桂皮醛在制备用于靶向治疗耐药念珠菌感染药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种活性成分制备药物中的应用，更具体的说，是涉及桂皮醛在制备用于靶向治疗耐药念珠菌感染药物中的应用，属于医药
技术领域：
。
背景技术：
：侵袭性播散性耐药真菌感染是指真菌侵入人体组织、血液，并在其中生长繁殖，引致组织损害、器官功能障碍、炎症反应的病理改变及病理生理过程。近年来，随着器官移植及各种导管技术的不断推广和开展、抗菌药物的不合理使用，以及使用呼吸机辅助通气、静脉营养支持治疗的危重症患者数目不断增加，加之人类疾病谱的改变和人口结构的老龄化，医院内侵袭性播散性耐药真菌感染的发病率明显上升。侵袭性播散性耐药真菌感染是严重危及ICU重症患者的并发症，目前治疗药物较少，多系化学合成，如氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、卡泊芬净、米卡芬净、伏立康唑等。上述药物虽然有一定的抗菌作用，但由于近年来，耐药菌株不断增多，尤其是对唑类药物耐药，如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑、以及氟胞嘧啶、两性霉素B等，临床治疗仍然比较棘手、预后较差。许多血液病、肿瘤、肺部感染、免疫力低下及艾滋病患者最后死于严重的侵袭性播散性耐药真菌感染。一旦感染侵袭性播散性耐药白念珠菌、克柔氏念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、病情将会更加严重，病死率极高。目前，侵袭性播散性耐药真菌感染已越来越成为医院住院患者尤其是免疫缺陷患者继发感染后死亡的重要因素之一，已成为国内外医学界广泛的重视和急需解决的问题。因此，临床迫切需要获得一种新型、高效、低毒、安全、价廉的靶向治疗侵袭性播散性耐药真菌感染的药物。技术实现要素：有鉴于此，为克服现有技术之缺陷，本发明开始着手研究、开发能够有效治疗侵袭性播散性耐药真菌感染的药物。桂皮醛是樟科植物肉桂挥发油(占80-90％)的主要成分，是药典(2015)法定药材。国家药食同源药材目录(2015版)，桂皮为药食同源药材，是国家食品安全标准、食品添加剂使用标准(GB2076－2011)规定允许使用的食品天然香料，广泛应用于食品中。桂皮醛具有解热、解表、发散、镇痛以及抗真菌、抗肿瘤、抗病毒等多种药理作用。专利ZL03106981.9公开了一种用于深部真菌感染的中药组合物，其中包括桂皮醛、藿香油和/或丁香油，用于抗深部真菌，该专利指出经过反复实验，筛选出具有良好协同作用的桂皮醛与藿香油和/或丁香油组合物，使用其不但具有良好的抗深部真菌的作用，同时还具有广谱抗菌作用。专利ZL201410319136.9公开了一种用于制备抗念珠菌药物的中药组合物，该组合物包括桂皮醛、广藿香酮，用于抗念珠菌，该专利同时指出，在藿香油的众多组分中筛选出了广藿香酮，其抑菌活性较高，并与桂皮醛有良好的协同增效作用，二者适于配伍后使用，并且较桂皮醛与藿香油配伍后的抑菌活性有显著的提高，且安全性良好。上述两篇专利所公开的药物组合物治疗的念珠菌均是临床株。在合理用药情况下，临床株念珠菌对唑类药(如氟康唑、伊曲康唑)、丙烯胺类(如特比萘芬、奈替芬)比较敏感，但侵袭性播散性耐药真菌对上述药物却表现出不敏感。正是由于存在此种情况，才导致感染侵袭性播散性耐药念珠菌后，乏药可治，进而成为医药界焦点。由于专利ZL201410319136.9公开的抗念珠菌组合物(桂皮醛与广藿香酮)具有协同增效作用，治疗效果均优于单用桂皮醛或单用广藿香酮，因此，发明人在上述专利的教导与启示下，使用专利ZL201410319136.9公开的抗念珠菌组合物(桂皮醛与广藿香酮)展开了对侵袭性播散性耐药念珠菌感染的研究。然而，出乎意料的是，桂皮醛与广藿香酮联合使用并未能达到良好的、预期的治疗结果。经对中药进行大量的筛选、有效成分的提取、体外抗菌活性实验、毒理、药理、抗真菌机制的研究、动物模型的建立、药物配方的研制和制备等，意外的发现了单独使用桂皮醛却取得了意想不到的治疗结果，遂作出本发明。本发明在现有技术教导与启示的基础上，反其道而行之，首次提出不使用桂皮醛与广藿香酮联合用药，而是单独使用桂皮醛用于治疗侵袭性播散性耐药念珠菌感染。因此，本发明解决现有技术问题的技术方案如下所述。桂皮醛在制备用于靶向治疗耐药念珠菌感染药物中的应用，所述耐药念珠菌为侵袭性播散性耐药念珠菌。进一步的，上述应用，所述侵袭性播散性耐药念珠菌为白念珠菌、克柔氏念珠菌、光滑念珠菌或近平滑念珠菌。为实现上述应用，本发明的第一种方式是，所述用于治疗耐药念珠菌感染药物，其由以下重量份的组分制备而成：桂皮醛40～80、吐温-800.1～2、生理盐水溶液900～1000。本发明的第二种方式是，所述用于治疗耐药念珠菌感染药物，其由以下重量份的组分制备而成：桂皮醛40～80、吐温-800.1～2、β-环糊精8～15。本发明的第三种方式是，所述用于治疗耐药念珠菌感染药物，其由桂皮醛单体包合物和/或药学上可接受的载体制备而成。针对该第三种方式，进一步的，所述桂皮醛单体包合物由以下重量份的组分制备而成：桂皮醛10～60、羟丙基-β-环糊精20～80。所羟丙基-β-环糊精为2-羟丙基-β-环糊精。针对该第三种方式，所述桂皮醛单体包合物由以下步骤制备：1)将2-羟丙基-β-环糊精加入到80℃去离子蒸馏水中，搅拌溶解，然后降温至20℃，制备得到水溶液，备用；其中，2-羟丙基-β-环糊精与去离子蒸馏水的重量mg/体积mL比为1：10；2)搅拌下，向步骤1)所得水溶液中缓慢滴加用乙酸乙酯溶解的桂皮醛，滴加完毕后，升温至70℃，并继续搅拌1小时，然后置冰箱冷藏24小时，得冷藏液，备用；其中，桂皮醛与乙酸乙酯的体积mL比为1：6；3)将步骤2)所得的冷藏液过滤，固体物用少量蒸馏水洗涤后，低温5℃真空干燥24小时，研碎，过筛80目，再用乙酸乙酯洗涤三次后晾干，即得白色疏松状桂皮醛单体包合物。本发明结合对抗真菌作用历经十几年的实验研究，经对中药进行大量的筛选、有效成分的提取、体外抗菌活性实验、毒理、药理、抗真菌机制的研究、动物模型的建立、药物配方的研制和制备等，意外的发现了单独使用桂皮醛可以有效治疗侵袭性播散性耐药念珠菌。这种发现突破了现有技术的教导与启示，是本领域技术人员不经过创造性劳动就得不出来的，具有突出的实质性特点和显著的进步。为了进一步研究桂皮醛治疗侵袭性播散性耐药念珠菌的体内疗效、安全性及药物在体内作用的靶位机制。本发明采用了组织真菌学、组织病理学、组织生物化学、组织电镜学的方法，研制出桂皮醛制剂(包括口服剂、注射剂)。为临床呼吸科、血液科、急诊ICU、肿瘤科、器官移植等科室的真菌感染提供一种高效、低毒及靶向治疗侵袭性播散性耐药念珠菌感染的新型抗菌药物，为研发中药治疗侵袭性播散性耐药念珠菌感染提供体内药效学及作用机制及理论实验依据，为科技成果转化创造条件。附图说明图1孢子圆形，胞壁、胞膜清晰图2菌丝胞壁胞膜清晰图3菌丝极度变形，胞壁受损严重图4菌丝外2-4层胞壁溶解消失图5菌丝分解大部分胞壁溶解破坏，仍可见菌丝隔膜及胞膜图6菌丝胞壁2-4层溶解破坏脱落，菌丝隔膜及胞膜清晰图7胞子椭圆形，细胞壁变薄，表面不光滑，周围组织水肿，胞核及内容物消失，但胞膜完整图8胞子椭圆形，细胞壁变薄，表面不光滑，周围组织水肿，胞核及内容物消失，但胞膜完整图9菌丝外3-4层胞壁脱落，隔膜周围存有残留胞壁，但胞膜完整图10菌丝外3-4层胞壁脱落，隔膜周围存有残留胞壁，但胞膜完整清晰具体实施方式为了使本领域技术人员能够更好地理解本发明，下面结合实施例，对本发明的技术方案进一步阐述。需要说明的是，以下描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，本领域普通技术人员基于本发明实施例，在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。对比试验例1桂皮醛与广藿香酮联合使用与桂皮醛单独使用的对比对比实施例1、2为专利ZL201410319136.9公开的实施例1、2。实施例1、2为对比实施例1、2去掉广藿香酮，其他保持不变。受试侵袭性播散性耐药念珠菌临床株来自河北医科大学第二医院真菌室，痰标本直接镜检可见大量菌丝及芽生孢子，培养有酵母样菌落生长，经鉴定及药敏试验为侵袭性播散性耐药白念珠菌、光滑念珠菌、克柔氏念珠菌，近平滑念珠菌，结果见表1。表1抗真菌药对侵袭性播散性耐药念珠菌MICmgml-1值依据专利ZL201410319136.9公开的实验例1所述方法测定对比实施例1与实施例1分别治疗侵袭性播散性耐药念珠菌的效果，结果见表2。表2桂皮醛与广藿香酮联合使用与桂皮醛单独使用的MIC值————桂皮醛与广藿香酮联合使用桂皮醛单独使用侵袭性播散性耐药念珠菌株nMIC/mgml-1MIC/mgml-1白念珠菌100.01950.0097光滑念珠菌100.01950.0097克柔念珠菌100.03910.0195近平滑念珠菌100.01950.0097由表2数据可知，单独使用桂皮醛对侵袭性播散性耐药白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌的MIC均值为0.0097mgml-1，对侵袭性播散性耐药克柔念珠菌的MIC均值为0.0195mgml-1。桂皮醛单独使用比桂皮醛与广藿香酮联合使用抗真菌作用显著增强，此结果确实超出预期。为进一步发挥桂皮醛单独使用的临床效果，本发明提出将桂皮醛使用羟丙基-β-环糊精包含，得桂皮醛单体包合物。该桂皮醛单体包合物可通过药学
技术领域：
常规技术进一步制成口服、注射剂型。所述桂皮醛单体包合物由以下重量份的组分制备而成：桂皮醛10～60、羟丙基-β-环糊精20～80。所羟丙基-β-环糊精为2-羟丙基-β-环糊精。实施例2本发明所述的桂皮醛单体包合物组成：桂皮醛1.25g(50重量份)2-羟丙基-β-环糊精1.25g(50重量份)制备方法：1)将2-羟丙基-β-环糊精加入到90℃去离子蒸馏水中，搅拌溶解，然后降温至20℃，制备得到水溶液，备用；其中，2-羟丙基-β-环糊精与去离子蒸馏水的重量mg/体积mL比为1：8；2)搅拌下，向步骤1)所得水溶液中缓慢滴加用乙酸乙酯溶解的桂皮醛，滴加完毕后，升温至70℃，并继续搅拌1小时，然后置冰箱冷藏24小时，得冷藏液，备用；其中，桂皮醛与乙酸乙酯的体积mL比为1：6；3)将步骤2)所得的冷藏液过滤，固体物用少量蒸馏水洗涤后，低温5℃真空干燥24小时，研碎，过筛80目，再用乙酸乙酯洗涤三次后晾干，即得白色疏松状桂皮醛单体包合物。实施例3本发明所述的桂皮醛单体包合物组成：桂皮醛1g(10重量份)2-羟丙基-β-环糊精2g(20重量份)制备方法：同实施例2。实施例4本发明所述的桂皮醛单体包合物组成：桂皮醛6g(60重量份)2-羟丙基-β-环糊精8g(80重量份)制备方法：同实施例2。对比实施例2桂皮醛单体包合物MIC值同理，依据专利ZL201410319136.9公开的实验例1所述方法测定对比实施例1与实施例2分别治疗侵袭性播散性耐药念珠菌的效果。受试侵袭性播散性耐药念珠菌临床株来自河北省第二医院真菌室，痰标本直接镜检可见大量菌丝及芽生孢子，培养有酵母样菌落生长，经鉴定为白念珠菌、热带念珠菌、克柔氏念珠菌，结果见表3。表3桂皮醛与广藿香酮联合使用与桂皮醛单体包合物的MIC值————桂皮醛与广藿香酮联合使用桂皮醛单体包合物侵袭性播散性耐药念珠菌株nMIC/mgml-1MIC/mgml-1白念珠菌100.01950.0048光滑念珠菌100.01950.0048克柔念珠菌100.03910.0048近平滑念珠菌100.01950.0048由表3数据可知，桂皮醛单体包合物对侵袭性播散性耐药白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌MIC均值为0.0048mgml-1。桂皮醛单体包合物比桂皮醛普通方式使用、桂皮醛与广藿香酮联合使用抗真菌作用都显著增强，此结果又进一步超出预期。研究例1实施例2桂皮醛单体包合物治疗BALB/c小鼠侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌感染体内药效学及作用靶位机制的实验研究一、研究步骤1、侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌小鼠分组：410只BALB/c小鼠随机分为免疫抑制组40只、模型组80只、实施例2桂皮醛单体包合物治疗组260只(口服药物组、氟康唑对照组、注射药物组)，安全用药组30只。2、克柔氏念珠菌悬液制备将克柔氏念珠菌制备成1x107cfu/ml菌悬液0.25ml注射到免疫抑制BALB/c小鼠腹腔内，于第五天取小鼠肾脏组织置于37℃孵育箱内72小时，其生长的菌株为增强毒力的实验菌株，将菌株用2-HP-β-CD去离子水制备成1x107cfu/ml浓度的菌悬液备用。再将菌悬液用2-HP-β-CD去离子水稀释10倍，取100ul接种于葡萄糖蛋白胨琼脂平板内，37℃培养，计数，确定菌株的存活率。3、免疫抑制ICR小鼠模型的建立(40只)免疫抑制组、模型组、桂皮醛单体包合物口服药物组、桂皮醛单体包合物注射药物组、伏立康唑口服对照组、安全用药组、1％去离子水对照组及质控组，于第一、二天或第三天，每只小鼠腹腔对照组，连续2天腹腔注射1％去离子水0.25ml。4、免疫抑制BALB/c小鼠肺及系统性克柔氏念珠菌感染模型建立：对口服药物组、氟康唑对照组、注射药物组、模型组、葡聚糖对照组的免疫抑制小鼠腹腔注射1x107cfu/ml的菌悬液0.25ml，鼻腔滴注1x107cfu/ml的菌悬液30ul，建立免疫抑制系统性播散性侵袭性肺部克柔氏念珠菌感染的模型。5、桂皮醛单体包合物治疗免疫抑制BALB/c小鼠侵袭性播散性耐药肺克柔氏念珠菌感染对口服药物组(高、中、低浓度)，氟康唑对照组(高、中、低浓度)，以及1％去离子水对照组，每只小鼠灌胃0.5ml，每日1次，连续21天。对注射药物组(高、低浓度)，腹腔注射1％去离子水组，每只小鼠腹腔注射0.25ml，每日1次，连续21天。安全用药组(超高浓度药物)每只小鼠灌胃0.5ml，每日1次，连续28天。二、研究结果1、桂皮醛单体包合物口服治疗免疫抑制BALB/c小鼠小鼠侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌系统性感染的组织真菌学、病理学、生物化学的疗效。结果如下。(1)口服桂皮醛单体包合物组织真菌学的疗效，见表4。表4口服桂皮醛单体包合物对小鼠侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌系统性感染的组织真菌学影响口服桂皮醛单体包合物中、高浓度，肾克念、肺克念、肝克念组织真菌学的疗效，均达到80％。(2)口服桂皮醛单体包合物组织病理学疗效，见表5。表5口服桂皮醛单体包合物对小鼠侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌系统性感染的组织病理学影响药物治疗的高浓度组，肾、肺、肝组织中均未见菌丝及芽生孢子，有2例肾，3例肺，2例肝有炎症性细胞浸润，治疗有效率70-80％。中浓度组，肾、肺、肝组织中均未见菌丝及芽生孢子。有2例肾，其中1例肺组织中可见炎症性细胞浸润，治疗有效率80％。低浓度组，2例肾可见炎症细胞浸润，其中1例可见菌丝，3例肺、2例肝可见炎症细胞浸润，治疗有效率70％。经对高浓度、中浓度、低浓度的肾、肺、肝组织病理观察，治疗有效率70-80％。口服中剂量240mg/kg桂皮醛单体包合物治疗侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌系统性感染2-3周肾、肺、肝病理。2、桂皮醛单体包合物注射治疗免疫抑制BALB/c小鼠侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌系统性感染(1)真菌学疗效，见表6。表6注射桂皮醛单体包合物对小鼠感染侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌的组织真菌学影响(2)组织病理学疗效，见表7。表7腹腔注射桂皮醛单体包合物治疗免疫抑制小鼠感染侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌的组织病理学的影响高浓度药物治疗组和低浓度药物治疗组，肾、肺组织中均未见菌丝及芽生孢子，高浓度仅有1例，低浓度有2例在肾组织及肺组织中可见炎性细胞浸润。经病理学观察，高浓度有效率在90％，低浓度有效率在80％，腹腔注射桂皮醛治疗免疫抑制小鼠克柔氏念珠菌感染的组织病理学，有效率达到85-90％。3、桂皮醛单体包合物口服剂、注射剂对免疫抑制BALB/c小鼠感染侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌的β-(1,3)-D葡聚糖检测的疗效率在80％，见表8。表8桂皮醛单体包合物对免疫抑制小鼠感染侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌的1,3-β-D-葡聚糖检测的结果桂皮醛单体包合物口服剂(高、中、低浓度)、注射剂(高、低浓度)，用药后1,3-β-D-葡聚糖检测的结果均低于模型组(5930.36mg/ml)，均获得较好的治疗效果。口服药物组中浓度药物疗效最好，桂皮醛单体包合物注射药物治疗效果优于口服药物。三、桂皮醛单体包合物对免疫抑制BALB/c小鼠肺组织中侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌胞壁超微结构作用靶位影响机制的结果-体内电镜实验结果肺克柔氏念珠菌模型：菌丝、孢子及芽生孢子在肺组织内细胞壁外层光滑，胞壁四层清晰，胞膜清晰完整，胞核、内容物完整，菌丝隔膜清晰图1-2。桂皮醛单体包合物治疗肺克柔氏念珠菌机理：用药14天(提前用药3天)胞壁变化，菌丝、孢子及芽生孢子在肺组织内，呈不规则形，胞壁严重缺损变薄，细胞内外水肿，胞核及内容物溶解消失，但菌丝隔膜及胞膜清晰完整，图3-6。桂皮醛单体包合物治疗肺克柔氏念珠菌疗效：用药14天(提前用药3天)菌丝、胞子水肿变形，细胞壁变薄，表面不光滑留有残余胞壁，周围组织水肿，胞核及内容物消失，但胞膜完整，图7-10。通过研究，桂皮醛单体包合物治疗免疫抑制BALB/c小鼠侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌感染的组织真菌学、病理学、生物化学的疗效。1、组织真菌学疗效(1)桂皮醛单体包合物口服剂，桂皮醛单体包合物240mg/kg，对系统播散性克柔氏念珠菌感染的肾、肺、肝组织真菌学的疗效，均达到80％。(2)桂皮醛单体包合物注射剂，桂皮醛单体包合物100mg/kg，对侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌感染的肾、肺、肝组织真菌学疗效，均达到80-90％。2、组织病理学疗效(1)桂皮醛单体包合物口服剂，桂皮醛单体包合物240mg/kg，氟康唑240mg/kg，桂皮醛单体包合物对侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌感染的肾、肺、肝均有较好的组织病理学疗效，均达到80-90％，对照组氟康唑组织病理学疗效，30％。(2)桂皮醛单体包合物注射剂，桂皮醛240mg/kg，对侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌感染的肾、肺、肝组织病理学疗效，均达到90-100％。3、组织生物化学疗效(1)桂皮醛单体包合物口服剂，桂皮醛单体包合物240mg/kg，氟康唑240mg/kg，治疗侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌感染β-(1,3)-D葡聚糖疗效，桂皮醛达到81％，氟康唑达到10-30％。(2)桂皮醛单体包合物注射剂，桂皮醛单体包合物100mg/kg，对侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌感染的肾、肺、肝β-(1,3)-D葡聚糖疗效，均达到79％。4、组织电镜机理及药效(1)电镜机理：桂皮醛单体包合物在体内直接作用在侵袭性播散性耐药克柔氏念珠菌外三四层细胞壁(β-(1,3)-D葡聚糖层)，使孢子、菌丝胞壁严重缺损、片状脱落、溶解、变薄，表面粗糙、残缺不整。但细胞膜无损、清晰、完整，菌丝隔膜、细胞核、细胞器及内容物较完整。说明药物在体内直接作用在真菌细胞壁的β-(1,3)-D葡聚糖层。而人类细胞没有细胞壁，对人类不易产生毒副作用的理论依据。(2)电镜的药效，当药物破坏细胞壁后穿过细胞膜进入菌体，使胞内外物质交换受阻，破坏了细胞对营养物质的吸收及生物合成，导致线粒体、溶酶体等细胞器水肿、溶解、变性、坏死而起到强大的杀菌作用。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3