物样品中最有效地捕获clpb蛋白，我们用具有多个抗-clpb表位的兔多克隆ab包被elisa板。为了避免clpb和α-msh之间的交叉反应性，我们使用小鼠单克隆抗-clpbab作为检测ab，所述小鼠单克隆抗-clpbab的特征是高灵敏度和特异性地识别clpb而非通过对几个ab克隆的elisa筛选来进行α-msh预选择。碱性磷酸酶缀合的抗小鼠启示ab用作获得发色酶促反应的常用elisa工具，所述发色酶促反应可作为与分析物浓度成正比的od来读取。在没有到达稳定期并且没有od信号饱和的条件下从2pm-150pm的重组大肠杆菌clpb蛋白的7个连续稀释液的检测得到od线性变化。
为了确认开发的clpb测定的特异性，我们测量了从大肠杆菌k12wt的10个不同的培养物以及从δclpb突变大肠杆菌的培养物提取的蛋白样品中的clpb浓度。clpb突变株和相应的野生型(wt)菌株由dr.axelmogk(zmbh,海德堡大学,德国)馈赠。此外，我们通过wb使用抗-clpb多克隆兔ab分析了存在于这些细菌蛋白样品中的clpb并且比较了elisa中wb带以及clpb浓度之间的信号强度值。在所有wt大肠杆菌培养物中检测clpb，其中7个培养物的clpb浓度高于1000pm，而在从δclpb大肠杆菌中提取的蛋白样品中clpb是无法检测到的。wb揭示了在wt中存在具有期望的96kda大小的主要条带，而在δclpb大肠杆菌中则没有。这些条带的od强度在各个样品之间有所变化，并且与通过elisa在相同的大肠杆菌培养物样品中测量的clpb浓度正相关。因此，在δclpb大肠杆菌的蛋白制剂中检测不到clpb确认了测量的特异性，并且elisa和wb之间的良好一致性提供了对两种clpb免疫检测技术的交叉验证。
为了验证clpb血浆测定检测来源于肠道细菌的clpb，我们使用了clpbelisa来测量小鼠血浆中的clpb，所述小鼠已经经由胃内管饲每天一次补充wt大肠杆菌或补充δclpb大肠杆菌持续3周。血浆样品可获自我们之前发表的研究(tennoune等人,2014)。我们发现clpb正常存在于小鼠血浆中，包括对照以及用不含细菌的培养肉汤管饲的小鼠两者。重要的是，clpb血浆水平在接受wt大肠杆菌的小鼠中增加而在补充以clpb-缺陷性大肠杆菌的小鼠中没有改变，确认了血浆clpb的肠道细菌起源。
clpbelisa
使用100μl和在100mmnahco3缓冲液(ph9.6)中的2μg/ml的浓度，将兔多克隆抗-大肠杆菌clpb抗体(由delphigenetics,戈斯利,比利时定制)在4℃包被在96-孔maxisorp板(nunc,rochester,ny)上持续12h。在含有0.05％tween20的磷酸盐缓冲盐水(pbs)，ph7.4中洗涤板(5minx3)。重组大肠杆菌clpb蛋白(由delphigenetics定制)在样品缓冲液(pbs,叠氮化钠0.02％,ph7.4)中连续地稀释至5、10、25、50、70、100和150pm，并且一式二份地加入至孔中以制备标准品。分析物样品包括：来自小鼠和大鼠的结肠粘膜和血浆样品或从大肠杆菌k12培养物提取的蛋白。分析物样品一式两份地加入至剩余的孔中，并且在rt孵育2h。在含有0.05％tween20的pbs，ph7.4中洗涤板(5minx3)。将小鼠单克隆抗-大肠杆菌clpb抗体(在样品缓冲液中1:500，由delphigenetics定制)加入至孔中，并且在rt孵育90min。在含有0.05％tween20的pbs，ph7.4中洗涤板(5minx3)。将来自jacksonimmunoresearchlaboratories,inc.(westgrove,pa)的缀合有碱性磷酸酶的山羊抗小鼠igg(在样品缓冲液中1:2000)加入至孔中并在rt孵育90min。在含有0.05％tween20的pbs，ph7.4中洗涤板(5minx3)，然后加入100μl磷酸对硝基苯酯溶液(sigma,st.louis,mo)作为碱性磷酸酶底物。在rt孵育40min后，通过添加50μl3nnaoh终止反应。使用酶标仪metertech960(metertechinc.,台北，台湾)在405nm测定od。将从未添加血浆样品或clpb蛋白标准稀释液的板的读数得到的空白od值从样品od值中减去。
clpbwestern印迹
使用从大肠杆菌k12提取的蛋白进行western印迹。蛋白样品(10μg)在处于tris-甘氨酸缓冲液中的20％丙烯酰胺sds凝胶上分离并转移到硝基纤维素膜(gehealthcare,奥尔赛，法国)上，用tbs(10mmol/ltris,ph8；150mmol/lnacl)加0.05％(w/v)tween20中的5％(w/v)脱脂奶粉在rt将其封闭至少1h。然后，将所述膜在4℃与兔多克隆抗-大肠杆菌clpb抗体(1:2000,delphigenetics)孵育过夜。用在tbs/0.05％tween20中的5％(w/v)脱脂奶粉封闭溶液中洗涤3次后，将膜与过氧化物酶缀合的抗兔igg(1:3000,santacruzbiotechnology)孵育1h。3次洗涤后，使用ecl检测试剂盒(gehealthcare)将过氧化物酶反应显色。将蛋白条带与分子量标准(precisionplus,biorad)进行比较，并且使用imagescanneriii(gehealthcare)扫描薄膜，并使用imagequanttl软件7.0(gehealthcare)分析条带像素密度。
大肠杆菌蛋白在大鼠中的肠给药
动物
动物看护和试验依照由美国国立卫生研究院所建立的指导方针并且遵守法国和欧洲共同体规章(officialjournaloftheeuropeancommunity(欧共体官方杂志)l358,18/12/1986)。将雌性sprague-dawley大鼠，体重200-250g(janvier,genest-saint-isle,法国)在规定的环境条件(22±1℃,12h光暗周期，在7:30a.m.开灯)下在装备齐全的动物设施中的固定笼(3只大鼠/笼)中保持1周以便使它们适应于居住条件。可随意获得标准颗粒啮齿动物饲料(rm1膳食，sds,uk)和饮用水。
试验#1
此实验设计为评价我们的大肠杆菌生长体外模型与肠道内细菌生长的体内情况的相关性。大鼠通过氯胺酮(75mg/kg,virbac,carros,法国)/甲苯噻嗪(5mg/kg,bayer,leverkusen,法国)溶液，3:1vol.，0.1ml/100g体重腹腔注射进行麻醉。剖腹术后，通过做两个结扎游离结肠：第一个在盲肠结肠连接处，第二个在下方4cm。使用插入到升结肠中并用第一个结扎固定的聚丙烯导管进行结肠灌注和腔内容物采样。2mlmh培养基或水轻轻地输注到结肠中，之后立即取出用于测量od。在od测量后，将结肠内容物的整个样品返回至结肠中。在不添加新的mh培养基或水的条件下，在前20min期间每5分钟并且然后在30min时和60min时重复结肠内容物的这种采样。细菌密度通过分光光度计测量为在λ＝600nm的od。在第一次灌注前以及灌注后30和60min从门静脉取血样。在试验结束时从结肠取粪便样品用于dna提取和clpb的pcr。
实时定量聚合酶链式反应
使用cfx96q-pcr仪(biorad,ca)进行定量pcr(qpcr)以分析表达clpbdna的细菌的细菌密度。使用qampdna粪便微型试剂盒(qiagenvenlo,荷兰)从大鼠粪便提取总dna。qpcr混合物包含5μlsybrgreenmaster(qiagen,westsussex,uk)、0.5μm每种正向和反向引物、来自样品的dna以及水，达到总体积10μl。引物购自invitrogen(cergy-pontoise,法国)。三步pcr进行40个循环。样品在95℃变性10min，在60℃退火2min，并在95℃延伸15s。
试验#2
本实验目的是评价大肠杆菌蛋白对体循环中的肠肽(glp-1和pyy)释放的作用。如上所述将大鼠麻醉并游离结肠，在指数期(n＝6)或在静止期(n＝6)中提取的大肠杆菌蛋白(在2mlpbs中的0,1μg/kg蛋白)的结肠灌注进行一次持续20min。在结肠灌注20min前后从门静脉取血样用于测定glp-1、pyy和clpb。在试验结束时取结肠粘膜的样品用于clpb测定。使用荧光酶免疫测定试剂盒(phoenixpharmaceuticalinc.,ca)根据生产厂商的说明书进行glp-1和pyy测定。使用酶标仪变色龙(microplatereaderchameleon)(hidexinc.,图尔库,芬兰)在325nm激发和在420nm发射测量荧光。
大肠杆菌蛋白在大鼠中的给药、进食和脑c-fos研究
动物
雄性wistar大鼠，体重200-250g(janvier,genest-saint-isle,法国)如上所述适应居住条件和饲养。试验前三天，将大鼠转移至单个代谢笼(tecniplast,里昂，法国)，在代谢笼里它们随意进食相同的但是为粉末形式(sds)的rm1饮食。饮用水随时可用。在适应期期间每天轻轻地触摸大鼠几分钟以便使它们习惯于操作。在适应结束时，将大鼠分成三个组以达到相似的平均体重并且在试验1-3中使用。在相同的大鼠中以4天的间隔进行包括限制进食的两个试验。在自由摄食的大鼠中进行的第三个试验涉及它们的新的系列。
试验#1
第一个试验目的是比较在指数期和静止期中提取的大肠杆菌膜蛋白的作用。大鼠禁食过夜(18.00h-10.00h)，而水可随意饮用。在禁食后的第二天，大肠杆菌蛋白在10.00h腹腔注射并立即将大鼠返回至它们的代谢笼，代谢笼包含预先称重的量的食物。在1、2和4h时测量进食。第一组大鼠(n＝6)接受处于300μlpbs中的0.1mg/kg从指数期大肠杆菌提取的膜蛋白；第二组大鼠(n＝6)接受0.1mg/kg从静止期大肠杆菌提取的膜蛋白并且对照组(n＝6)接受300μlpbs。
试验#2
第二个试验目的是比较在指数期和静止期提取的大肠杆菌细胞质蛋白的作用。使用与试验#1相似的试验规程。
试验#3
本试验被设计用来评价总大肠杆菌蛋白对自由摄食大鼠的进食的作用。在指数期(n＝6)或在静止期(n＝6)提取的大肠杆菌蛋白(处于300μlpbs中的0.1mg/kg蛋白，i.p.)或作为对照的仅pbs(n＝6)的注射在19.30h进行，并且使动物返回至它们的代谢笼，代谢笼包含预先称重的量的食物。在2h后测量累积进食。之后立即，通过戊巴比妥钠(0.2mg/kg,i.p.)麻醉大鼠并灌注用于脑中c-fos表达的免疫组化研究。
组织准备和免疫组化
通过在4％多聚甲醛中灌注/浸泡固定脑、冷冻并在低温恒温器(leicamicrosystems,南泰尔,法国)上切割(14μm)，然后使用酪胺信号放大(tsa)加上荧光素试剂盒(nen,boston,ma)处理用于免疫组化。对于单一染色，使用针对c-fos的兔多克隆抗血清(1:4,000,ab-5,calbiochem,merckkgaa,达姆施塔特,德国)。对于双重染色，在tsa后，使用兔抗β-内啡肽(β-end)单克隆抗体1:1,000(lifetechnologies,frederick,md)或鼠抗降钙素基因相关肽(cgrp)单克隆igg1:1,000(santacruzbiotechnology,inc.,tx)应用直接免疫荧光技术，兔抗β-内啡肽(β-end)单克隆抗体由抗兔花菁-3抗体1:200(jacksonimmunoresearch,westgrove,pa)显影，鼠抗降钙素基因相关肽(cgrp)单克隆igg由抗鼠玫瑰红缀合的抗体1:200(jacksonimmunoresearch)显影。在下丘脑弓状核和腹内侧核中以及在杏仁核的中央核中，阳性细胞在x20放大倍数下从6个连续切片计数。每只大鼠阳性细胞的平均数目用来计算组平均值。在adobephotoshop6.0软件(adobesystems,sanjose,ca)中优化数字图像的亮度和对比度。
大肠杆菌蛋白在小鼠中的长期给药
2月龄雄性c57bl6小鼠(n＝32)购自janvierlabs并且利用12h光暗周期，在8:00开灯来适应动物设施持续1周。然后，将小鼠单个地置于biodaq鼠笼(researchdiets,inc.,newbrunswick,nj)中，每个鼠笼装有自动取食监测器。适应biodaq笼3天后，将小鼠分成三个组(n＝8),每个组接受不同的治疗，所述不同的治疗由采用下列任一项在9:00和在18:30每天两次腹膜注射：(i)pbs,(ii)在指数期提取的细菌蛋白(0,1mg/kg体重),(iii)在静止期提取的细菌蛋白(0,1mg/kg体重)。食物(serlab,蒙塔泰尔,法国)和饮用水随意摄取并且每天测量体重。连续监测进食数据一周，并且使用biodaqdataviewer2.3.07(researchdiets)分析。对于进餐模式分析，餐间间隔设定为300s。饱感比率计算为餐后间隔时间除以在前一餐中消耗的食物量(g)。试验后，通过断头术处死小鼠；移除脑，并且切下下丘脑用于神经肽mrna微阵列。
下丘脑神经肽mrna微阵列
使用
电生理记录
如前所述(fioramonti等人,2007)从成年pomc-egfp小鼠(5-7周龄；ref:c57bl/6j-tg(pomc-egfp)1low/j,thejacksonlaboratory)制备脑切片(250μm)。切片在rt在含有(以mm计):118nacl、3kcl、1mgcl2、25nahco3、1.2nah2po4、1.5cacl2、5hepes、2.5d-葡萄糖(用蔗糖将克分子渗透压浓度调整至310mosm，ph7.4)的含氧胞外培养基中孵育至少60min的恢复期。一旦处于记录室中，用相同的胞外培养基以2-3ml/min灌注切片。用配备用于荧光(荧光素滤光片)和ir-dic视频显微镜的nikon显微镜ef600(nikonfrance,champignysurmarne)观察切片。使用x40水浸物镜(nikon)与荧光摄像机(nikon)可视化有活力的arcpomc神经元。硼硅酸盐移液管(4-6mω；1.5mmod,sutterinstruments,novato,ca)充满经过滤的胞外培养基。细胞贴附记录使用multiclamp700b放大器获得，使用digidata1440a接口数字化并且使用pclamp10.3软件(axoninstruments,moleculardevices,sunnyvale,ca)以3khz采集。移液管和电池电容被全补偿。在建立稳定的基线后，1nmclpb(delphigenetics)灌注5-10分钟。在clpb灌注的最后3min内、灌注后7-10min测量pomc神经元的触发速率并且与灌注前3min测量的触发速率相比较。
统计分析
分析数据并使用graphpadprism5.02(graphpadsoftwareinc.,sandiego,ca)进行绘图。通过科尔莫格罗夫-斯米尔诺夫(kolmogorov-smirnov)检验评价正态性。根据正态性结果，组间差异通过方差分析(anova)或非参数克鲁斯卡尔-沃利斯(k-w)检验与tukey或dunn事后检验进行分析。在适当的时候，根据正态性结果，使用学生t检验和皮尔逊相关性检验或曼-惠特尼(m-w)检验比较单个组。使用重复测量(rm)anova和邦弗朗尼(bonferroni)事后检验分析连续试验的作用。数据表示为均值±均值的标准误(s.e.m),并且对于所有检验，p<0.05被认为是统计学显著的。
结果
定期营养素提供后的大肠杆菌生长
在第一次向大肠杆菌培养物提供müeller-hinton(mh)营养培养基后，观察到细菌生长的三个期：1)2h的停滞期；2)4h的指数生长期和3)0.35光密度(od)保持稳定6h的静止期。在第3次和第5次mh培养基供应后，仅发现两个生长期：指数期和静止期，第一期在提供营养素后立即开始。每个新的进食周期表位为较短持续时间的指数生长期：第3次提供后2h，和第5次提供后20min。第5次提供营养素后，提取细菌蛋白并将其分离成膜级分和细胞质级分，用于蛋白质组分析和禁食大鼠中的体内试验。在新的试验中，为了验证继续定期提供营养素是否可以进一步加速细菌生长的动力学，向大肠杆菌k12供应营养素9次。我们发现，在第7次和第9次提供营养素后，指数生长期不进一步改变，持续20min，od有相同的(δ0.3)相对增加，反映了在每次供应营养素后相同的细菌生长。根据mcfarland标准，0.3od的增加对应于108-109的细菌增量。在第9次提供营养素后，在指数期和静止期提取细菌蛋白，显示总蛋白浓度分别为0.088mg/ml和0.15mg/ml。对提取的蛋白测试clpb水平，并且已经用于atp生成测定中以及用于体内试验包括在自由摄食的小鼠和大鼠中结肠内灌注和体内注射，接着脑中的c-fos检测。
蛋白质组分析
为了分析蛋白表达谱是否根据营养素诱导的细菌生长期而变化，分别对在第5次添加mh培养基后10min和2.3h(分别对应于指数期和静止期)提取的大肠杆菌k12蛋白的膜级分和细胞质级分进行二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2d-page)。检测到的蛋白斑点的总数目为2895个(1367个膜和1528个细胞质)。
指数期和静止期之间膜蛋白的2d-page的比较揭示了20种差异表达(相差至少1.5倍)的蛋白。在它们中，17种蛋白显示在指数期中表达增加，且15种通过质谱法鉴定。细胞质蛋白的2d-page的比较显示了20种差异表达(相差至少1.5倍)的蛋白。与膜蛋白相反，大多数细胞质蛋白(19种)表明在静止期期间表达增加。仅一个蛋白斑点(对应于鞭毛蛋白)在指数期中具有较高的表达。大多数鉴定到的蛋白涉及合成代谢或分解代谢过程，显示了在两个生长期中的总体上混合的代谢谱。
体外通过大肠杆菌蛋白产生atp
为了研究细菌蛋白质组是否在生长期期间改变可能影响它们的能量提取容量，在体外测试由指数期和静止期的大肠杆菌k12蛋白从营养素产生atp。我们发现来自两个生长期的蛋白能够从不同的能量来源增加atp产生。与蔗糖溶液相比，当使用含蛋白的混合能量源诸如mh培养基时atp浓度较高。atp产生随着细菌蛋白浓度增加剂量依赖性地增加，然而在来自指数期或静止期的蛋白的atp产生效应之间没有发现显著的差异。
体外大肠杆菌产生clpb
我们开发并验证了用于检测大肠杆菌clpb的酶联免疫吸附测定(elisa)，该测定已经用于本研究中。在4个单独的大肠杆菌k12培养物中研究在细菌生长期之间clpb蛋白产生是否不同。western印迹检测到所有在静止期期间具有增加水平的蛋白制剂中都有对应clpb的96kda条带。这些改变进一步在相同的细菌蛋白制剂中使用clpbelisa证实，表明在静止期中clpb浓度几乎加倍。
营养素和大肠杆菌蛋白的肠灌注
为了验证我们的营养素诱导的大肠杆菌生长的体外模型是否与体内肠道细菌生长动力学相关，将mh培养基或水输注到被麻醉的大鼠的结肠中。我们发现mh培养基而非水的输注诱导肠道中细菌增殖的指数生长期持续20min，与体外数据一致。门静脉中测量的血浆clpb水平在mh输注后30或60min没有显著差异。尽管如此，血浆clpb浓度与粪便中的clpbdna含量正相关。
下一步，为了确定大肠杆菌蛋白质组的生长依赖性变化是否可以影响宿主肠道中局部食欲控制的机制，在单独的试验中，经麻醉的大鼠接受20min来自指数期或静止期(均以0.1mg/kg)的大肠杆菌蛋白的结肠输注。在接受静止期蛋白的大鼠中在输注后20min测量的结肠粘膜中的clpb浓度较高，然而clpb的血浆水平不受来自指数期或静止期的细菌蛋白影响。与我们的假设(大肠杆菌蛋白对宿主食欲信号传导的作用可能取决于细菌生长期)一致，我们发现来自指数期而非静止期的大肠杆菌蛋白的结肠灌注刺激glp-1的血浆水平，并且相反，在输注来自静止期而非指数期的蛋白后检测到pyy的血浆水平升高。
在大鼠中急性大肠杆菌蛋白给药后的进食和脑c-fos
因为clpb存在于所有测试的大鼠和小鼠的血浆中，因此有可能血浆大肠杆菌蛋白可以通过它们的全身作用来影响食欲并且这样的效应对于与细菌生长期相关的蛋白可以是不同的。通过在禁食过夜的大鼠中测试这种可能性，我们发现与对照组相比，单一腹膜内(i.p.)给药(0.1mg/kg体重)在静止期提取的大肠杆菌蛋白的膜级分减少了再喂食期间的1h-和2h-进食，相比，给予在指数期提取的大肠杆菌蛋白(0.1mg/kg体重,i.p.)的细胞质级分增加了再喂食期间的4h进食。
为了进一步调查大肠杆菌总蛋白是否可以以生长期依赖性的方式影响自发进食，并且激活中枢部位诸如arc，用细菌蛋白(0.1mg/kg体重,i.p.)在暗期开始之前注射自由摄食的大鼠。在注射后2h测量进食，然后处死大鼠用于分析脑中的c-fos表达。我们发现用来自静止期的细菌蛋白注射的大鼠吃的比对照少，而来自指数期的细菌蛋白的注射不显著地影响进食。
在向自由摄食的大鼠腹腔注射大肠杆菌蛋白后2小时，免疫组化分析下丘脑的arc和腹内侧核(vmn)中以及cea中的c-fos表达。发现接受来自静止期的细菌蛋白的小鼠的arc和vmn中c-fos-阳性细胞的数目增加。arc中大多数表达c-fos的细胞含有β-内啡肽(对照，71.31±12.81％,大肠杆菌指数期，73.56±10.45％,大肠杆菌静止期，80.50±9.68％,anovap＝0.36),即被鉴定为厌食pomc神经元。因此，arc中剩余的c-fos神经元的百分比在组间的差异不显著(对照,28.69±12.81％,大肠杆菌指数期,26.44±10.45％,大肠杆菌静止期,19.5±9.68％,anovap＝0.36)。尽管β-内啡肽阳性细胞的总数目在组间的差异不显著(对照，54.82±10.67个细胞，大肠杆菌指数期,66.03±11.43个细胞，大肠杆菌静止期,66.03±5.06个细胞，anovap＝0.09),但与对照和接受指数期蛋白的大鼠相比，在接受静止期蛋白的大鼠中激活的β-内啡肽神经元的相对数目增加。此外，激活的β-内啡肽神经元的数目与进食负相关(pearson’sr＝-0.57,p＝0.018)。
在cea中，与其他两组相比，在用来自静止期的蛋白注射的大鼠中c-fos-阳性细胞的数目增加。cea中几乎所有c-fos-阳性细胞的表型被确定为表达cgrp的神经元(对照,100±0.01％,大肠杆菌指数期,100±0.01％,大肠杆菌静止期,100±0.01％,anovap＝0.92)。尽管cea中cgrp-阳性神经元的总数目在组间是相似的(对照,123.8±13.15个细胞，大肠杆菌指数期,118.3±25.59个细胞，大肠杆菌静止期,126.1±6.64个细胞，anovap＝0.85)，但c-fos激活的cgrp神经元的百分比仅在接受静止期蛋白的大鼠中增加。cgrp神经元的激活与进食负相关(pearson’sr＝-0.89,p＝0.001)。
在小鼠中长期注射大肠杆菌蛋白后的进食模式和下丘脑神经肽
为了确定细菌蛋白是否可以影响进食模式，向自由摄食的小鼠每天两次注射大肠杆菌总蛋白(0.1mg/kg体重,i.p.)持续1周。注射后第一天的特点是与对照相比在接受来自静止期而非指数期的细菌蛋白的小鼠中体重和进食显著减少。尽管每天的摄食量在组间差异不显著，但在接受静止期蛋白的小鼠中1周后观察到相对于注射前一天减少。尽管在接受来自静止期的细菌蛋白的小鼠中观察到有增加的趋势，但进餐频率在组间差异不显著。尽管在注射6天期间在3组间总进食差异不显著，但单独地对光周期和暗周期进行分析表明用指数期蛋白注射的小鼠在光周期期间进食增加，而在暗周期期间进食减少。相反，接受静止期蛋白的小鼠在暗周期中的进食表现出少于对照，而在光周期中没有任何影响。在注射后第一天期间，在接受来自静止期的蛋白的小鼠中饱感比率是增加的，并且1周后同一组显示减少的趋势。
为了了解在注射细菌蛋白6天后观察到的改变的进食模式的分子改变基础，我们分析了参与食欲控制的几种神经肽的下丘脑mrna表达水平。我们发现与对照相比，接受静止期蛋白的小鼠显示脑来源的神经营养因子(bdnf)和食欲肽的前体mrna水平升高，并且与用指数期蛋白注射的小鼠相比促肾上腺皮质激素释放激素(crh)的前体mrna水平升高，用指数期蛋白注射的小鼠也显示升高的bdnf水平而qrfp水平降低。
clpb电生理激活下丘脑pomc神经元
为了确定作为在静止生长期中上调的大肠杆菌蛋白的标志物和α-msh的模拟物的clpb是否激活arcpomc神经元，在来自pomc-egfp小鼠的脑切片上使用细胞贴附的膜片钳电生理检验clpb作用。施加clpb(1nm)浴将～50％的arcpomc神经元(n＝7/13)的动作电位频率增加229±109％(基础：2.02±0.78hzvs.clpb:3.82±1.36hz)。通常，pomc神经元直至clpb施用后至少10min才完全地恢复到其基础触发速率。
讨论
我们的研究揭示了细菌蛋白可以地将肠道细菌与宿主的食欲控制生理性联系起来，包括分别与营养素诱导的肠道中细菌生长和它们的全身效应相关联的其短期和长期机制两者。下面的主要结果支持了这种结论：1)营养素的定期提供加速和稳定大肠杆菌的指数生长持续20min,与体内数据一致；2)大肠杆菌静止生长期的特点是增加的总细菌蛋白含量和不同的蛋白质组谱，包括增加的clpb；3)来自两个生长期的大肠杆菌蛋白在体外剂量依赖性地刺激atp产生；4)clpb的血浆水平在营养素诱导的肠道中细菌生长后不改变，但与肠道菌群中的clpbdna相关联；5)来自指数生长期和静止生长期的大肠杆菌蛋白的肠灌注分别刺激血浆glp-1和pyy。6)大肠杆菌蛋白的体内注射仅在注射来自静止期的蛋白时显著地减少进食，伴有厌食arc和cea神经元中的c-fos激活，以及最后7)clpb刺激arcpomc神经元的触发速率。
定期提供营养素和细菌生长
在定植于人胃肠道的广泛细菌中，大肠杆菌是丰度最高的兼性厌氧菌，证明了其作为共生肠道细菌的模式生物的合理性(foucault等人,2009)。在此，我们发现在定期供应营养素期间大肠杆菌改变了其生长动力学，在第五个摄食周期后导致立即的指数生长持续20min，紧接着是静止期。然后在下一次提供营养素后相同地重现了该生长周期，表明其可以扮演对细菌机制内在设定的起搏器的角色。在大鼠结肠中观察到相似的响应于营养素输注的细菌生长动力学，支持了我们的体外数据可以与体内情形相关，例如，在规律进餐的人中。在每一次新的提供后108-109的细菌数目增量保持稳定，表明细菌生物质相应稳定的产生，包括肠道中蛋白含量增加，可以扮演宿主的进餐诱导的调节因子的作用。鉴于人中的平均正餐阶段类似于定期饲养的细菌的指数生长的持续时间，可推测宿主饱感可以被到达静止期(接触摄入的营养素后20min)的肠道细菌所触发。然而，胃肠道中的细菌含量范围为胃中的103至结肠中的1012。而且，摄入的营养素需要约2h前进通过胃和小肠，并且需要约10h通过大肠。因为至大多数肠道细菌的营养素递送被这样延迟，有可能除了与营养素团直接接触以外，正餐阶段期间的细菌生长可能也被释放到肠腔中的营养素通过对摄食的巴甫洛夫脑反射来启动。
在生长期期间的细菌蛋白表达和肠道传感
因为定期饲养的大肠杆菌的生长动力学可以与宿主正餐阶段和正餐后阶段相关联，我们研究了细菌蛋白的表达是否可以潜在地将肠道细菌与宿主的食欲控制联系起来。首先，我们比较了处于指数生长期与静止生长期的大肠杆菌的蛋白质组。为了此分析，在指数期的中间，即提供营养素后10min，以及在2h后的静止期(正常以感觉到饱感为特征的时间)提取大肠杆菌蛋白。在两个生长期之间至少有40种差异表达的蛋白的发现证实了它们不仅通过蛋白含量定量上不同(在细菌增殖后几乎加倍)，而且性质上也不同。已经研究了改变的蛋白表达谱与宿主的食欲控制的可能相关性：i)通过比较细菌蛋白生成能量底物的能力，和ii)通过确定细菌蛋白对食欲调节途径的可能直接效应。对大肠杆菌clpb的最新蛋白质组鉴定支持了作为α-msh的构象蛋白模拟物的最新可能性(tennoune等人,2014)；所述数据验证我们的较早假设，即展现的表位与厌食肽或促进食欲的肽同源的肠道细菌蛋白可能负责产生交叉反应性抗体(fetissov等人,2008)。因此，可想到这样的细菌模拟蛋白的组合可能直接影响食欲，其取决于与细菌生长期相关的蛋白表达谱。通过分析大肠杆菌培养物和肠粘膜，我们发现clpb水平增加与静止生长期相关。因此，增加的clpb可能促进营养素诱导的大肠杆菌增殖后的厌食途径的激活，以及增加的细菌蛋白产生。重要的问题是细菌蛋白诸如clpb,可以作用于食欲调节途径。
尽管细菌蛋白存在于肠粘膜中(haange等人,2012),但它们跨越肠道屏障的通路还没有被广泛研究(lim和rowley,1985)。理论上，在肠道中自发的和诱导的细菌溶解(rice和bayles,2008)后，细菌成分可以通过肠神经系统调节，通过在肠上皮细胞中吸收和通过旁细胞扩散跨越粘膜上皮屏障(neunlist等人,2012)。例如，在革兰氏阴性细菌的溶解后释放的脂多糖(lps)天然地存在于健康人和小鼠的血浆中，在进食高脂饮食后具有更高的基础水平(cani等人,2007)。lps血浆水平在正餐后也升高(harte等人,2012),但关于细菌蛋白没有这样的数据。在此我们证明在肠道中细菌增殖后或在肠道输注细菌蛋白后在大鼠中血浆clpb水平保持稳定。这指示血浆clpb,以及更可能存在于血浆中的其他细菌蛋白并不剧烈地受营养素诱导的细菌增殖的影响，并且因此，它们可能不参与向大脑的短期饱感信号传导。
尽管如此，血浆clpb浓度与肠道菌群中的clpbdna相关联，提示产生clpb的细菌的数目(长期来看应当相对地独立于与营养素驱动的细菌生长相关的该细菌数目波动)，可以是负责长期保持血浆clpb水平的主要因素。这个结论进一步得到我们的数据支持，我们的数据为验证clpbelisa而获得，显示在长期用大肠杆菌管饲的小鼠中血浆clpb浓度增加，而在接受clpb-突变的大肠杆菌的小鼠中不增加。因此，有可能存在于血浆中的肠道细菌蛋白，包括clpb，可以起作用系统性地将肠道菌群的组成与能量代谢的长期控制联系起来。
大肠杆菌蛋白对体外atp产生的作用
通过食物链的能量交换代表了所有生物体之间的通用联系(yun等人,2006)。来源于细菌和动物两者中的营养素分解代谢的atp充当合成代谢过程的主要能量底物。当atp水平低时动物可以通过腺苷-5'-一磷酸-激活的蛋白激酶(ampk)的活性感测atp的变化，导致增加的进食，反之亦然(dzamko和steinberg,2009)。因此，在本工作中，我们比较了处于指数期和静止期的大肠杆菌蛋白在体外生成atp的能力。实际上，许多鉴定的蛋白展示出合成代谢或分解代谢特性。我们发现大肠杆菌蛋白能够刺激体外atp-产生，提示它们可以在肠道中细菌溶解后继续催化atp产生。尽管在来自指数期和静止期的蛋白之间没有发现产生atp的能力有差异，但细菌蛋白浓度依赖性atp产生表明在营养素诱导的细菌增殖后细菌蛋白含量增加应当导致更高的atp合成。以前已经通过比较肥胖的和瘦的人和小鼠建立了肠道菌群为宿主代谢采集能量的效率的相关性(turnbaugh等人,2006)。我们的数据通过证明大肠杆菌蛋白生成atp的能力进一步证实了这些结果。还提示进餐诱导的细菌增殖可以导致增加的肠atp，这应当有助于对能量利用率的腔内感测以及肠道松弛(glasgow等人,1998)。
大肠杆菌蛋白对饱腹激素的肠效应
下一步，我们研究肠道中的大肠杆菌蛋白是否可以刺激肠道饱腹激素诸如glp-1和pyy的全身释放(adrian等人,1985；batterham等人,2002；beglinger和degen,2006；flint等人,1998)。事实上，两种激素都由在肠内遍布存在并在结肠中富含的相同的或不同的肠内分泌l-细胞产生(eissele等人,1992),并且因此，l-细胞直接暴露于细菌蛋白。我们发现了大肠杆菌蛋白对glp-1和pyy释放的差别效应，证明来自指数生长期的蛋白对glp-1的刺激和来自静止生长期的蛋白对pyy的刺激。这些结果表明了营养素诱导的细菌生长和已知的进餐诱导的glp-1和pyy释放动力学之间的一些相似性。事实上，如在人中所示的那样，血浆glp-1的锐峰在胃内输注液体餐后15min出现，而持续时间更长的升高的血浆pyy在餐后15-30min之间开始(edwards等人,1999；gerspach等人,2011)。glp-1的较长时间释放与摄入脂肪有关(vanderklaauw等人,2013)。因此，定期饲养的肠道细菌的生长动力学在时间上符合glp-1和pyy释放的动力学，提示肠道细菌，特别是大肠杆菌蛋白在进餐诱导的肠饱感信号传导中的诱导性地位。来自指数期的大肠杆菌蛋白刺激glp-1的差别效应有可能反映了glp-1在血糖控制中的肠降血糖素地位(edwards等人,1999；steinert等人,2014)。最近证明了由l-细胞表达的功能性mc4r(panaro等人,2014),为它们可能被α-msh-模拟细菌蛋白激活提供了背景知识。与增加的血浆pyy水平相关的大肠杆菌静止期期间的clpb产生增加以及肠粘膜中升高的clpb水平，提示clpb在结肠中产生pyy的l-细胞的激活中具有直接作用。从另一方面，迄今为止在指数生长期期间可能上调的未鉴定的大肠杆菌蛋白可能优先地刺激glp-1分泌。
大肠杆菌蛋白对进食和食欲调节大脑途径的全身效应
我们在此证明向饥饿的或自由摄食的大鼠以及自由摄食的小鼠外周注射大肠杆菌蛋白根据大肠杆菌的生长期而改变它们的进食。考虑到血浆clpb不受肠输注营养素影响而是在短时间内稳定，细菌蛋白的全身作用应当被解释为与它们对食欲的长期调节效应相关。此外，因为指数期很短的持续时间，在持续时间长的静止期期间上调的细菌蛋白应当在血浆中占优势，并且因此，它们的全身给药可以更好地代表生理情况。在这些试验中使用的0.1mg/kg浓度的大肠杆菌蛋白与在人或啮齿动物中外周给药后肽激素诸如瘦素和pyy的有效饱感产生剂量相似(batterham等人,2002；halaas等人,1995；heymsfield等人,1999)。
在给予来自指数期的细胞质蛋白后观察到在光周期中再摄食期间在饥饿大鼠中进食增加以及给予来自静止期的膜蛋白后进食减少。本试验证实来自同一细菌的不同蛋白混合物能够通过它们的全身作用增加或减少进食。然而，在更加生理性的环境下，通过在暗周期测试总大肠杆菌蛋白在自由摄食的大鼠中的效应，仅观察到由来自静止期的蛋白所诱导的进食减少。
在自由摄食的小鼠中重复注射的结果进一步支持了大肠杆菌蛋白促进负能量平衡的地位。事实上，第一天的细菌蛋白注射伴随着进食和体重的减少，在接受静止期蛋白的小鼠很明显，并且其特征还在于增加的饱感比率。尽管此后在这些小鼠中的进食被标准化，摄食量的进行性减少伴随着进餐频率的增加，最可能作为维持进食的代偿机制(meguid等人,1998)。另外地，在光周期和暗周期期间观察到大肠杆菌蛋白的差别效应。因此，在下丘脑中调节食欲的神经肽的mrna表达的模式显示了激活厌食和促进食欲途径两者的混合反应。值得注意的是，两组接受大肠杆菌蛋白的小鼠显示出相似的bdnfmrna增加，其为vmn中mc4r下游的厌食途径(xu等人,2003)。此途径可以成为在两组中观察到的暗周期期间的进食减少的基础，并且进食减少在用指数期蛋白注射的小鼠中进一步加重，显示了较低水平的促进食欲的qrfp(chartrel等人,2003)和npy(herzog,2003)。相反，接受来自静止期的细菌蛋白的小鼠展示出增强的厌食曲线，具有升高水平的crhmrna，最可能涉及表达mc4r的pvn神经元(lu等人,2003)。在注射6天后在这些小鼠中，这些改变结合刺激进餐频率的食欲肽a的mrna前体表达增加(baird等人,2009)，可以分别有助于摄食量和饱感比率的减少。
与我们的假设(即，在静止期期间产生的细菌蛋白可以激活一些关键的中枢厌食途径)一致，我们发现在自由摄食的大鼠中，厌食arcpomc神经元以及vmn中c-fos的表达增加，vmn长时间以来已知作为饱感中心并且与arcpomc神经元互相联系(sternson等人,2005)。获得的c-fos模式类似于摄食期间产生饱感的反应的模式(johnstone等人,2006)或被饱腹激素诸如pyy或胰多肽诱导产生饱感的反应的模式(batterham等人,2002；challis等人,2004；lin等人,2009)。相对小数目(～10％)的c-fos-激活的pomc神经元提示循环的大肠杆菌蛋白可以经由此下丘脑途径发挥作用对食欲和体重具有调节效应。尽管确定通过npy/agrp神经元激活c-fos是不可行的，但它们对由细菌蛋白引起的信号传导的贡献不能被排除；这些神经元还表达mc3r和mc4r(mounien等人,2005)。此外，在ceacgrp神经元中比arcpomc更强激活c-fos(～40％)可以表示来自arcpomc和npy/agrp神经元以及可能来自其他调节食欲的脑区的会聚的下游作用，所述其他调节食欲的脑区在此没有分析，诸如孤束的核。
最后，为了确定细菌蛋白激活调节食欲的脑部位诸如arcpomc神经元是否可以通过它们的局部作用来引起，我们研究了对这些神经元施用clpb是否可以激活它们的电活动。我们的结果显示大约一半的所研究的神经元的动作电位频率增加，保持激活状态持续至少10min。clpb的持续效应与α-msh对表达功能性mc3r和mc4r的pomc神经元的作用相符(smith等人,2007)，提示clpb可以是下丘脑pomc神经元的生理激活物，有些类似于产生饱感的pyy和瘦素(batterham等人,2002；cowley等人,2001)。然而，我们不知晓clpb是否能够直接激活或经由局部网络激活pomc神经元。
总之，这些数据支持其表达在静止生长期中增加的全身存在的大肠杆菌蛋白，诸如clpb，在经由激活脑厌食途径促进负能量平衡中的地位。也提示导致大肠杆菌以及可能来自肠杆菌科家族其他细菌的低或高丰度的微生物群组成的改变，可能分别以正向或负向的方式影响宿主能量平衡。
实施例2
1月龄雄性c57bl6小鼠(janvierlaboratories)如上所述适应动物设施1周并维持饲养。小鼠如下分成3组：(i)用108大肠杆菌k12细菌管饲；(ii)用108clpb缺陷型大肠杆菌k12细菌管饲；(iii)和不接受任何治疗的对照。在berndbukau’slaboratory(zmbh,海德堡大学,海德堡，德国)中生成clpb突变菌株，并且该菌株以及相应的野生型(wt)大肠杆菌5由draxelmogk馈赠。将小鼠单个地置于biodaq笼(researchdiets)并且每天在暗周期开始之前用0.5ml含有细菌的lb培养基经胃内管饲持续21天。与不表达clpb蛋白的细菌相反，在接受wt大肠杆菌的小鼠中第一天管饲伴有体重和进食的减少(图1)。
参考文献
在整个此申请中，多篇参考文献描述了本发明所属的技术领域的状态。这些参考文献的公开在此通过引用合并到本公开中。
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