本发明属于中药制剂技术领域，具体涉及一种用于治疗高危型HPV持续感染的宫颈疾病的中药栓剂及其制备方法。
背景技术：
宫颈癌是迄今病因最为明确的恶性肿瘤，高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)被公认为宫颈癌发生的主要致病因子。HPV在宿主宫颈上皮细胞中形成潜伏持续感染是HPV致癌的前提条件，病毒癌基因E6/E7在HPV转化的宫颈上皮内持续表达，诱发并维持了细胞的恶性表型是宫颈癌发生、发展的关键因素。大量证据表明，从HPV感染到宫颈癌的发生，是一个渐进的、缓慢的过程，存在明确的癌前期病变阶段，这为我们提供了有利的阻断时机。目前，针对宫颈癌前病变(CIN)及早期宫颈癌的治疗手段仍以毁损性手术为主，尚缺乏无创、特效的阻断方法，但宫颈癌年轻化趋势明显，手术切除不可避免的破坏了女性生殖道的完整性，流产、早产甚至无法生育成为一个家庭不稳定的重要因素。我国传统中药治疗感染性疾病及肿瘤，有着数千年的应用经验和确切的临床疗效。局部外用中药是中药治疗宫颈炎症甚至宫颈癌的一大特色，使药物直达患处，促进病变组织凝固、坏死、溶解、脱落和修复，保持患者生理与生育功能。以雄黄为君药的中药验方“二黄栓”用于宫颈局部，治疗高危型HPV持续感染的宫颈炎症及CINI级，疗效显著，并可促进高危型HPV转阴。检测高危型HPV持续感染的宫颈炎症和CINI级患者用药前后外周血血清中IFN-γ，TNF-α；IL-4，IL-10的表达变化，发现IFN-γ，TNF-α升高，而IL-4，IL-10表达下降，治疗过程中未发现毒副反应。
栓剂作为一种常用的剂型，与最常见的口服给药相比，栓剂给药具有以下优点：1)能够避免与胃、肠等消化道相互作用而使药物失活或药物刺激胃肠，2)能够克服了口服药物的“首过效应”，3)栓剂塞入腔道后能够与腔道黏膜表面接触，在体温时能很快软化、熔化或溶解，与腔道分泌液混合，有效增加接触面积，通过腔道静脉等途径进入体在局部给药中发挥重要作用。4)中药大都比较苦涩，不利于口服给药，5)工艺简单，易于放大和工业化生产。
现有阴道给药多采用栓剂，洗剂和膜剂，其中栓剂为最常用的途径。栓剂在常温下呈固态，加热熔融后能够制得鱼雷型、圆锥型及圆柱型等外形。另外根据基质性质和设计方法不同，还可制得中空栓、双层栓、缓释栓对药物的释放进一步改善。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于治疗高危型HPV持续感染的宫颈疾病的中药栓剂及其制备方法。
一种用于治疗高危型HPV持续感染的宫颈疾病的中药栓剂，包括主剂和药学上可接受的制成栓剂的辅剂，所述主剂包括以下重量份数的各个组份：雄黄50～150份，黄连或盐酸小檗碱100～300份，白矾10～30份，冰片5～15份。
优选的，所述主剂包括以下重量份数的各个组份：雄黄100份，黄连或盐酸小檗碱200份，白矾20份，冰片10份。
具体的，单个栓剂中包括：雄黄100mg，黄连或盐酸小檗碱200mg，白矾20mg，冰片10mg。
本发明还提供了用于治疗高危型HPV持续感染的宫颈疾病的中药栓剂的制备方法，包括以下步骤：取过100目筛的处方量的雄黄、黄连或盐酸小檗碱、白矾和冰片，混合均匀后加入到39～41℃的熔融的辅剂中，将搅拌后分散均匀的含药混悬溶液灌注到栓壳中，冷却后密封即得。
优选的，辅剂为混合脂肪酸甘油酯基质。
优选的，主剂与辅剂的重量比为10～80:100，更优选的，10～65:100。
本发明各原料药的性味及功能主治：
雄黄：味辛，性温；有毒；归肝、大肠经。具有解毒杀虫、燥湿祛痰、截疟。用于痈肿疔疮，蛇虫咬伤，虫积腹痛，惊痫，疟疾。
黄连：味苦，性寒。归心、脾、胃、肝、胆、大肠经。清热燥湿，泻火解毒。用于湿热痞满，呕吐吞酸，泻痢，黄疸，高热神昏，心火亢盛，心烦不寐，心悸不宁，血热吐魈，目赤，牙痛，消渴，痈肿疔疮；外治湿疹，湿疮，耳道流脓。酒黄连善清上焦火热。用于目赤，口疮。姜黄连清胃和胃止呕。用于寒热互结，湿热中阻，痞满呕吐。萸黄连舒肝和胃止呕。用于肝胃不和，呕吐吞酸。具有清热燥湿，泻火解毒的功效。
白矾：味酸、涩，性寒；归肺、脾、肝、大肠经。外用解毒杀虫，燥湿止痒；内服止血止泻，祛除风痰。外治用于湿疹，疥癣，脱肛，痔疮，聘耳流脓；内服用于久泻不止，便血，崩漏，癫痫发狂。枯矾收湿敛疮，止血化腐。用于湿疹湿疮，脱肛，痔疮，聘耳流脓，阴痒带下，鼻衄齿衄，鼻癔肉。
冰片：味辛、苦，性微寒；归心、脾、肺经。具有开窍醒神，淸热止痛。用于热病神昏、惊厥，中风痰厥，气郁暴厥，中恶昏迷，胸痹心痛，目赤，口疮，咽喉肿痛，耳道流脓作用。
与现有技术相比：
与现有技术相比，本发明所提供的用于治疗高危型HPV持续感染的宫颈疾病的中药栓剂(以下简称二黄栓)在剂型和主剂上具有明显的改进：
较目前公开的论文中的相关药物(二黄散)，本发明首次提供了一种用于治疗高危型HPV感染的宫颈疾病的栓剂，其更方便于患者自行用药。在药剂的组成上，相对于散剂的主剂组成，我们在栓剂中去掉了主剂成分之一的胡粉(铅粉)。而我们通过大量的临床验证，去掉胡粉后，栓剂对宫颈炎症的治疗效果不变；同时，可显著减少宫颈局部着色，这也为女性患者提供了更多心理上的治疗保障。
总体上，本发明具有如下有益效果：
(1)采用中药现代精制提取技术对处方中的主要组分进行制备，使药物粒径大大减小，易于透过粘膜进入组织，明显提高了药物的吸收率和生物利用度，主要有效成分的药理作用效果显著高于传统制剂。
(2)本发明配方合理。配方各药物分布极广，资源丰富
(3)本发明剂型使用方便，用药期间无阴道出血，排液及无宫颈疤痕形成。属于天然来源的中药制剂，安全性好，不良反应少；
(4)临床结果表明：本发明制得的栓剂阴道给药对高危型HPV持续感染的慢性宫颈炎及CINⅠ级患者均具有改善临床症状、体征情况的作用。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1本发明所提供的中药栓剂的制备
处方：
制备方法：取处方量的过100目筛的雄黄和黄连、白矾、冰片，混合均匀倒入熔融的混合脂肪酸甘油酯中(2670g)。混合均匀倒入加热至40℃熔融的混合脂肪酸甘油酯基质中。将搅拌后分散均匀的含药混悬溶液灌注到栓壳中，冷却后密封即得2000枚栓，单个栓重量为1.5g。
治疗方法：一天一次，一次一枚，避开月经期，连续用药(根据病变程度)一至三月。
实施例2本发明所提供的中药栓剂的制备
处方：
制备方法：取处方量的过100目筛的雄黄和盐酸小檗碱、白矾、冰片，混合均匀倒入熔融的混合脂肪酸甘油酯中(1170g)。混合均匀倒入加热至40℃熔融的混合脂肪酸甘油酯基质中。将搅拌后分散均匀的含药混悬溶液灌注到栓壳中，冷却后密封即得1000枚栓，单个栓重量为1.5g。
治疗方法：一天一次，一次一枚，避开月经期，连续用药(根据病变程度)一至三月。
实施例3本发明所提供的中药栓剂的制备
处方：
制备方法：取处方量的过100目筛的雄黄和盐酸小檗碱、白矾、冰片，混合均匀倒入熔融的混合脂肪酸甘油酯中(920g)。混合均匀倒入加热至40℃熔融的混合脂肪酸甘油酯基质中。将搅拌后分散均匀的含药混悬溶液灌注到栓壳中，冷却后密封即得1000枚栓，单个栓重量为1.5g。
治疗方法：一天一次，一次一枚，避开月经期，连续用药(根据病变程度)一至三月。
实施例4：本发明的临床效果验证
临床试验采用平行对照、随机、双盲双模拟、多中心试验设计方法，观察了本栓剂治疗慢性宫颈炎及宫颈上皮内瘤样病变所致的白带增多、性交出血，中医辨证为湿热壅盛型的临床疗效及其安全性。
临床共观察病例94例。年龄20～50岁，平均31.43岁。各组在年龄、妊娠次数、产次、宫颈病变时间、月经初潮年龄、病史、过敏史及月经周期方面，差异无统计学意义。整个治疗和观察过程由专人进行，以便统一标准。患者于月经干净2～3天后开始自行阴道上药。连用1-3个月，停药3天后复查。
94例患者用药后白带量的变化明显，总体有效率达到了75.5％(总有效率＝正常+减轻例数/总例数)，治疗前后比较差异有显著意义(P<0.05)。白带性状的改变极为显著，71例有不同程度脓性白带患者，67例患者白带均转化为正常，4例患者的脓性白带较治疗前明显好转，总体有效率达100％(总体有效率＝痊愈例数+好转例数/总例数)，治愈率达94.4％(痊愈率＝痊愈例数/总例数)，治疗前后比较差异有极显著性(P<0.01)。本栓剂阴道给药对高危型HPV持续感染的慢性宫颈炎及CINⅠ级患者的宫颈炎症治疗效果观察：有效:HPV DNA复查结果均为阴性；好转：HPV DNA复查结果有一项转为阴性；无效:HPV DNA复查结果仍为阳性。轻度炎症有效率为94.4％，中度为86.9％，重度为73.7％。二黄栓治疗慢性宫颈炎症的总有效率为85％。本研究表明，用二黄栓治疗宫颈炎症效果显著，炎症程度越轻，临床治疗效果越好，经二黄栓治疗后，宫颈表面光滑。对患者白带的临床治愈率为78.13％，显效率为14.35％，愈显率为82.71％；对患者性交出血的临床治愈率为75.94％，显效率为7.32％，愈显率为85.62％；对湿热壅盛证的临床治愈率为30.31％，显效率为56.37％，愈显率为84.78％。
二黄栓对高危型HPV持续感染不同年龄患者治疗效果
二黄栓对CINI，CINII患者治疗效果
5、毒理学研究结果显示，本发明毒性极低、用药安全。过敏性、刺激性试验和急性毒性试验表明，本发明无致敏性和刺激性，未见明显的急性毒性作用。长期毒性试验显示，本发明连续用药1-3月未发现明显毒副作用。
临床试验安全性结果
参加临床试验的病例在试验前后均进行了血、尿、大便常规、肝肾功能、心电图检查，未发现与试验药物有关的异常改变，试验过程中未见不良事件。
以下通过试验来进一步阐述本发明所述的中药组合物的有益效果。
动物的主要药效试验：
实验动物一：雌性、未孕Wistar大鼠60只，体重150-200g。购自武汉大学实验动物中心。许可证号：SYXK(鄂)2004-2006。SPF级。
1、模型制作方法：将60只大鼠随机分为正常组15只，余45只用来造模。正常组15只大鼠常规饲养，不作任何处理。造模组大鼠阴道内深部经导尿管注射20％苯酚胶浆1.5ml，隔日注射一次，共5次。观察大鼠一般情况，及阴道分泌物性状。在15只正常大鼠和45只造模组大鼠中随机选出5只和6只评价模型是否建立成功。
2、治疗方法：经上述方法造模成功后次日，剩余10只正常大鼠不做任何处理。将造模组剩余39只大鼠随机分为二黄栓组13只，阴性对照组13只，阳性对照组(消糜栓组)13只。二黄栓组大鼠阴道内给予二黄栓0.4g，阿拉伯树胶8g，蒸馏水1.5ml配成的胶浆(约为成人治疗量的30倍)，隔天一次。消糜栓组大鼠每次注入消糜栓0.36g，阿拉伯树胶8g，蒸馏水1.5ml配成的胶浆(约为成人治疗量的30倍)隔天一次。阴性对照组每次注射空白基质1.5ml，隔日一次。均为阴道深部给药，每组均给药12次，每次注射完毕后用小棉球固定于阴道口，以免药物溢出，于用药6小时后去除。
3、子宫颈病理形态学观察方法：HE染色完成后，将切片在显微镜下观察子宫颈部位的粘膜及粘膜下间质的病理形态学变化。按范英昌方法评定炎症的程度，分为正常、轻度、中度和重度。随机选择非重叠的3个视野，采用计算机图像分析系统分析炎细胞数量，取其均值。
病理形态学评定标准如下:
粘膜：鳞状上皮层次仅局部超过2～3层略有增厚为“+”，明显增厚为“++”，广泛增厚并使粘膜凹凸不平为“+++”；有些柱状上皮可见有增生而出现鳞化趋势为“+”，明显鳞化为“++”，鳞化区域广泛为“+++”；仅见极少区域鳞状上皮出现糜烂，而被邻近柱状上皮增生替代为“+”，柱状上皮增生明显替代鳞状上皮为“++”，鳞状上皮大片脱落由柱状上皮替代为“+++”；仅见极少区域糜烂突破基底膜为“+”，可见明显粘膜变形性坏死为“++”，粘膜溃疡伴有感染为“+++”。炎细胞浸润：仅见粘膜及粘膜下浅层有少量炎细胞浸润为“+”，粘膜及粘膜下间质内均有中等量炎细胞浸润为“++”，粘膜下及间质内深层均见大量广泛炎细胞浸润为“+++”。间质成纤维细胞增生：间质内仅见成纤维细胞略较正常对照组增多为“+”，成纤维细胞增生明显并有少量胶原纤维束为“++”，成纤维细胞增生伴有大量胶原纤维束形成为“+++”。根据以上评定标准，将宫颈病理改变程度分为四级
正常:六项中仅见浅层少量炎细胞浸润。
轻度:六项中两项以上“+”。
中度:六项中两项以上“+”，两项有“++”。
重度:六项中一项有“+++”，两项有“++”，三项有“+”；或三项有“+++”。
大鼠一般情况：阴性对照组动物精神食欲差，活动减少，扎堆，竖毛，少动，阴道外口可见浓稠的分泌物。中药二黄栓组除个别(1例)阴道外口有少量分泌物外，其余阴道分泌物均在治疗第五天开始逐渐减少，治疗结束时，阴道外口干燥，清洁，动物外观与正常对照组无区别。阳性对照组(消糜栓组)约2例出现阴道分泌物，动物外观略好于阴性对照组。
组织病理形态学观察
肉眼观察，阴性对照组可见阴道与宫颈组织充血，水肿明显，有的可见上皮糜烂，少数病例可见有粘膜溃疡及子宫颈管内膜出血；二黄栓组和消糜栓组病变明显轻微。正常组未见明显异常。镜下观察，阴性对照组阴道粘膜鳞状上皮层次增厚，宫颈鳞柱交界处可见有柱状上皮鳞状化生，有时可见上皮糜烂，并有糜烂部位柱状上皮替代鳞状上皮的趋势，少数病例可见有粘膜溃疡，粘膜下层毛细血管扩张充血，间质水肿，从粘膜至间质均可见大量炎细胞浸润，并可见间质纤维组织增生。阴性对照组与正常对照组相比较，其炎症程度以及炎细胞数均具有显著性差异(P<0.01)。二黄栓组与阴性对照组相应部位比较，病变均明显轻微，其炎症改变程度也明显较其它组轻，其鳞状上皮形态与正常对照组相似，粘膜下炎细胞浸润较阴性对照组明显减少(P<0.01)，组织结构与正常对照组无明显差异。二黄栓组与阳性对照组无明显差异(P>0.05)。正常对照组动物动物宫颈上皮完整，间质无炎症反应，肌层无变性，坏死。病理性形态学观察结果提示中药二黄栓可使实验性大鼠炎症程度明显减轻。
各组药物治疗后大鼠宫颈病理形态学的影响
注：与正常对照组比*p>0.05，**p<0.01；与阴性对照组比Δp<0.05，ΔΔp<0.01
4、二黄栓组用药对大鼠宫颈TNF-α，IL-10表达的影响
免疫组织化学定量分析结果：
1.TNF-α在大鼠宫颈组织中的表达本研究TNF-α在正常宫颈中见少量散在表达，阴性对照组和二黄栓组宫颈各层上皮中及间质均可表达，阳性表现为细胞浆内处出现染色程度不同的黄色或棕黄色。TNF-α在正常对照组、阴性对照组、阳性对照组、二黄栓组的吸光度值分别为0.1429±0.0028，0.1867±0.0026，0.1432±0.0034，0.1349±0.0011，阴性对照组较正常对照组明显升高(P<0.01)。二黄栓组TNF-α的表达较造模组降低(P<0.01)。正常对照组与二黄栓组无明显差异。
2.IL-10在大鼠宫颈组织中的表达本研究可见IL-10在正常宫颈中散在表达，阴性对照组和二黄栓组宫颈各层上皮中均可表达，间质中可见少量。亚细胞定位是细胞浆，呈现出染色程度不同的黄色或棕黄色。IL-10在正常对照组、阴性对照组、阳性对照组、二黄栓组吸光度值分别为0.1365±0.0033，0.1377±0.0046，0.1526±0.0059，0.1632±0.0012。阴性对照组与二黄栓组之间有显著性差异(P<0.01)。结果如下表所示：
TNF-α，IL-10在四组大鼠宫颈组织中吸光度值的比较
注：与正常组比*p<0.01，与阴性对照组比Δp<0.01
中药二黄栓对于宫颈组织TNF-α，IL-10mRNA表达的影响
1.大鼠宫颈中TNF-αmRNA的表达TNF-α在正常对照组、阴性对照组、阳性对照组和二黄栓组的相对表达量分别为0.108±0.022，0.967±0.056，0.753±0.041，0.645±0.023，扩增片断为541bp，正常对照组与阴性对照组差异具有显著性(P<0.01)，二黄栓组与阴性对照组之间相比有显著性差异(P<0.01)。正常对照组与二黄栓组织间无显著性差异(P>0.05)。
2.大鼠宫颈组织中IL-10mRNA的表达大鼠宫颈组织中，IL-10在各组均有表达，扩增片断为380bp。正常对照组、阴性对照组、阳性对照组和二黄栓组相对表达量分别0.181±0.013，0.476±0.024，0.719±0.037，0.798±0.051。二黄栓组比阴性对照组有显著性升高(P<0.01)。
四组大鼠宫颈组织中TNF-α，IL-10mRNA表达水平变化的比较
注：与正常组比*p<0.01，与阴性对照组比△p<0.01
实验动物二：
Wistar雌性、未孕，健康的大鼠70只，体重200±20g，随机分成正常组15只，模型组(苯酚胶浆用药组)55只。正常组15只大鼠不作任何处理，模型组每鼠阴道内经导尿管注射20％苯酚胶浆1.5ml，隔日给药，共5次，连续观察大鼠一般状态，用药前后称大鼠体重，每天观察并记录外阴局部及分泌物变化，大鼠阴道口是否干燥，阴道口粘膜有无红肿、充血，阴道有无流液(血)等。分组除正常对照组10只外，实验一部分已完成造模48只大鼠，随机分为3组：阴性对照组16只，阳性对照组和二黄栓组各16只。实验处理正常组常规饲养，不作任何实验处理。造模2天后，开始阴道局部给药，阳性对照组给消糜栓0.36g、阿拉伯树胶8g、蒸馏水1.5ml配成胶浆，相当于治疗量的30倍；治疗组给二黄栓0.44g，相当于30倍人治疗量(人用量为3.8g)、阿拉伯树胶8g、蒸馏水1.5ml配成胶浆；阴性对照组给空白基质制剂。分别向阴道深部注入，隔日1次，每次每只1.5ml，均给药共12次。
1.二黄栓对宫颈炎大鼠的一般情况的影响
阴性对照组动物大多数大鼠食欲下降，活动减少，四肢无力，倦卧嗜睡，被毛蓬松，动物扎堆，阴道外口可见有浓稠的分泌物，外阴红肿，体重不增或增加不明显。中药二黄栓两个治疗组除个别(1例)阴道外口有少量分泌物外，其余均在治疗第五天阴道分泌物开始逐渐减少，外阴红肿明显消退。治疗结束时，阴道外口干燥，清洁且动物外观与正常对照组无明显区别，动物活动如常；阳性对照组(消糜栓组)约2例阴道外口有分泌物，外观略好于阴性对照组。二黄栓治疗组和阳性对照组在外阴红肿、阴道分泌物、体重等与阴性对照组比较差异有显著性(P<0.05)。
2.二黄栓对宫颈炎大鼠宫颈组织形态学的影响
肉眼观察，阴性对照组的大鼠阴道、宫颈组织充血，水肿明显，有的可见上皮糜烂，少数病例可见有粘膜溃疡及子宫颈管内膜出血；显微镜下宫颈粘膜鳞状上皮层次增厚，子宫颈鳞柱交界处可见有柱状上皮鳞状化生，粘膜下层毛细血管扩张充血，间质水肿，并有糜烂部位柱状上皮替代鳞状上皮的趋势；从粘膜至间质均可见大量的炎性细胞浸润，并可见间质纤维组织增生。阴性对照组子宫颈组织与正常宫颈组织比较，差异有显著性(P<0.05)。阳性对照组和阴性对照组相应部位比较，病变均稍轻微，其炎症改变程度也较阴性对照组轻，其鳞状上皮形态与正常对照组相似，粘膜下层炎性细胞浸润较造模组减少。中药二黄栓组炎症程度明显减轻，炎性细胞浸润明显减少，未见出血和坏死，与阴性对照组比较差异有显著意义(P<0.05)。中药二黄栓组及阳性对照组组织结构接近正常对照组，无显著性差异(P>0.05)。正常对照组动物子宫内膜上皮及腺体无增生过长及萎缩现象，间质无炎症反应，肌层无变性、坏死。病理形态学结果表明中药二黄栓制剂可使实验性大鼠宫颈炎症程度明显减轻。
三组药物治疗后宫颈炎症大鼠一般情况的比较
注：与阳性对照组比*p>0.05，**p<0.01；与阴性对照组比△p<0.05
用药治疗后大鼠外阴及宫颈病理组织形态学的变化
注：与正常对照组比*p>0.05，**p<0.01；与阴性对照组比△p<0.05
3.二黄栓对宫颈炎大鼠子宫颈组织PAF和PGE2含量的影响
与阴性对照组比较，二黄栓治疗组宫颈组织中PAF和PGE2含量显著降低，其差异有非常显著意义(P<0.05)。而阴性对照组中PAF和PGE2含量明显高于正常对照组(P<0.01)、二黄栓组(P<0.05)。
各组大鼠宫颈组织中PAF，PGE2含量
注：与正常对照组比◇p<0.01，*p<0.05，**p>0.05；与阴性对照组比Δp<0.05
4.二黄栓对宫颈炎大鼠肝肾功能的影响
二黄栓组治疗结束后，血清转氨酶ALT、AST有轻微改变，但与正常组比较，均无显著差异(P>0.05)。
各组用药后大鼠肝肾功能的变化
注：与正常对照组比*p<0.05；与阴性对照组比Δp<0.05
5、二黄栓对实验大鼠宫颈炎组织中EGF、EGFR及PDGF表达的影响
中药二黄栓组中EGF在宫颈上皮细胞的表达显著高于正常对照组及阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；PDGF-BB在中药二黄栓组的宫颈上皮细胞、血管平滑肌细胞、间质细胞上的表达与正常对照组及阴性对照组相比显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。阴性对照组EGF、PDGF-BB的表达与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
组宫颈组织中EGF和PDGF-BBmRNA的RT-PCR结果
注：与正常对照组比*p<0.05；与阴性对照组比Δp<0.05。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。