任意位置多点光聚焦及光斑优化的方法与系统与流程

本发明属于光遗传技术光刺激和显微成像领域，特别涉及任意位置多点光聚焦及光斑优化的方法与系统，并应用于显微成像。

背景技术：

光遗传学(optogenetics)技术——将激活信号通路的光敏蛋白基因编码，用自定义的动作电位激励模式代替内源的电活动——是一种将光学方法和遗传学方法相结合从而精确控制细胞活动的方法。光遗传学技术带来的神经学上的革命转变了我们研究神经回路的方法，神经科学研究者能够通过对神经元地直接操纵来来直观地研究各个神经元、多个核团之间的关系与内在的相互作用，从而进一步直观地阐明大脑神经环路的结构、功能和行为。利用光遗传学技术对大脑神经环路地研究，神经科学研究者能够结合动物模型探究如帕金森综合症、阿尔茨海默病、抑郁症等神经性疾病，研究其病理与治疗方法。

自适应光学技术最早被用于天体物理，利用波前传感器实时测量并补偿各种干扰引起的光学系统的波前畸变，然后通过波前校正器如变形镜、空间光调制器等对畸变进行补偿。本世纪初随着其它领域对自适应光学的逐渐增长的兴趣，其应用范围开始扩展，并逐步应用于生物医学成像中，以校正生物样品深层成像时样品散射特性带来的光学畸变，以增加光学成像技术在生物样品中的成像深度。

双光子钙离子成像技术被用来测量活体小鼠神经元单细胞层面的兴奋及其与行为相关的活动，但传统的商用双光子成像系统只能对单一区域进行刺激与显微成像。然而，用于感觉和运动的神经元通常分布在脑区的多个区域之中，这极大地限制了神经环路尤其是多脑区间相互作用的研究。

技术实现要素：

本发明目的在于利用针对现有光遗传学刺激方案只能对单一区域进行刺激的局限，通过将空间光调制器和自适应光学技术相结合，提供了一种任意位置多点光聚焦及光斑优化的方法与系统。

本发明采用技术方案是：

一、一种任意位置多点光聚焦及光斑优化的方法：

1)不加载样品，激光器发射出光束，经过准直扩束后，再经过带有初始分区的梯度分布的基底相位的空间光调制器调制，然后经过聚焦透镜聚焦，在焦平面处得到多个理想聚焦光斑，并用成像透镜在工业相机上记录其光斑分布；

2)加载样品，激光器发射出光束，经过准直扩束后，再经过带有梯度分布的基底相位的空间光调制器调制，然后经过聚焦透镜聚焦到散射介质，在位于散射介质内部的焦平面处得到多个畸变散射光斑，并用成像透镜在工业相机上记录其光斑分布；

3)将空间光调制器的图像进行分区，对每个分区依次分别加载相位，激光器多次发射出光束经过准直扩束后，再经过相位校正后的空间光调制器调制，然后经过聚焦透镜聚焦到散射介质，在位于散射介质内部的焦平面处得到一系列多个校正散射光斑，用成像透镜在工业相机上记录并处理其光斑分布，完成一次校正循环，得到新的调制相位分布；

4)激光器多次发射出光束经过准直扩束后，经过加载有步骤3)获得的新的调制相位分布的空间光调制器调制，然后经过聚焦透镜聚焦，聚焦光束进入散射介质，在散射介质内部的焦平面处得到校正循环后的多个校正光斑并用成像透镜在工业相机上记录，然后将得到的校正循环后的多个校正光斑与步骤1)中所得到的多个理想聚焦光斑进行互相关计算，得到校正循环后的互相关系数并记录；

5)重复步骤3)到4)，迭代进行多次循环校正，直到校正循环后的互相关系数大于预设系数阈值，则停止处理，最后一次得到的空间光调制器中各分区的相位作为最终成像系统的相位，最后一次得到的校正循环后的多个校正光斑作为最终光斑，并用成像透镜在工业相机上记录。

所述步骤3)具体是指：

3.1)将空间光调制器的图像像素点以n×n方式均匀分区，激光器多次发射出光束经过准直扩束后，再经过相位校正后的空间光调制器调制，然后经过聚焦透镜聚焦到散射介质，在位于散射介质内部的焦平面处得到多个校正散射光斑；

3.2)将得到的校正散射光斑与理想聚焦光斑进行互相关计算，得到m个相关系数；

3.3)记录相关系数最大时分区的相位值，并以该相位值固定赋予添加到所对应分区的基底相位上；

3.4)空间光调制器从第一个分区开始到最后一个分区重复上述步骤，每个分区依次进行相位变化，完成所有分区后获得最终一次校正循环后的相位分布，作为新的调制相位分布。

所述步骤3.1)中空间光调制器是采用以下方式调制：将一分区内所有像素点从2π/m到2π进行相位值的依次间隔扫描，扫描间隔为2π/m，m表示相关系数的总数，可由用户自定义，其他分区的相位保持不变，每个相位值下进行一次，从而获得一组需校正损耗光斑。

所述的散射介质采用活体生物组织、离体生物组织、毛玻璃和带非荧光小球的琼脂等其中的一种。

所述步骤1)中空间光调制器带有梯度分布的基底相位，空间光调制器分区，每个分区的相位不相同形成梯度的相位分布，其分区与步骤3)的分区可相同也可不相同，根据所需聚焦点数量进行合理分区。

优选地，所述步骤1)中的空间光调制器初始的分区的梯度分布的基底相位的分区是将空间光调制器的图像进行分区，对每个分区依次分别加载相位，以边相邻的两个分区的相位值不同，以角相邻的两个分区的相位值可不同可相同。

所述步骤1)中的空间光调制器各个分区的相位分布是：比如以对角连接的所有分区相位值相同(如国际象棋棋盘的黑白分隔方式)，由此形成两种不同的相位分布，从而产生两个聚焦光斑。例如若所需为两个聚焦点，可将空间光调制以2×2分区，左上和右下区负责第一个聚焦点，左下和右上负责第二个聚焦点。抑或可将空间光调制器以1×2或2×1分区，左右或上下各负责一个聚焦点。抑或可将空间光调制以N×N交错式分区(N为若干值)，其中每间隔一个分区的所有子区负责其中一个聚焦点，其余的所有子区负责另一个聚焦点乃至更多聚焦点(依据用户要求，可参考国际象棋棋盘的黑白分隔方式)，基底相位梯度分布分区应包括类似或相仿的所有分区方式。

棋盘式的初始分区和n×n校正时的分区是独立的不同分区方法，并只在步骤1)中作为初始值给予空间光调制器，用于产生多个聚焦光斑；棋盘式初始分区的每个子区不是一个统一值而是分布，比如由左到右增大的这样。

二、一种任意位置多点光聚焦及光斑优化的系统：

系统包括激光器、扩束模块、空间光调制器和聚焦透镜，扩束模块布置在激光器出射端的前方，激光器发射出光束经扩束模块平行扩束后入射到空间光调制器，空间光调制器出射端的前方依次置有聚焦透镜，聚焦透镜前方设有散射介质，散射介质位于聚焦透镜的焦平面上；激光器发射出光束依次经第一光束准直扩束模块透镜、第一光束准直扩束模块透镜平行扩束后入射到空间光调制器，空间光调制器反射光经聚焦透镜聚焦到散射介质内部的焦平面上。

所述的扩束模块包括第一光束准直扩束模块透镜和第一光束准直扩束模块透镜，第一光束准直扩束模块透镜和第一光束准直扩束模块透镜平行依次布置在激光器出射端的前方，激光器发射出光束依次经第一光束准直扩束模块透镜、第一光束准直扩束模块透镜平行扩束后入射到空间光调制器。

还包括依次置于聚焦透镜前方的成像透镜和CMOS相机，散射介质置于聚焦透镜和成像透镜之间，聚焦到散射介质内部的焦平面的光斑经成像透镜入射到CMOS相机接收。

本发明的有益效果是：

本发明利用空间光调制器实现了多聚焦点的光刺激，突破了现有光遗传学光刺激系统的局限，为相关领域研究人员探究大脑神经环路多区域间的关联与整体性研究提供了技术支持，摆脱了以往同一时刻只能在单一区域中研究大脑神经环路的困境。

本发明同时通过自适应光学技术，校正了多聚焦点在深层组织内部的散射畸变，优化散射光斑分布，从而在更大深度下实现多点光刺激，相较于现有手段可以在大脑内部更大深度下进行光刺激，并应用于脑组织大深度下的显微成像。

并且本发明可方便地与已有的各种显微成像技术相结合，实现同步的光刺激与显微成像，有利于行为学与神经环路等面向大脑不同区域的研究。

附图说明

图1为本发明系统的结构示意图；

图2为理想两个聚焦光斑分布图；

图3为经过散射介质内部的畸变两个散射光斑分布图；

图4为第一次校正循环的两个校正光斑分布图；

图5为第五次校正循环的两个校正光斑分布图；

图6为五次校正循环得到的互相关系数曲线图；

图7为产生2个聚焦光斑的初始分区的梯度分布的基底相位图。

图8为产生4个聚焦光斑的初始分区的梯度分布的基底相位图。

具体实施方式

下面结合附图来详细说明本发明。

如图1所示，本发明系统包括激光器1、第一光束准直扩束模块透镜2、第一光束准直扩束模块透镜3、空间光调制器4、聚焦透镜5、成像透镜7和CMOS相机8，第一光束准直扩束模块透镜2和第一光束准直扩束模块透镜3平行依次布置在激光器1出射端的前方，激光器发射出光束经第一光束准直扩束模块透镜2和第一光束准直扩束模块透镜3平行扩束后入射到空间光调制器4，空间光调制器4出射端的前方依次置有聚焦透镜5、成像透镜7和CMOS相机8，散射介质6置于聚焦透镜5和成像透镜7之间，散射介质6位于聚焦透镜5的焦平面上。

激光器发射出光束依次经第一光束准直扩束模块透镜2、第一光束准直扩束模块透镜3平行扩束后入射到空间光调制器4，空间光调制器4反射光经聚焦透镜5聚焦到散射介质6内部的焦平面上，焦平面的光斑经成像透镜7入射到CMOS相机8接收。

本发明的实施例及其具体过程如下：

1)激光器发射出的经过准直扩束的平行光束，经过带有初始的分区的基底相位梯度分布的空间光调制器调制，然后经过聚焦透镜聚焦，在焦平面处得到理想的多个聚焦光斑分布并用成像透镜在工业相机上记录，如图2所示，在算法中通过将激光器发射出的经过准直扩束的平行光束设为一个圆内为1圆外为0的N×N入射光束矩阵(N为若干值，在本具体实施案例中选取为1024)，乘以基底相位矩阵作为虚部，再乘以透镜的相位矩阵得到聚焦光束矩阵，聚焦光束矩阵在频域乘以菲涅尔衍射脉冲响应的方式的得到多个聚焦光斑分布。其中第一次校正前赋给空间光调制器的初始的基底相位梯度分布根据所需聚焦点数量进行合理分区，例如若所需为两个聚焦点，可将空间光调制以2×2分区，左上和右下区负责第一个聚焦点，左下和右上负责第二个聚焦点；抑或可将空间光调制器以1×2或2×1分区，左右或上下各负责一个聚焦点；抑或可将空间光调制以N×N交错式分区(N为若干值)，其中每间隔一个分区的所有子区负责其中一个聚焦点，其余的所有子区负责另一个聚焦点乃至更多聚焦点(依据用户要求，可参考国际象棋棋盘的黑白分隔方式，如图8所示4个聚焦点的分区方式)，以及其他类似或相仿的分区方式。在本具体实施案例中选取第一种2×2分区方式，如图7所示。

2)激光器发射出的经过准直扩束的平行光束，经过带有基底相位梯度分布的空间光调制器调制，然后经过聚焦透镜聚焦，聚焦光束进入具有一定厚度的散射介质内部，在散射介质内部的焦平面处得到畸变的多个散射光斑分布并用成像透镜在工业相机上记录，在算法中通过将激光器发射出的经过准直扩束的平行光束设为一个圆内为1圆外为0的N×N入射光束矩阵(N为若干值)，乘以基底相位矩阵作为虚部，再乘以透镜的相位矩阵得到聚焦光束矩阵，聚焦光束矩阵在频域乘以菲涅尔衍射脉冲响应并在光到达样品内部后额外逐层累乘一层散射介质相位分布(在算法中将散射介质划分成一定厚度的若干层，每一层相位分布视作沿光轴不变)的方式的得到畸变的多个散射光斑分布，如图3所示，在本具体实施案例中对畸变的散射光斑进行了互相关系数计算得到校正前的互相关系数为0.012；

3)将空间光调制器分区，对第一个分区进行一定相位变化范围，一定相位间隔的相位划分得到若干个校正相位值，取划分出的第一个校正相位值，其他分区相位保持不变，将得到的相位分布加上分区的基底相位梯度分布，从而得到校正相位分布，然后将校正相位分布重新加载到空间光调制器上；

4)激光器发射出的经过准直扩束的平行光束，经过带有校正相位分布的空间光调制器调制，然后经过聚焦透镜聚焦，聚焦光束进入具有一定厚度的散射介质内部，在散射介质内部的焦平面处得到校正的多个散射光斑分布并用成像透镜在工业相机上记录，在算法中通过将激光器发射出的经过准直扩束的平行光束设为一个圆内为1圆外为0的N×N入射光束矩阵(N为若干值)，乘以校正相位矩阵作为虚部，再乘以透镜的相位矩阵得到聚焦光束矩阵，聚焦光束矩阵在频域乘以菲涅尔衍射脉冲响应并在光到达样品内部后额外逐层累乘一层散射介质相位分布(在算法中将散射介质划分成一定厚度的若干层，每一层相位分布视作沿光轴不变)的方式的得到校正的多个散射光斑分布；

5)将步骤(1)中所得到的理想的多个聚焦光斑分布与步骤(4)中所得到的校正的多个散射光斑分布进行互相关计算，得到第一个分区的第一个校正相位值的互相关系数并记录，如本具体实施案例中为0.026；

6)将空间光调制器第一个分区依次取划分出的不同的校正相位值，重复步骤(3)到(5)得到一系列的互相关系数，取其中最大的互相关系数,所对应的校正相位值赋值给第一个分区并固定，如本具体实施案例中为第13个相位值：13π/50。

7)对剩余的分区依次重复(2)到(5)，得到所有分区的校正相位值并固定作为新的基底相位梯度分布，完成第一次校正循环，获得的校正光斑分布如图4所示；

8)激光器发射出的经过准直扩束的平行光束，经过带有新的基底相位梯度分布的空间光调制器调制，然后经过聚焦透镜聚焦，聚焦光束进入具有一定厚度的散射介质内部，在散射介质内部的焦平面处得到第一次校正循环的多个校正光斑分布并用成像透镜在工业相机上记录，在算法中通过将激光器发射出的经过准直扩束的平行光束设为一个圆内为1圆外为0的N×N入射光束矩阵(N为若干值)，乘以校正相位矩阵作为虚部，再乘以透镜的相位矩阵得到聚焦光束矩阵，聚焦光束矩阵在频域乘以菲涅尔衍射脉冲响应并在光到达样品内部后额外逐层累乘一层散射介质相位分布(在算法中将散射介质划分成一定厚度的若干层，每一层相位分布视作沿光轴不变)的方式的得到第一次校正循环的多个散射光斑分布，然后将得到的第一次校正循环的多个校正光斑分布与步骤(1)中所得到的理想的多个聚焦光斑分布进行互相关计算，得到第一个分区的第一次校正循环的互相关系数并记录，如本具体实施案例中为0.72；

9)重复步骤(2)到(8)，进行一系列循环校正，直到第若干次校正循环的互相关系数大于用户预设值，循环停止得到所有分区最终的校正相位值分布和最终的校正光斑分布并用成像透镜在工业相机上记录，如本具体实施案例中用户预设值设定为0.785，在第5次循环校正后得到互相关系数为0.787，大于用户预设值循环停止，如图6所示，5次循环校正后获得的校正光斑分布如图5所示。

从结果数据可以看到，本发明将互相关系数低于0.05的两个畸变的散射光斑通过一次校正，互相关系数达到0.72，并通过多次循环校正接近0.8，基本接近于理想光斑。由此，本发明通过将空间光调制器和自适应光学技术相结合，利用空间光调制器分区实现多区域光聚焦，利用自适应光学技术校正了大脑内部大深度下的散射畸变，优化散射光斑分布，突破了现有光遗传学光刺激与显微成像方案只能对单一区域进行刺激的局限，使得相关领域研究人员能够在大脑内部更大深度下同时进行多区域光刺激和显微成像。