本发明涉及疫苗技术领域，进一步涉及疫苗的制剂技术，具体涉及一种用于TGEV、PEDV二联冻干活疫苗的耐热保护剂、其制备方法及应用。
背景技术：
猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenenteritis virus，TGEV)引起的一种高度接触性肠道传染病，以引起2周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻、脱水和高死亡率为主要特征。猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的猪的一种急性接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻、食欲下降和脱水为基本特征，各种年龄的猪均易感。猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻是引起猪腹泻的主要病毒性疾病，二者的临床症状和病理变化十分相似，在猪场的流行相当普遍，常呈混合感染，给养猪业造成巨大的损失。TGEV和PEDV虽均属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，但二者的抗原性存在明显差异。TGEV和PEDV的抵抗力不强，TGEV在冷冻存储条件下稳定，但耐热性能差，在室温及室温以上不稳定，对光敏感，PEDV病毒在60℃30min可失去感染力。
疫苗是预防猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的重要手段，鉴于这两种传染病均属于猪类易感疾病、传染性及爆发风险突出，因此现有技术中常以二联疫苗进行免疫接种。目前，我国商品化的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联疫苗主要有灭活疫苗和和弱毒疫苗。由于灭活疫苗往往不能诱导肠道免疫，弱毒疫苗需要较大的剂量才能诱导肠道免疫，达到更好的免疫保护效果。因此开发高效的二联活疫苗具有较好的市场应用前景。
冻干粉针是疫苗的一种常用剂型，由于冻干工艺涉及物相的改变，而液体原料药在结晶过程中可能导致活性成的破坏，因此在疫苗的冻干过程中普遍添加冻干保护剂，从而在一定程度上保护抗原活性。常规活疫苗通常使用蔗糖明胶作为冻干保护剂，在-15℃以下保存不超过24个月，2～8℃条件下保存不超过12个月。为进一步提升疫苗的热稳定性、延长有效期，现有技术中开发了具有耐热促进作用的冻干保护剂(简称为耐热保护剂)，现已广泛应用于活疫苗制备技术中。
现有技术中，按分子量水平可将耐热保护剂分为低分子量化合物、高分子量化合物以及天然混合物。低分子量化合物，又分为酸性物质、中性物质和碱性物质；高分子化合物主要包括白蛋白、明胶、蛋白胨、可溶性淀粉、糊精、肉汁、果胶、羟甲基纤维素等；天然混合物主要包括脱脂牛奶、血清等。此外，依据功能和性质可将耐热保护剂分为填充剂、防冻剂、抗氧化剂、酸碱调整剂、缓冲剂、羟基中和剂。由此可见，耐热保护剂的选择面较为宽泛，并无统一的规格，而是需要依据抗原特性、冻干条件以及疫苗使用环境进行具体设计，尤其在多联疫苗中，由于抗原物质不唯一，因此需要综合考虑多种抗原对环境的耐受性。对于TGEV、PEDV二联活疫苗而言，一方面其抗原物质是活病毒，因此为了保证抗原活性对疫苗添加剂的选择相对苛刻；另一方面，上述两种病毒的耐热能力均较差，而温度耐受范围又存在差异，因此针对该疫苗耐热保护剂的开发较为困难。
技术实现要素：
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种用于TGEV、PEDV二联冻干活疫苗的耐热保护剂以解决现有技术中，缺乏一种针对该特定疫苗的耐热保护剂的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中，用于该疫苗的耐热保护剂在冻干过程中对抗原活性保护效果较差。
本发明要解决的再一技术问题是现有技术中，用于该疫苗的耐热保护剂对疫苗稳定性的增益作用不足。
本发明还提供了上述耐热保护剂的一种制备方法，以解决该耐热保护剂的常规制备方法灭菌环节不合理的技术问题。
本发明还提供了上述耐热保护剂在TGEV、PEDV二联冻干活疫苗制备中的一种应用方法，以解决常规应用方法难以发挥其对疫苗的最佳保护效力的技术问题。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于TGEV、PEDV二联冻干活疫苗的耐热保护剂，该耐热保护剂由以下重量百分比的成分组成：明胶1～3％，乳糖2～10％，水解乳蛋白0.5～3％，海藻糖1～6％，L-精氨酸0.1～3％，谷氨酸钠1～3％，聚乙烯吡咯烷酮2～8％，水余量。
作为优选，所述聚乙烯吡咯烷酮是PVP K30。
作为优选，所述水是注射水或超纯水。
同时，本发明提供了上述耐热保护剂的一种制备方法，包括以下步骤：
1)取配方量的明胶和聚乙烯吡咯烷酮，溶解于水中，而后蒸汽灭菌，得到第一溶液；
2)取配方量的乳糖、水解乳蛋白、海藻糖、L-精氨酸、谷氨酸钠，溶解于水中，而后过滤除菌，得到第二溶液；
3)所述第一溶液和第二溶液混合，即得到所述用于TGEV、PEDV二联冻干活疫苗的耐热保护剂；
其中步骤1)中水的用量与步骤2)中水的用量之和为所述耐热保护剂中水成分的配方量。
作为优选，步骤1)中所述蒸汽灭菌是在115～121℃条件下灭菌15min～20min。
作为优选，步骤2)中所述过滤除菌是利用0.22μm孔径滤膜实现的。
此外，本发明提供了上述耐热保护剂的一种应用，包括以下步骤：取所述耐热保护剂，与TGEV抗原溶液和PDEV抗原溶液按(0.5～2):1:1的比例混合，而后冷冻干燥。
此外，本发明提供了上述耐热保护剂的一种应用，包括以下步骤：取所述耐热保护剂，与TGEV抗原溶液和PDEV抗原溶液混合，而后冷冻干燥，所述冷冻干燥的预冻温度为-40℃～-45℃，箱温最低温度持续时间为3～4小时。
作为优选，所述冷冻干燥的升华干燥阶段分为先后两部分，第一部分温度为-8℃、持续15～16h，第二部分温度为0℃、持续5～6h。
作为优选，所述冷冻干燥的解吸干燥阶段，温度为28℃、持续6～10h。
在疫苗制备领域中，耐热冻干保护剂的组分、配比以及冻干工艺条件对疫苗的保存效果、稳定性和物理性状具有重要的影响。为了提升猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗的稳定性和保存期，本发明基于实验手段围绕TGEV和PEDV的抗原特性针对性的设计了耐热保护剂的成分配方。
其中海藻糖是一种安全、可靠的天然糖类，能够在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面形成独特的保护模，有效地保护生物分子结构不被破坏。在冷冻干燥过程中可以提供充足的羟基，中和羧基活性物质，固定一定量的水分，使悬浮于其中的病毒在冷冻干燥过程中尽量保持存活状态，使干燥活疫苗产品的最终水分含量保持一定水平，不因过于干燥而使病毒蛋白质变性，为病毒存活尽可能提供良好的环境。
聚乙烯吡咯烷酮是一种非离子型高分子化合物，本发明意外的发现添加PVP成分能够使病毒在低温保存和冷冻干燥过程中够起到很好的保护作用，在脱水干燥过程中又是很好的填充剂，对生物制品起到很强的支撑作用。PVP K30为医药级赋形剂，无毒无害，耐热，耐酸碱，耐高温和低温，可以为疫苗病毒颗粒提供多孔性构架，阻断外界热源对构架内病毒的损害。
水解乳蛋白又称水解乳清蛋白，是蛋白酶水解浓缩乳清蛋白或乳白蛋白的物。可消除外界光线中紫外线对病毒的灭活，最大限度地消耗疫苗溶液中的溶解氧，减少病毒与氧分子的接触，降低病毒的代谢水平和能量消耗，清除病毒代谢所产生的氧自由基，防止病毒在冷冻干燥及贮运过程中由于内外不良氧化因子的刺激而灭活。
乳糖在明胶作为保护剂的配方中的效果优于蔗糖，乳糖不仅可以作为填充剂，还有调节水分含量的作用。
基于以上积极的发现，本发明优化得到了具有优异性能的耐热保护剂，尤其适用于TGEV、PEDV二联冻干活疫苗，以其所制备的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗安全有效、稳定性高，病毒抗原冻干损失率低，耐热性能良好，保存期长。由于针对该耐热保护剂匹配了适宜的冻干操作条件，进一步促进了其对抗原的保护效果，并提升了冻干效率。所制备疫苗在37℃放置14日后病毒含量下降不超过0.5个滴度；在2～8℃保存30个月后，仍保持冻干后的外形，病毒含量仍≥105.0TCID50；其真空度、剩余水分等各项检验均合格。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1(猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的制备及检验)
1.耐热保护剂的配制
1.1称取明胶、聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质按比例用注射用水溶解，115℃高压20min灭菌，作为A液。
1.2将乳糖、水解乳蛋白、海藻糖、L-精氨酸、谷氨酸钠等小分子物质按比例分别溶于注射用水，0.22μm滤膜过滤除菌作为B液。
1.3将上述A液和B液按1∶1的比例混合即为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗耐热保护剂，其中各组分所占的比例分别为明胶2％、PVP K305％、乳糖6％、水解乳蛋白1％、海藻糖4％、L-精氨酸1％、谷氨酸钠3％等。
2.疫苗的制备
2.1配苗、分装 上述猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂的应用，是将配制好的耐热保护剂与TGEV(HB08株，病毒含量为106.5TCID50/ml)和PEDV病毒含量为(ZJ08株，106.6TCID50/ml)按0.5∶1∶1的比例混合，并分装至西林瓶中，每瓶分装2.3ml。
2.2疫苗冻干 将分装好的疫苗按照如下程序进行冻干：-40℃预冻3h；程序控温设定：-18℃40min；-8℃15h30min；0℃5h；10℃2h；28℃30min；28℃6h；同时使用相同的毒液制备使用蔗糖明胶保护剂制备常规疫苗作为对照，疫苗规格均为10头份/ml。
3.疫苗的检验
3.1安全性检验 分别将冻干的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗和对照疫苗(常规猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗)分别进行安全性检验。方法如下：将疫苗用灭菌生理盐水稀释为10头份/ml，肌肉注射3～5日龄TGEV、PEDV阴性母猪(TGEV、PEDV中和抗体均小于1∶8)所产仔猪5头，每头注射1ml，连续观察14日。结果连续观察14日，耐热保护剂组和对照疫苗组免疫仔猪全部健活，均未出现不良反应，表明本发明制备的疫苗与常规疫苗同样安全。
3.2耐热性能的检验 分别将冻干的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗和对照疫苗(常规猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗)分别置于37℃放置不同时间(7日、10日、14日)后，取出后分别进行耐热前后疫苗物理性状、剩余水分、真空度测定和效力检验。
3.2.1物理性状、剩余水分和真空度测定 按《中国兽药典》进行，结果均符合规定兽用生物制品通则规定，见表1、表2。
3.2.2效力检验 采用病毒含量测定的方法，具体方法如下：将疫苗用DMEM稀释为1头份/ml，然后用DMEM作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6 4个稀释度进行病毒含量的测定。
3.2.2.1猪传染性胃肠炎病毒含量测定 每个稀释度分别加入等量的PEDV特异性阳性血清，置37℃中和60min，接种于已长成良好ST细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，37℃5％CO2培养箱培养3～5日，观察细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID50。
3.2.2.2猪流行性腹泻病毒含量测定 每个稀释度分别加入等量的TGEV特异性阳性血清，置37℃中和60min，接种于已长成良好Vero-E6细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，37℃5％CO2培养箱培养3～5日，观察细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID50。
3.2.2.3结果分析 结果显示，使用本发明耐热保护剂制备的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的耐热性能良好，37℃放置14日，TGEV和PEDV每头份病毒含量下降均≤0.5个滴度，显著优于常规对照疫苗(病毒含量下降均超过1个滴度)，见表1、表2。
表1猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的耐热性能
表2常规猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻活疫苗的耐热性能
3.3保存期实验 分别将冻干的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗和对照疫苗(常规猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗)分别置于2～8℃放置不同时间(6个月、12个月、18个月、24个月、30个月)后取出后分别剩余水分，真空度测定和效力检验(方法同3.2)，结果显示，使用本发明耐热保护剂制备的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的保存长：2～8℃保存病毒含量下降缓慢；2～8℃放置30个月，TGEV和PEDV每头份病毒含量仍≥106.0TCID50；显著优于常规对照疫苗(2～8℃放置超过12个月，每头份病毒含量≤105.0TCID50)，见表3、表4。
表3猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的保存期实验
表4常规猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻活疫苗的保存期实验
综上所述使用本发明制备的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗与常规疫苗一样安全，但耐热保护剂二联苗病毒抗原冻干损失率低；耐热性能显著优于常规对照疫苗，较常规疫苗更为稳定，保存期更长。
实施例2(猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的制备及检验)
1.耐热保护剂的配制
1.1将明胶、聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质按比例用超纯水溶解，116℃高压20min灭菌，作为A液；
1.2将乳糖、水解乳蛋白、海藻糖、L-精氨酸、谷氨酸钠等小分子物质按比例分别溶于用超纯水，0.22μm滤膜过滤除菌作为B液；
1.3将上述A液和B液按1∶1的比例混合即为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗耐热保护剂，其中各组分所占的比例分别为明胶1.5％、PVP K306％，乳糖8％、水解乳蛋白1.5％、海藻糖2％、L-精氨酸2％、谷氨酸钠2％。
2.疫苗的制备
2.1配苗、分装 上述猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂的应用，是将配制好的耐热保护剂与TGEV(HB08株，病毒含量为107.0TCID50/ml)和PEDV病毒含量为(ZJ08株，107.0TCID50/ml)按2∶1∶1的比例混合，并分装至西林瓶中，每瓶分装2.2ml。
2.2疫苗冻干 将分装好的疫苗按照如下程序进行冻干：-40℃预冻4h；程序控温设定：-18℃60min；-8℃16h；0℃6h；10℃2h；28℃30min；28℃10h；同时使用相同的毒液制备使用蔗糖明胶保护剂制备常规疫苗作为对照，疫苗规格均为10头份/ml。
3.疫苗的检验
3.1安全性检验 分别将冻干的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗和对照疫苗(常规猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗)分别进行安全性检验。方法如下：将疫苗用灭菌生理盐水稀释为10头份/ml，肌肉注射3～5日龄TGEV、PEDV阴性母猪(TGEV、PEDV中和抗体均小于1∶8)所产仔猪5头，每头注射1ml，连续观察14日。结果连续观察14日，耐热保护剂组和对照疫苗组免疫仔猪全部健活，均未出现不良反应，表明本发明制备的疫苗与常规疫苗同样安全。
3.2耐热性能的检验 分别将冻干的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗和对照疫苗(常规猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗)分别置于37℃放置不同时间(7日、10日、14日)后，取出后分别进行耐热前后疫苗物理性状、剩余水分、真空度测定和效力检验。
3.2.1物理性状、剩余水分和真空度测定 按《中国兽药典》进行，结果均符合规定兽用生物制品通则规定，见表1、表2。
3.2.2效力检验 采用病毒含量测定的方法，具体方法如下：将疫苗用DMEM为1头份/ml，然后用DMEM作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-64个稀释度进行病毒含量的测定。
3.2.2.1猪传染性胃肠炎病毒含量测定 每个稀释度分别加入等量的PEDV特异性阳性血清，置37℃中和60min，接种于已长成良好ST细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，37℃5％CO2培养箱培养3～5日，观察细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID50。
3.2.2.2猪流行性腹泻病毒含量测定 每个稀释度分别加入等量的TGEV特异性阳性血清，置37℃中和60min，接种于已长成良好Vero-E6细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，37℃5％CO2培养箱培养3～5日，观察细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID50。
3.2.2.3结果分析 结果显示，使用本发明耐热保护剂制备的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的耐热性能良好，37℃放置14日，TGEV和PEDV每头份病毒含量下降均≤0.5个滴度，显著优于常规对照疫苗(病毒含量下降均超过1个滴度)，见表5、表6。
表5猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的耐热性能
表6常规猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻活疫苗的耐热性能
3.3保存期实验 分别将冻干的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗和对照疫苗(常规猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗)分别置于2～8℃放置不同时间(6个月、12个月、18个月、24个月、30个月)后取出后分别剩余水分，真空度测定和效力检验(方法同3.2)，结果显示，使用本发明耐热保护剂制备的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的保存长：2～8℃保存病毒含量下降缓慢；2～8℃放置30个月，TGEV和PEDV每头份病毒含量仍≥106.0TCID50；显著优于常规对照疫苗(2～8℃放置超过12个月，每头份病毒含量≤105.0TCID50)，见表7、表8。
表7猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的保存期实验
表8常规猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻活疫苗的保存期实验
综上所述使用本发明制备的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗与常规疫苗一样安全，但耐热保护剂二联苗病毒抗原冻干损失率低；耐热性能显著优于常规对照疫苗，较常规疫苗更为稳定，保存期更长。
实施例3猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的制备及检验
1.耐热保护剂的配制
1.1将明胶、聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质按比例用超纯水溶解，121℃高压15min灭菌，作为A液；
1.2将乳糖、水解乳蛋白、海藻糖、L-精氨酸、谷氨酸钠等小分子物质按比例分别溶于超纯水，0.22μm滤膜过滤除菌作为B液；
1.3将上述A液和B液按1∶1的比例混合即为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗耐热保护剂，其中各组分所占的比例分别为明胶1％、PVP K308％；其中乳糖4％、水解乳蛋白3％、海藻糖6％、L-精氨酸1％、谷氨酸钠3％。
2.疫苗的制备
2.1配苗、分装 上述猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂的应用，是将配制好的耐热保护剂与TGEV(HB08株，病毒含量为106.60TCID50/ml)和PEDV病毒含量为(ZJ08株，106.75TCID50/ml)按1∶1∶1的比例混合，并分装至西林瓶中，每瓶分装2.1ml。
2.2疫苗冻干 将分装好的疫苗按照如下程序进行冻干：-40℃预冻4h；程序控温设定：-18℃60min；-8℃15h30min；0℃6h；10℃2h；28℃40min；28℃8h；同时使用相同的毒液制备使用蔗糖明胶保护剂制备常规疫苗作为对照，疫苗规格均为10头份/ml。
3.疫苗的检验
3.1安全性检验 分别将冻干的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗和对照疫苗(常规猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗)分别进行安全性检验。方法如下：将疫苗用灭菌生理盐水稀释为10头份/ml，肌肉注射3～5日龄TGEV、PEDV阴性母猪(TGEV、PEDV中和抗体均小于1∶8)所产仔猪5头，每头注射1ml，连续观察14日。结果连续观察14日，耐热保护剂组和对照疫苗组免疫仔猪全部健活，均未出现不良反应，表明本发明制备的疫苗与常规疫苗同样安全。
3.2耐热性能的检验 分别将冻干的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗和对照疫苗(常规猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗)分别置于37℃放置不同时间(7日、10日、14日)后，取出后分别进行耐热前后疫苗物理性状、剩余水分、真空度测定和效力检验。
3.2.1物理性状、剩余水分和真空度测定 按《中国兽药典》进行，结果均符合规定兽用生物制品通则规定，见表1、表2。
3.2.2效力检验 采用病毒含量测定的方法，具体方法如下：将疫苗用DMEM稀释为1头份/ml，然后用DMEM作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6 4个稀释度进行病毒含量的测定。
3.2.2.1猪传染性胃肠炎病毒含量测定 每个稀释度分别加入等量的PEDV特异性阳性血清，置37℃中和60min，接种于已长成良好ST细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，37℃5％CO2培养箱培养3～5日，观察细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID50。
3.2.2.2猪流行性腹泻病毒含量测定 每个稀释度分别加入等量的TGEV特异性阳性血清，置37℃中和60min，接种于已长成良好Vero-E6细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，37℃5％CO2培养箱培养3～5日，观察细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID50。
3.2.2.3结果分析 结果显示，使用本发明耐热保护剂制备的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的耐热性能良好，37℃放置14日，TGEV和PEDV每头份病毒含量下降均≤0.5个滴度，显著优于常规对照疫苗(病毒含量下降均超过1个滴度)，见表9、表10。
表9猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的耐热性能
表10常规猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻活疫苗的耐热性能
3.3保存期实验 分别将冻干的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗和对照疫苗(常规猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗)分别置于2～8℃放置不同时间(6个月、12个月、18个月、24个月、30个月)后取出后分别剩余水分，真空度测定和效力检验(方法同3.2)，结果显示，使用本发明耐热保护剂制备的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的保存长：2～8℃保存病毒含量下降缓慢；2～8℃放置30个月，TGEV和PEDV每头份病毒含量仍≥106.0TCID50；显著优于常规对照疫苗(2～8℃放置超过12个月，每头份病毒含量≤105.0TCID50)，见表11、表12。
表11猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗的保存期实验
表12常规猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻活疫苗的保存期实验
综上所述使用本发明制备的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联耐热保护剂活疫苗与常规疫苗一样安全，但耐热保护剂二联苗病毒抗原冻干损失率低；耐热性能显著优于常规对照疫苗，较常规疫苗更为稳定，保存期更长。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。