童子益母草的新用途的制作方法

本发明属于中药领域，具体涉及童子益母草的新用途，尤其是童子益母草在制备降脂药物的用途。
背景技术：
：高脂血症是指血脂水平过高，可直接引起一些严重危害人体健康的疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等，尤其是心血管疾病。全世界每年3000万人死于高血脂引起的相关疾病，最为严重的为心血管疾病。随着生活水平的提高，我国冠心病的发病率、死亡率也明显上升，高血压患者10年内增加了25％，目前已达2亿人左右。据卫生部统计，我国心脑血管疾病患者首次发病年龄1/3在60岁以下，发病率高达13.6％，65岁以上的老人心脑血管疾病发病率达95％，都不同程度的存在心慌、胸闷、头晕、血压高、血脂高、疲倦、偏瘫、心绞痛等症状，发病率高。每天以2万人的速度递增，占总死亡人数的40.72％。且死亡率高，致残率高，复发率高都很高。据世界卫生组织(WHO)2001年统计：全球每年死于心脑血管疾病人数达1900万人。心脑血管疾病是名副其实的“第一杀手”。为提高对心脑血管疾病的预防、治疗能力和科研学术水平，从事降脂药物的研究是近几年人们比较关注的问题。目前降脂药物主要从以下三个途径发挥降脂作用，即外源性脂质的吸收，内源性脂质的合成，体内脂质的代谢、转运和排泄。目前临床上应用最广泛的一类降脂药是3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA)抑制剂，即他汀类药物。临床常用的他汀类药物有洛伐他汀(Lovastatin)、辛伐他汀(Simvastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、阿托伐他汀(Atorastatin)。该类药物能抑制细胞内的胆固醇合成早期阶段的限速酶，造成细胞内游离胆固醇减少，并通过反馈性上调细胞表面低密度受体的表达，加速循环血液中低密度脂蛋白的清除，利于总胆固醇(TC)的清除和转运。然而长期应用他汀类药物时多出现头痛、失眠、短暂性大便习惯改变、恶心等副作用。且此类药在与吉非罗齐合用后会产生较严重的副作用，轻者肝功损害、肌肉酸痛，重者出现横纹肌溶解、黑尿、肾功能损害等。降脂作用中药近年来研究较多，具有降血脂作用的常见的有山楂、何首乌、泽泻、决明子、大黄、灵芝、虎杖、三七、蒲黄、红花、丹参、女贞子、月苋草、广地龙、虫草、荷叶、玉竹、桑寄生、麦芽、葛根、郁金、茵陈、银杏叶等等。复方制剂或中成药也很多，如山丹芍药汤(山楂、丹参和赤芍)、百草降脂灵(山楂和丹参)、降脂宁、血脂康、地奥心血康等等。中药降血脂的作用相对于西药比较复杂，毒副反应较少。然而降血脂中药研究开发的主要瓶颈在于药物有效成分、活性部位不清，作用机制不明或研究不够透彻。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的缺陷提供一种具有降脂作用的中药，并从基因水平阐明其作用机制，开发一种疗效高，作用机制明确，无毒副作用的中药类降脂药物。本发明提供了童子益母草在制备具有降脂作用的药物中的用途。其中，所述降脂作用为降低血清总胆固醇、甘油三酯和/或低密度脂蛋白。在一些实施方案中，所述药物包括童子益母草和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物包括童子益母草和其它具有降脂作用的化合物和/或中药。按照本发明，所述药物为任意一种临床可接受的口服给药剂型或注射给药剂型。在一些实施方案中，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、溶液剂、散剂、注射剂。由上述技术方案可知，本发明提供了童子益母草在制备具有降脂作用的药物中的用途。试验表明，童子益母草对LDLR基因变化倍数为4.23，明显高于其它中药提取物。并且童子益母草还可以上调LDLR基因，下调HMGCR基因和HMGCS1基因的表达，从而降低胆固醇的合成。表明童子益母草具有降脂作用。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例2童子益母草和益母草的qPCR结果比较结果图。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。益母草为唇形科植物益母草LeonurusjaponicusHoutt.的新鲜或干燥地上部分，苦、辛，微寒。归肝、心包、膀胱经。具有活血调经，利尿消肿，清热解毒的功能，主要用于月经不调，痛经经闭，恶露不尽，水肿尿少，疮疡肿毒。童子益母草为益母草幼苗期至花前期采割未抽茎的干燥地上部分，功效与益母草相似，但不完全相同，童子益母草还具有补血、活血、强壮作用。目前童子益母草在调节血脂方面的作用未见报道。RASL-Seq技术是一种基于特征基因表达谱的药物筛选方法，即利用RNA退火-选择-连接策略，结合高通量测序，开发出的一种定量分析细胞内基因表达量的高通量筛选方法。该技术对与特定的疾病表型相关基因进行定量分析，特异性地检测与疾病相关的大规模基因表达。利用该技术，特异性的检测与高血脂相关的系列基因，可以筛选出降脂作用的药物。本发明利用RASL-Seq技术对20种中药提取物进行筛选，根据其对脂合成、代谢、转运等基因的表达的影响，确定了童子益母草具有降脂作用。其中，与脂合成、代谢、转运相关基因有HMGCR、LDLR和HMGCS1。HMGCR基因所编码的蛋白为3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶，是肝胆固醇合成的限速酶，抑制此基因的表达可抑制胆固醇的合成，从而降低血浆胆固醇，他汀类药物就是此酶的抑制剂。基因LDLR所编码的蛋白为低密度脂蛋白受体，可以结合载脂蛋白将低密度脂蛋白转运进入细胞内代谢，可清除血中三分之二的低密度脂蛋白，同时还可以抑制3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶。HMGCS1所编码的蛋白则为3-羟基-3-甲基戊二酰基辅酶A合酶1，催化乙酰辅酶转化为3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A，此基因表达的降低可抑制3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A的合成，从而抑制胆固醇的合成。本发明进一步利用实时定量基因扩增荧光检测技术发现童子益母草可以上调LDLR，下调HMGCR，下调HMGCS1基因的表达，从而降低胆固醇的合成。而益母草不具备相同的作用。因此本发明提供了童子益母草在制备具有降脂作用的药物中的用途。按照本发明，所述降脂作用为降低血清总胆固醇、甘油三酯和/或低密度脂蛋白。本发明所述药物包括童子益母草和药学上可接受的载体。本领域技术人员可将所述童子益母草直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成任意一种临床可接受的口服给药剂型或注射给药剂型。如片剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、散剂、丸剂、注射剂等。其中，填充剂如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解剂如琼脂，碳酸钙，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠，低取代羟丙基纤维素；润滑剂如滑石粉，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，月桂硫酸钠；粘合剂如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯胶。按照本发明，所述童子益母草还可以和其它具有降脂作用的化合物和/或中药组合制成药物组合物。所述其它具有降脂作用的化合物和/或中药可以为本领域技术人员已知的任意一种降脂作用的化合物和/或中药。如他汀类化合物、苯氧芳酸类化合物、烟酸类化合物以及已知的山楂、何首乌、泽泻、决明子、大黄、灵芝、虎杖、三七、蒲黄、红花、丹参、女贞子、月苋草、广地龙、虫草、荷叶、玉竹、桑寄生、麦芽、葛根、郁金、茵陈、银杏叶等具有降脂作用的中药。由上述技术方案可知，本发明提供了童子益母草在制备具有降脂作用的药物中的用途。试验表明，童子益母草对LDLR基因变化倍数为4.23，明显高于其它中药提取物。并且童子益母草还可以上调LDLR基因，下调HMGCR基因和HMGCS1基因的表达，从而降低胆固醇的合成。表明童子益母草具有降脂作用。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细阐述。如无特殊说明，实施例中所用试剂均为市售产品。实施例1一、实验方法：1、设计基因的成对探针：针对所选基因的相邻两两外显子的结合点(junction)序列设计成对探针，以避免基因组的污染。2、20种中药提取物处理细胞：HepG2细胞购自于中国医学科学院协和基础医学院，培养条件为含10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃恒温培养。选择对数生长的细胞，接种在384孔板中，每孔含3000个细胞和80μL的培养基。37℃恒温培养24小时后。在细胞培养孔定量加入0.4μL母液浓度为25mg/mL的益母草、童子益母草、大羽贯众、鸡血藤、长梗黄精、麦冬、昆明鸡血藤、龙胆、单叶蔓荆、扁豆、白花败酱草、白毛夏枯草、披针贯众、薤白、黄花败酱草、黄连、天冬、黄芩、苦参、重瓣栀子的提取物，与细胞共培养24小时后，将细胞培养板放入到HTS2自动化操作平台(平台包括以下几部分：自动化液体处理器，aglient公司；机械臂benchbot，aglient公司；塔式水浴仪，polyscience公司；测序仪器IlluminaHiSeq1500，Illumina公司)，进行后续处理。3、RASL-Seq实验：具体操作如下。A.细胞裂解：药物处理完成的384孔板细胞，放入自动化操作平台，吸弃70μL培养基/孔，余10μL培养基/孔，加入10μL细胞裂解液，室温震荡混匀10分钟；B.探针退火于mRNA：使用自动化平台加入基因探针、oligo-dT、生物素磁珠的结合缓冲液于裂解细胞的384孔板，65℃舒展RNA结构(平台控温塔)，45℃探针退火(平台控温塔)，探针特异结合到其靶标基因mRNA上；C.mRNA富集：采用oligo-dT和生物素磁珠策略富集mRNA。oligo-dT特异的结合在富含polyA的核酸区域(此区域主要集中在mRNA的3’尾端)，生物素磁珠特异吸附oligo-dT，从而将全基因组mRNA富集在磁珠表面。配合使用自动化平台磁力架模块，加入冲洗缓冲液，洗去过量的未结和的探针；D.探针的DNA连接：使用自动化平台加入T4DNA连接酶，混匀，37度孵育(平台控温塔)，将用于检测基因的成对探针(donor和acceptor两部分)连接成完整片段。F.连接探针产物的线性扩增：PCR扩增，线性放大连接探针产物，同时引入二代测序的P7和P5序列由于每个细胞的基因表达量很少，不能直接检测到探针连接产物。上述设计的成对探针，分别引入了兼容二代测序的接头，便于线性扩大产物；同时通过PCR反应，引入二代测序的P7和P5序列，达到了兼容二代测序反应的目的。G.二代测序：分为锚定桥接，预扩增，单碱基延伸测序等步骤。锚定桥接指测序的DNA片段变性成单链后与测序通道flowcell的每个lane的内表面上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用；预扩增是指添加未标记的dNTP和普通Taq酶进行固相桥式PCR扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在Flowcell的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段；单碱基延伸测序，是指在测序的flowcell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。二、数据分析：首先对测序得到的短序列(rawreads)进行质控，去除带接头、含N(N表示无法确定碱基信息)及低质量序列，得到cleanreads；接下来将cleanreads映射到参考基因集相应探针序列上去，并对映射结果进行质控，去除不饱和、比对率低等样品；同时通过定位到参考基因集的测序序列(reads)的计数来估计基因的表达水平，根据文库大小及基因长度等信息对表达值进行归一化处理后，将药物处理组与空白对照组进行比较，以空白对照组为1，计算基因表达变化倍数为药物对该基因的影响倍数。20种中药提取物对LDLR基因的影响结果见表1。表1、20种药物对LDLR基因的影响结果提取物名称LDLR基因变化倍数益母草1.06童子益母草4.23大羽贯众1.18鸡血藤1.84长梗黄精0.94麦冬1.27昆明鸡血藤0.97龙胆1.29单叶蔓荆1.29扁豆1.39白花败酱草1.06白毛夏枯草1.39披针贯众1.03薤白1.24黄花败酱草1.13黄连4.49天冬1.04黄芩1.72苦参1.42重瓣栀子1.11结果显示，童子益母草对LDLR基因变化倍数为4.23，明显高于其它中药提取物。实施例2利用实时定量基因扩增荧光检测系统，即qPCR方法验证HMGCR、LDLR、HMGCS1基因的表达，同时验证益母草，具体实验过程为：1.分别采用童子益母草、益母草提取物处理细胞。2.利用试剂盒提取RNA并反转为cDNA。3.RT-qPCR反应，程序：95℃，3min；(95℃，3s；60℃，30s)40个循环。其中，引物序列为：HMGCR：上游引物TGATTGACCTTTCCAGAGCAAG，下游引物TGATTGACCTTTCCAGAGCAAG；LDLR：上游引物ACCAACGAATGCTTGGACAAC，下游引物ACAGGCACTCGTAGCCGAT；HMGCS1：上游引物CATTAGACCGCTGCTATTCTGTC，下游引物TTCAGCAACATCCGAGCTAGA；4.数据处理：以空白对照组的基因表达量为1，药物处理组基因表达量大于1为基因表达上调，小于1为下调。qPCR3次实验结果见表2和图1。表2、童子益母草和益母草的qPCR结果比较qPCR结果显示童子益母草可以显著性上调LDLR基因，显著性下调HMGCR基因和HMGCS1基因，而益母草不具备相同的作用。p值小于0.05被认为具有统计学意义。当前第1页1 2 3