圆柚酮的神经保护用途的制作方法

本发明涉及一种圆柚酮的新用途。

技术实现要素：

脑中风、老年痴呆、帕金森、脑外伤等脑部疾病严重危害人类健康。脑部疾病的发生、发展过程中，均伴随着不同程度的神经细胞损伤，例如：在缺血性脑中风发生时，血流减少导致正常细胞的功能改变，大脑组织对局部缺血非常敏感，即使神经元的短时间缺血也会引发一系列的事件，最终导致神经细胞的死亡。神经保护可用于急性疾病后防止神经系统中脑/神经元损伤或退化或防止慢性神经退化疾病。神经保护的目的是中枢神经系统损伤后减少神经元功能障碍/死亡，并尝试维持大脑细胞相互作用的最大可能的完整性，从而产生未受干扰的神经功能。

圆柚酮，最初是从柚子皮油和阿拉斯加黄柏油中分离出的倍半萜酮，为无色或淡黄色油状液体，具持久而强的柑橘样果香，在较低稀释度时呈典型的柚子香气。目前，还未见圆柚酮对神经保护作用的相关研究。

发明内容

本发明的目的在于提供了刺参苷M的新用途。

具体地，本发明提供了圆柚酮或其异构体或者它们药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物在制备具有神经保护作用的药物或保健品中的用途。

进一步地，所述药物或保健品是促进NGF、Vimentin、Nestin或GalC表达的药物或保健品。

更进一步地，所述药物或保健品是治疗或缓解与NGF、Vimentin、Nestin或GalC表达障碍相关疾病的药物。

其中，所述NGF、Vimentin、Nestin或GalC表达障碍是指NGF、Vimentin、Nestin或GalC表达绝对不足或相对不足。

NGF(神经生长因子)，对中枢神经元及周围神经元的发育、生长、分化、再生以及功能特性的表达都有重要的调控作用。研究表明，NGF对脑缺血过程中的神经元有保护作用。

Nestin(巢蛋白)，作为一种中间丝蛋白，可以和微管、微丝一起构成细胞骨架而达到维持神经前体细胞的正常形态，含有Nestin的细胞骨架有可能增加神经细胞的伸缩性和弹性，这对于神经系统的发育过程是必要的。Nestin蛋白作为神经肝细胞的标志，也是神经肝细胞的自我更新所需。该蛋白与其共存的Vimentin(波形蛋白)共聚组装成神经前体细胞内的中间丝，进而发挥细胞骨架作用。

其中，所述药物或保健品是诱导骨髓间充质干细胞向神经元分化的药物或保健品。

本发明还提供了圆柚酮或其异构体或者它们药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物在制备具有促进NGF表达的药物或保健品中的用途。

圆柚酮，目前不仅仅可以从柚子皮油和阿拉斯加黄柏油中分离得到，也可以从已知含有此成分的其他原料中进行提取分离，如益智仁。当然，基于圆柚酮的药理活性，可以显而易见地想到，除了圆柚酮纯品外，各原料中包含圆柚酮的提取物也可以用于神经保护。

本发明还提供了一种具有神经保护作用的药物组合物，它是以圆柚酮或其异构体或者它们药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成制剂。

其中，所述制剂为口服或外用制剂。

本发明所述药学上可接受的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质，包括但不仅限于填充剂(稀释剂)、润滑剂(助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂等。粘合剂包含糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物(如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素等)、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂包含乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、沉降碳酸钙等)、山梨醇或甘氨酸等；润滑剂包含微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油、聚乙二醇等；崩解剂包含淀粉及其衍生物(如羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉等)、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素等；湿润剂包含十二烷基硫酸钠、水或醇等；抗氧剂包含亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酸等；抑菌剂包含0.5％苯酚、0.3％甲酚、0.5％三氯叔丁醇等；调节剂包含盐酸、枸橼酸、氢氧化钾(钠)、枸橼酸钠及缓冲剂(包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠)等；乳化剂包含聚山梨酯-80、没酸山梨坦、普流罗尼克F-68，卵磷酯、豆磷脂等；增溶剂包含吐温-80、胆汁、甘油等。

所述药学上可接受的辅助性成分，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述化合物或衍生物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明化合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。

术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。上述酸碱为广义的路易斯酸碱。

本发明中，所述“氘代”指化合物或基团中的一个或多个氢被氘所取代。氘代可以是一取代、二取代、多取代或全取代。在另一优选例中，氘在氘取代位置的氘同位素含量是大于天然氘同位素含量(0.015％)，更佳地大于50％，更佳地大于75％，更佳地大于95％，更佳地大于97％，更佳地大于99％，更佳地大于99.5％。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明实验发现，圆柚酮能够通过nestin、galc、ngf、vimentin等的表达，诱导骨髓间充质干细胞向神经元分化，从而发挥神经保护活性。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。

以下通过具体实施例的形式，对本发明的上述内容再做进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1圆柚酮NGF模型筛选结果

图2 Nestin基因的mRNA表达情况

图3 GalC基因的mRNA表达情况

图4 NGF基因的mRNA表达情况

图5 Vimentin基因的mRNA表达情况

图6 NSE基因的mRNA表达情况

图7圆柚酮的免疫荧光结果，其中，A：圆柚酮Nestin免疫荧光，B：圆柚酮NGF免疫荧光，C：圆柚酮GalC免疫荧光，D：圆柚酮Vimentin免疫荧光。

具体实施方式

实施例1 圆柚酮的神经保护作用

1试剂及仪器设备

材料：圆柚酮(美国sigma公司，生产批号：101340870，纯度>99％)；人胚肾上皮细胞HEK293细胞株、NGF质粒均由四川大学生物医学材料工程研究中心505实验室保存提供；

NGF质粒的制备方法如下：以大鼠基因组DNA为模板，设计引物在rNGF启动子序列的上下游分别引入MluⅠ和AflⅡ酶切位点PCR扩增得到启动子片段：rNGFpro(缩写为Np)(-615bp～+50bp)(+1为基因转录起始位点)，正向引物序列见SEQ NO.2，反向引物序列见SEQ NO.3。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，乙醇沉淀回收得到各启动子片段。分别双酶切载体pSC-E2及各启动子片段(Np)，1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的片段，连接载体与启动子片段，转化大肠杆菌，氨苄青霉素平板抗性筛选，挑选阳性转化子，进行快速裂解鉴定，阳性者扩大培养后提取质粒，进行酶切和PCR鉴定，对鉴定成功的质粒进行测序，最后获得重组质粒pNp-E2。同理制备获得重组质粒pNp-Luc。

试剂：DMEM-高糖培养基购自Hyclone公司；PBS购自成都哈里生物公司；哺乳动物细胞转染试剂(Lipofectamine^TM2000)购自Invitrogen公司；细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8)购自东仁化学科技(上海)有限公司；荧光素酶检测试剂盒(Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer)购自Promega公司；蛋白质浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)购自Thermo公司；G418购自Amresco公司、二甲亚砜(DMSO)购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)、双抗(100×penicillin-streptomycin)、Imedium、胰蛋白酶(0.25％Trypsin/EDTA)均购自Gibco公司；Trizol试剂、氯仿、异丙醇、cDNA反转录试剂盒(invitrogen)、琼脂糖、TAE缓冲液、Real-TimePCR试剂盒、PCR试剂盒、细胞培养皿购自Thermo公司、各种规格培养板购自Corning公司、其它化学试剂除注明外均为国产分析纯。

仪器：倒置相差荧光显微镜(DMI 4000B,Leica)、CO2培养箱(MACO-15AC,SANYO)、nanadrop2000、超净工作台(SW-CJ-2N型，哈尔滨东联公司)、恒温水浴锅、PCR凝胶电泳仪、恒温金属浴、PCR仪、紫外透射检测仪、Bio-Rad CFX Manager、剪刀、镊子、手术刀、5mL无菌注射器等。灭菌锅(DSX-280A，上海申安医疗器械厂)、涡旋仪(XW-80A，上海青浦沪西仪器厂)、离心机(Centrifuge 5424和5415R,Eppendorf)、显微镜(DMIL,Leica)、倒置相差荧光显微镜(DMI 4000B,Leica)、CO2培养箱(MACO-15AC,SANYO)、超净工作台(SW-CJ-2N型，哈尔滨东联公司)、酶标仪(Flash,Thermo Scientific)。

2研究方法

用构建好的ProNGF-Luc质粒转染人胚肾上皮细胞(Hek293)，挑选可稳定传代的细胞株扩大培养并冻存，建成Hek293-NGF细胞模型。CCK8试剂盒测定化合物细胞毒性，确定筛选的安全浓度范围。用模型对圆柚酮进行活性筛选，荧光素酶试剂盒测定筛选结果，与空白对照比较以相对荧光素酶活性大于150％为初筛阳性，并计算最佳有效浓度。全骨髓贴壁法分离体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)，初筛阳性单体加药诱导11天，设1D、3D、5D、7D、11D五个时间点，按时观察细胞形态变化情况并拍照记录后收集细胞。提取细胞总RNA后进行定量PCR实验和免疫荧光实验，分析实验结果并得出结论。

3研究内容

3.1细胞筛选模型的构建

人胚肾上皮细胞(HEK293)的培养条件为DMEM-高糖培养基(含10％FBS+0.1％双抗)，10CM培养皿置于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养，当细胞长至P3代以适当密度接种至24孔板，设转染组和对照组，每组3个平行，于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养48h。

当24孔板中细胞融合度达90％左右开始转染。将NGF质粒以opti-MEM培养基稀释，使其终浓度为500-800ng/ul，另将Lipofectamine^TM2000以opti-MEM培养基稀释至相同体积，轻柔混匀后室温孵育5min。将稀释后的NGF质粒加入Lipofectamine^TM2000中，轻柔混匀室温孵育20min，使形成转染复合物。弃掉培养板中的旧培养基，转染组每孔加入无血清无双抗培养基后加入转染复合物100μL，对照组更换无血清无双抗培养基及100ulopti-MEM和Lipofectamine^TM2000混合物培养基，来回轻晃使混合均匀。于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养4-6h后更换培养基为含10％FBS和0.1％双抗的DMEM-高糖培养基。

24h后用G418选择培养基筛选稳定细胞株，设置1000μg/mL、800μg/mL、600μg/mL、400μg/mL、200μg/mL五个筛选浓度。从最高浓度逐级筛选，至浓度降为200μg/mL时细胞生长状况基本稳定，维持筛选压力一周。显微镜下标记并挑取单克隆细胞至6孔板，扩大培养进行转染基因表达检测并冻存。

整个模型建立方法和功能评价，具体参见“脑缺血药物筛选细胞模型的构建及应用研究，卢琼，西南交通大学，2014年”以及专利申请号:CN201610064454.4、CN201610064398.4、CN201610090360.4。

3.2圆柚酮的cck-8细胞毒活性测定

以CCK-8试剂盒检测各单体毒性，设置100μm、10μm、1μm、0.1μm四个浓度梯度，同时设置溶剂对照组(DMSO终体积分数为0.1％)，酶标仪上450nm处测定OD值，计算细胞相对存活率。以相对存活率≥90％对应的药物浓度作为该单体成分筛选的安全浓度。

相对存活率＝[OD(加药)-OD(空白)]/[OD(DMSO)-OD(空白)]×100％

3.3圆柚酮的活性筛选

本实验建立的NGF细胞模型在NGF启动子上连接了报告基因Luc(荧光素酶)，对细胞进行加药处理观察该成分能使Luc表达上调作为检测指标。具体步骤如下：

以CCK-8试剂盒检测得到的安全浓度作为圆柚酮的筛选浓度，同时设置阴性溶剂对照，37℃,5％CO₂培养箱中培养24h后加药处理，相同条件下连续培养24-48h后Reporter Lysis 1×Buffer收集细胞，BCA蛋白试剂盒测定相对荧光素酶活性^[4]。计算公式为：

相对荧光素酶活性＝荧光素酶活性/BSA蛋白含量

与阴性溶剂对照组比较计算各单体成分对NGF基因转录活性的影响，以上调改变率≥150％作为筛选活性判断标准。计算公式为：

上调改变率＝(实验组相对荧光素酶活性/对照组相对荧光素酶活性)×100％

3.4 rMSC的分离培养

(1)购买4-6周龄SD雄性大鼠分离rMSCs。脱颈处死，腿部酒精消毒取带肉胫骨部分。

(2)75％酒精浸泡3min后移入超净工作台。转至PBS中涮洗几次，于干净的培养皿中晾干。

(3)用镊子，手术剪等去除胫骨上的肌肉，剪去胫骨两端，露出骨髓腔。用5mL注射器吸取一定体积的L-DMEM培养基(含血清15％、1％双抗)冲洗骨髓腔，反复几次至骨髓腔发白。

(4)冲洗液置于培养皿中，吹打均匀后置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。

根据细胞贴壁情况进行换液(24-48h)，换液时动作缓慢、轻柔，避免将贴壁的MSC吸走。以后每2～3天换液。至细胞达到60％～70％汇合，用胰酶25℃消化2min，1:3比例传代。每天观察细胞生长情况并及时换液，14天左右得到纯化的MSC细胞。

3.5 Real-Time定量PCR

加药诱导rMSCs，设置圆柚酮为实验组，加维甲酸(RA)的为阳性对照组，加DMSO的为阴性对照组，以及空白对照组。每3天更换一次新鲜含药培养基，按时间节点收集细胞，Trizol试剂盒提取总RNA后反转录试剂盒反转录，严格按照试剂盒说明书操作。经过查阅大量文献资料，本实验选取了Nestin，Vimentin，NGF，GalC，NSE五个与神经细胞密切相关的标志物作为检测rMSC诱导分化的指标，并选取β248作为内参标志物，以每1个反应10μl反应体系，按照下表所示依次加入反应组分至0.5mL无菌EP管中：

β248反应体系(表1)：

PCR反应条件：94℃，3min；(94℃，30s；63℃，30s；72℃，30s)×24cycles；72℃，5min。

Nestin，Vimentin，NGF，GalC，NSE反应体系(表2)：

PCR反应条件：94℃，3min；(94℃，30s；65℃，30s；72℃，30s)×35cycles；72℃，5min。

3.6免疫荧光

分析定量PCR数据结果，最终确定免疫荧光实验的浓度选择10um，时间段选择3D。

(1)分离并培养SD大鼠MSCs，待细胞长至第P3代，细胞形态及生长状况良好方可取适量细胞接种至小玻璃培养皿。

(2)在培养皿中细胞用1×PBS漂洗3次，每次5min；用4％的多聚甲醛固定细胞30min，用1×PBS漂洗3次，每次5min；

(3)0.2％Triton X-100(PBS配制)室温通透15min；

1×PBS漂洗3次，每次5min，5％的BSA 4℃冰箱过夜；

(4)稀释一抗(100μL，覆盖玻底皿即可)常温孵育1-2h，用1×PBS漂洗3次，每次5min；

(5)加二抗常温孵育(100μL，覆盖玻底皿即可)30min-1h，放在摇床里摇(避光)。用1×PBS漂洗3次，每次5min。

(6)复染核：DAPI Solution染细胞核，37℃烘箱孵育40min，需要避光(关细胞房以及超净工作台照明灯，稀释过的DAPI Solution用锡箔纸包一下)，用1×PBS漂洗3次，每次5min；最后加1mL 1×PBS到波底皿里面，避免细胞干掉。照激光共聚焦。

4实验结果

4.1圆柚酮的cck-8细胞毒活性测定

圆柚酮安全浓度大于100μm，对细胞毒性较小，确定筛选最大浓度为100μm。

4.2圆柚酮的活性筛选

根据细胞毒性实验结果，选取100μm作为最大筛选浓度，设置100μm、10μm、1μm、0.1μm四个筛选梯度，以Hek293-NGF细胞模型进行筛选，相荧光素酶活性测定结果表明，编号为圆柚酮对HEK293-NGF细胞NGF基因的表达改变率≥150％，均有上调作用。1μm时圆柚酮诱导NGF表达上调率达到峰值，故选用1μm作为定量PCR实验rMSCs的诱导浓度。具体结果如图1。

4.3 rMSC的分离培养

原代细胞分离后24-48h开始出现贴壁细胞，呈长三角形，72h后贴壁细胞数量增多半量换液，以后每3D换一次液，连续培养一周，发现杂细胞不断减少贴壁细胞不断增多，细胞呈长三角形或圆形、少数呈多角形，并聚集成集落生长，继续相同条件下培养14天，杂细胞完全消失，贴壁细胞集落逐渐融合成片，呈长三角形螺旋生长或梭形成纤维状排列整齐紧密，此即为原代rMSC。待细胞汇合度达到85％左右即用胰酶消化，按1:3比例传代。实验选用第三代细胞。

4.4 Real-Time定量PCR

从定量PCR数据可看出圆柚酮组诱导的rMSCs在第5天时NGF和Vimentin基因表达上调均达到峰值，相对而言其他组上调都不明显，Nestin、GalC则是在第7D达到峰值。在第3D时，各组的NSE基因相对表达量都达到峰值。与阳性对照RA比较，诱导趋势基本一致。这提示加入诱导剂后rMSCs可能朝神经元产生了分化，但具体分化为哪种细胞或分化情况有待进一步研究。具体结构参见图2-图6，各图中，1为圆柚酮。

4.5免疫荧光

根据定量PCR结果，对圆柚酮进行免疫荧光实验，免疫荧光1μm为加药浓度，3D为时间点。选择四个基因nestin、galc、ngf、vimentin进行检测。四个基因均有荧光产生，结果见图7。

5讨论

用圆柚酮加药处理HEK293-NGF细胞模型，与对照组相比，加药组报告分子荧光素酶表达量均明显上调。该成分能够通过nestin、galc、ngf、vimentin等的表达，诱导骨髓间充质干细胞向神经元分化，从而发挥神经保护活性。