丹参素钠在制备提高免疫力药物的用途的制作方法

【所属技术领域】

本发明属于医药技术领域，尤其涉及丹参素钠在制备提高免疫力药物的用途。

背景技术：

丹参素是中药丹参中含量较多的一种水溶性酚性芳香酸类化合物，在自然界中不稳定，故把其做成钠盐，功效与丹参素相同。丹参素钠为白色针状结晶，溶于水和甲醇。已有药效证实丹参素钠具有活血化瘀，理气止痛的作用，用于胸憋闷和心绞痛的治疗。目前丹参素钠的药物用途主要集中在治疗心肌缺血、抗抑郁、抗肿瘤等方面的研究，但是，丹参素钠作为提高免疫力类药物的用途，尤其在促进淋巴细胞的增殖方面的作用，目前并没有相关研究报道。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明主要公开了一种利用丹参素钠制备提高免疫力药物的用途，尤其是其作用于淋巴细胞，促进淋巴细胞增殖方面的用途。

上述药物是以片剂、注射剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂的形式使用。

上述药物经静脉、口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹腔、直肠中任一方式给予。

进一步地，丹参素钠在制备提高免疫力的药物中作为丹参素钠溶液的形式使用。

进一步地，丹参素钠在制备提高免疫力的药物中的溶液浓度为6.25μm至50μm。

优选地，丹参素钠溶液浓度为12.5μm-25μm，更优地，丹参素钠溶液浓度为25μm。

进一步地，丹参素钠在溶液浓度为6.25μm至50μm时，其对于淋巴细胞增殖促进作用显著。

优选地，丹参素钠溶液浓度为12.5-25μm时，其对于淋巴细胞的增殖促进作用显著，更优地，丹参素钠溶液浓度为25μm，其对于淋巴细胞的增殖促进作用显著。

本发明的有益效果：实验证明丹参素钠对淋巴细胞的增殖能力具有较好的促进作用，同时提高了淋巴细胞的杀伤活性，在提高机体免疫力方面展示了良好的药物作用。

【附图说明】

图1为丹参素钠对淋巴细胞数量的影响(与对照组相比*p<0.05)

图2为倒置显微镜观察淋巴细胞形态(×100)

图3为丹参素钠对淋巴细胞增殖的影响

图4为丹参素钠对淋巴细胞的杀伤活性影响(与对照组相比*p<0.05，**p<0.01)

【具体实施例】

以下将结合实施例与附图用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围和精神实质。

1.实验方法：

1.1丹参素钠溶液的制备

丹参素钠为市售产品，购自成都普菲德生物技术有限公司，产品编号为jot-10213，常温下溶于dmso溶液中混匀。

1.2外周血淋巴细胞的分离与培养

人新鲜抗凝外周血80-100ml与注射用生理盐水1:1混匀后，小心加于细胞分离液之液面上(混合液与细胞分离液比例为2:1)。以500g室温离心30分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层为血浆层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离层，第四层为红细胞层。收集第二层细胞放入含注射用生理盐水的试管中，充分混匀后，400g离心20分钟。沉淀经反复洗2次即得所需细胞，获得的淋巴细胞用完全培养液调整细胞浓度至2×10⁶/ml，置于培养瓶内。

1.3细胞计数仪检测丹参素钠对淋巴细胞数量的影响

将淋巴细胞分别以1×10⁶/ml浓度接种于12孔培养板，分别加入6.25μm,12.5μm,25μm,50μm的丹参素钠溶液，以okt3(50ng/ml)/il-2(1000u/ml)为阳性对照组，并设不含药物对照组。37℃5％co2培养24小时收集细胞，倒置荧光显微镜拍照，luna全自动细胞计数仪检测细胞数量。

1.4cfse染色检测丹参素钠对淋巴细胞增殖能力的影响

将淋巴细胞计数离心后用含0.1％fbs的pbs洗两次，2mlpbs重悬，加入2mm的cfse溶液2ul，于37℃孵育10min，期间震荡两次。用40％体积的冷小牛血清立即终止标记，冰上放置5min。离心洗涤两次后，适量的1640完全培养液重悬细胞。将淋巴细胞分别以1×10⁶/ml浓度接种于12孔培养板，分别加入6.25μm,12.5μm,25μm,50μm的丹参素钠溶液，以okt3(50ng/ml)/il-2(1000u/ml)为阳性对照组，并设不含药物对照组。37℃5％co2培养24、48小时收集细胞，用pbs缓冲液洗涤2次，用适量的完全培养液重悬细胞。倒置荧光显微镜拍照，流式细胞仪488nm检测。

1.4钙黄绿素法检测丹参素钠对淋巴细胞杀伤活性的影响

淋巴细胞用6.25μm,12.5μm,25μm,50μm的丹参素钠溶液分别处理24和48小时。取适量k562白血病细胞，离心弃上清，pbs洗涤，钙黄绿素-am(2μmol/l)避光染色，培养箱中孵育30分钟，离心弃上清，pbs洗涤两次(800g,5min)后1ml培养基重悬细胞进行细胞计数。将浓度为1×10⁵/ml靶细胞接种于96孔板，每孔100μl。按不同效靶比(10:1/20:1)加入淋巴细胞，体积为100μl/孔。同时设立自发释放组(仅有靶细胞)与最大释放组(2％tritonx-100)，各孔体积也为200ul/孔。所有各组均设三个复孔。培养箱中培养4小时后1500r/m离心，吸取上清100μl/孔，转移至新的96孔板，多功能酶标仪(激发光485nm，发射光535nm)读取荧光值，根据各组荧光值计算杀伤率。

2.实验结果

2.1丹参素钠对淋巴细胞数量和增殖能力的影响

根据图1，丹参素钠与淋巴细胞共培养24小时后，可见6.25μm、12.5μm、25μm和50μm丹参素钠均可促进淋巴细胞数量显著增加，由图可知，随浓度增加丹参素钠对淋巴细胞数量的促进作用呈现先升高后下降的趋势。根据图2，倒置显微镜下可见6.25μm、12.5μm和25μm丹参素钠可促进淋巴细胞集落显著增加。cfse染色后流式细胞仪检测淋巴细胞增殖情况，结果如图3所示，6.25μm、12.5μm、25μm和50μm丹参素钠可促进第六代淋巴细胞数量明显增加。

2.2丹参素钠对淋巴细胞杀伤活性的影响

丹参素钠与淋巴细胞作用24小时后，观察效应细胞与靶细胞共孵育4小时的杀伤百分比。图4显示了丹参素钠对淋巴细胞的杀伤活性影响(与对照组相比*p<0.05，**p<0.01)，根据图4可知，随着效靶比的升高，淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤比也相应提高。由此说明，丹参素钠可增加淋巴细胞的杀伤活性。

技术特征：

技术总结
本发明提供一种丹参素钠用于制备提高免疫力药物的用途，尤其在制备通过促进淋巴细胞增殖以提高免疫力药物的用途。所述丹参素钠药物是以片剂、注射剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂中任一形式使用。实验表明，丹参素钠溶液在6.25μM‑50μM时，对于淋巴细胞的数量和增殖能力具有较好的促进作用，能有效提高机体免疫力。

技术研发人员：王辉;陈亚楠
受保护的技术使用者：北京城市学院
技术研发日：2016.07.08
技术公布日：2018.01.16