一种miRNA在制备治疗矽肺药物中的应用的制作方法

本发明属于核酸类药物领域，具体涉及一种miRNA在制备治疗矽肺药物中的应用。

背景技术：

矽肺(Silicosis)是由于职业性暴露于二氧化硅粉尘而引起的一种以肺组织弥漫性纤维化为主要特征的间质性肺疾病。矽肺一旦发生，其病情呈进行性发展，不仅严重危害矽尘接触工人的健康，严重降低其劳动能力和生活质量，而且最终会给国家造成巨大的经济损失。我国是尘肺病大国，2014年全国报告的尘肺病占职业病报告总例数的89.66％，其中主要为煤工尘肺和矽肺。目前，我国矽肺的发病率仍呈上升趋势，其造成的身体危害和经济损失已受到广泛的关注，已成为影响到社会健康持续发展的重大公共卫生问题，矽肺的防治形势十分严峻。目前对矽肺的治疗虽缺乏特效的方法，但在研制延缓病情发展的药物方面仍取得了一系列的成就。目前，临床上应用于治疗矽肺的西药主要有克矽平、磷酸羟基喹哌、柠檬酸铝以及汉防己甲素等，其作用机制主要是抗氧化应激反应、保护细胞与细胞膜结构、抑制胶原蛋白的合成等。但长期的临床应用也发现这些西药普遍存在临床治疗效果不理想、使用剂量大、毒副作用大等缺点。我国的中医药在防治矽肺方面也显现出一定的优势。目前，治疗矽肺的中药种类繁多，包括黄芪、桔梗、苦参素等单味中药以及矽妇康、矽肺宁等中药复方制剂。但其对于矽肺治疗也仅仅局限于抗炎、抗氧化、改善血循环等。随着科学技术的发展，矽肺的手术治疗也日渐被人们所认识与接受，主要是大容量肺泡灌洗术，其可以清除支气管树和肺泡腔内的矽尘、尘细胞及细胞碎片和致纤维化因子等起到改善呼吸功能，缓解症状的功效。虽然目前已经研制出的药物对于改善矽肺病的症状具有一定的效果，但是由于矽肺病发病机制的复杂性以及人们对其认知的局限性，这给矽肺病的特效治疗药物的研发带来了困难。因此，研发新的有效的矽肺病治疗药物已成为当前矽肺病研究中迫切需要解决的问题。

众多学者已经证实在肺纤维化发生发展过程中涉及许多细胞因子、炎性介质和基因的参与以及相互之间的调控。微小RNA(MicroRNAs，miRNAs)是一系列长度为18～22核苷酸的非编码小RNAs，由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链RNA前体经过酶切加工后生成。它们主要是通过绑定到其靶基因的3’非翻译区(3’-UTR)，抑制其靶基因的翻译或诱导其mRNA的降解，从而调控着人类约三分之一基因的表达。此外，越来越多的研究也表明miRNAs在肺纤维化的进程中发挥重要作用，例如在特发性肺纤维化患者的成纤维细胞中miR-21表达的降低可以减轻TGF-β1的促纤维化活性；miRNA let-7d可以靶定其靶基因HMGA2和α-SMA通过抑制上皮间质转化从而阻止肺纤维化的发生发展。

目前大量研究已经明确了miRNAs与组织纤维化有密切关系，并且具有组织与时间的特异性。近年来越来越多学者运用miRNA基因芯片技术筛选出差异表达的miRNAs，这些差异表达的miRNAs可能成为纤维化疾病早期诊断的检测指标和新的生物学标志物。此外，也有许多学者通过改变miRNAs的表达水平致力于研究其对于治疗肺纤维化疾病的效果。尽管国内外多数研究尚处于起步阶段，但随着研究方法与技术的改进以及认识的逐渐深入，对于miRNAs用于治疗肺纤维化疾病存在着巨大的发展空间，也必将开创基因诊治疾病的新时代。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明提供一种miRNA在制备治疗矽肺药物中的应用。

技术方案：miRNA-503在制备治疗矽肺药物中的应用。

miRNA-503的序列为：人源：5’-UAGCAGCGGG AACAGUUCUGCAG-3’；小鼠：5’-UAGCAGCGGG AACAGUACUGCAG-3’。

治疗矽肺药物，所述药物其有效成分为miRNA-503。

治疗矽肺药物，所述药物其有效成分为促进miRNA-503表达或增强miRNA-503功能的物质。

上述促进miRNA-503表达或增强miRNA-503功能的物质为miRNA-503 agomir或miRNA-503模拟剂(mimic)。

本发明通过Affymetrix miRNA表达谱基因芯片分析在前期建立的矽尘诱导小鼠肺纤维化模型中筛选出差异表达的miRNAs，其中miRNA-503在矽尘组中的表达相比于对照组明显降低，并具有一定的时间依赖性。提示其可能与矽肺肺纤维化的发生发展有关，有望成为矽肺治疗的靶标之一。

为了证实miRNA-503在矽尘诱导的肺纤维化中的确切作用，申请人在重新建立的矽尘诱导小鼠肺纤维化模型中通过qRT-PCR的方法进一步证明了在实验性矽肺纤维化的小鼠的肺组织中miRNA-503的表达较对照组显著降低，并也具有一定的时间依赖性(7d、14d、28d)。

在此基础上，申请人通过给小鼠尾静脉注射胆固醇共轭的miRNA-503的方法特异性地上调小鼠体内miRNA-503的表达，病理切片结合纤维化指标的检测提示上调miRNA-503能够在一定程度上减轻矽尘诱导的小鼠肺纤维化。

进一步，本发明者采用化学合成的miRNA-503模拟剂(mimic)转染人支气管上皮细胞(HBE)特异性地升高miRNA-503在细胞中的表达，通过在细胞水平对纤维化指标的检测证明miRNA-503能够抑制肺上皮细胞间质转化的过程，从而抑制肺纤维化的发生发展。

在本发明中，申请者运用SPSS 20.0软件对结果进行统计分析，计量资料采用成组t检验及one-way ANOVA进行统计分析；p<0.05视为具有统计学意义。柱状图均由GraphPad 6.0作图软件完成。

在本发明的一些具体实施方式中，所述的miRNA-503为miRNA-503-5p，其人鼠序列享有相同的种子序列，因此具有较高的人鼠同源性。

在本发明中所用的miRNA-503 agomir经过胆固醇共轭修饰的产品，提高了miRNA的稳定性与亲和力。本发明中所用的miRNA-503 agomir、miRNA-503模拟剂(mimic)以及体外实验中所用到的转染试剂均购自广州锐博生物科技公司，均属于商业化产品。

有益效果：本发明提供的miRNA-503能够用于制备治疗矽肺的药物，通过促进miRNA-503的表达和活性，在一定程度上减轻矽肺纤维化。上述研究结果为矽肺肺纤维化的发生提供了新的病理生理学机制，并为矽肺病的靶向治疗提供新的靶点。

附图说明

图1为前期Affymetrix miRNA表达谱芯片结果示意图，显示miRNA-503在纤维化肺组织中差异表达的柱状图，与对照组比较不同处理天数的矽尘处理组小鼠肺组织中miRNA-503的表达降低。

图2为重新建立的矽尘诱导小鼠肺纤维化模型中小鼠肺组织病理切片的HE染色结果示意图。肺组织的病理改变包括炎性渗出、肺泡壁增厚以及典型的矽结节洋葱皮样改变。

图3为在重新建立的矽尘诱导小鼠肺纤维化模型中小鼠肺组织纤维化相关蛋白的表达及其定量分析示意图，包括上皮细胞标志物(E-cadherin)以及间充质细胞标志物(vimentin、α-SMA)。*P<0.05，与对照组比较差异有统计学意义。结合上图病理切片结果显示肺纤维化小鼠模型建立成功。

图4为在成功建立的肺纤维化小鼠模型中验证miRNA-503的表达水平示意图，与前期芯片结果的趋势一致。*P<0.05，与对照组比较差异有统计学意义。

图5为通过胆固醇共轭修饰的miRNA-503上调小鼠体内miRNA-503水平后小鼠肺组织病理切片HE染色结果示意图。

图6为通过胆固醇共轭修饰的miRNA-503上调小鼠体内miRNA-503的水平后小鼠肺组织中miRNA-503的表达水平示意图；结合上图病理切片结果共同证明上调体内miRNA-503表达的小鼠模型建立成功。*P<0.05，与对照组比较差异有统计学意义，^#P<0.05，与矽尘+miR-NC组比较差异有统计学意义。

图7为在成功建立上调miRNA-503的小鼠肺纤维化模型中纤维化相关蛋白的表达及其定量分析示意图，包括上皮细胞标志物(E-cadherin)以及间充质细胞标志物(vimentin、α-SMA)。*P<0.05，与对照组比较差异有统计学意义，^#P<0.05，与矽尘+miR-NC组比较差异有统计学意义。

图8为通过miRNA-503mimic上调支气管上皮细胞(HBE)中miRNA-503后，再用矽尘处理的细胞纤维化模型中纤维化相关蛋白的表达及其定量分析示意图，包括上皮细胞标志物(E-cadherin)以及间充质细胞标志物(Vimentin、α-SMA)的蛋白水平变化。*P<0.05，与对照组比较差异有统计学意义，^#P<0.05，与矽尘+miR-NC mimic组比较差异有统计学意义。

具体实施方式

实施例1：重建矽尘引起的小鼠肺纤维化模型

选用SPF级6-8周的雄性C57BL/6小鼠，体重在18-22g，1％戊巴比妥腹腔注射麻醉后，暴露气管，气管内滴注50μL 50g/L矽尘悬浊液或等量生理盐水。灌注后，迅速将小鼠直立，轻轻旋转3分钟，使SiO2悬浊液和生理盐水均匀地分布于小鼠的左右肺内。待动物清醒后，进行常规饲养。并于造模后第7d、14d、28d分别处死各组小鼠，肺组织于-80℃冰箱保存。取右下叶肺组织固定于4％多聚甲醛溶液中，经石蜡包埋、切片后进行HE染色。结果发现矽尘组小鼠出现明显的肺纤维化，并且从14d开始出现纤维化，在28d时伴有典型矽结节的洋葱皮样改变，而对照组并没有纤维化发生(图2)。Western blot法检测小鼠肺组织中纤维化指标发现相比于对照组，7d、14d、28d矽尘处理组中上皮标志物(E-cadherin)表达降低及间充质标志物(vimentin、α-SMA)的表达升高(图3)。病理切片HE染色结果与纤维化指标的蛋白表达情况结合综合评价矽尘诱导的小鼠肺纤维化的模型建立成功。

实验方法：

(1)HE染色

小鼠右下叶肺组织经甲醛固定、淋蜡包埋、切片等步骤后，制成空白切片后进行HE染色。切片经梯度脱蜡后苏木素染色15min，水洗玻片上多余染液；1wt.％盐酸乙醇分化两下，镜下控制直至细胞核染色清晰为止；自来水浸泡15min左右；伊红染色1min左右至镜下观察控制，待细胞质染成红色即可；常规脱水、透明、封片，显微镜下观察。苏木素为碱性染料，将细胞核染成蓝色。伊红为酸性染料，将细胞质染成红色。

(2)纤维化指标的Western blot实验

1)提取肺组织总蛋白

剪取约绿豆大小的小鼠肺组织于消毒的1mL研磨器中，加入500μL的组织蛋白提取液(T-PER Tissue Protein Extraction Reagent，thermo scientific)，置于冰上轻轻研磨至溶液呈匀浆状，冰上静置15分钟，4℃，12000转离心15分钟后取上清。

2)BCA法测定肺组织蛋白浓度

BCA试剂按A:B(质量比50:1)的比例配制BCA工作液，混合均匀。取蛋白标准品10μL稀释到100μL，使终浓度为0.5mg/mL；将蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL的体积加入到96孔板的标准品孔中，并用生理盐水补足到20μL；在样品孔中加入19μL的生理盐水，加1μL待测蛋白样品到96孔板的样品孔中；各孔加入BCA工作液200μL，混合均匀，37℃放置30分钟；将多功能酶标仪的测定波长设定为570nm，检测各孔的吸光度，利用Excel软件绘制标准蛋白浓度和吸光度的标准曲线，根据标准曲线计算出待测蛋白样品的浓度。

3)煮蛋白

按β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol，β-me)：6×SDS(体积比2:3)的比例配制上样缓冲液；按每份蛋白样品的上样量相等的原则，取所需体积的蛋白及相应体积的双蒸水混合，每份样品加入10μL的上样缓冲液，混合均匀，100℃加热5分钟，-20℃保存备用。

4)Western blot实验

制备12.5％的分离胶(下层胶)与5％的浓缩胶(上层胶)，10孔齿梳制备的泳道每孔最多可加蛋白为40μL，并须保证每孔所加蛋白量相等。电泳槽中加入配制好的电泳缓冲液，接通电源，60V恒压电泳；当样品中的溴酚蓝指示剂移动到浓缩胶下缘时，可将电压调到90V，恒压电泳；当样品中的溴酚蓝指示剂移动到分离胶下缘时，停止电泳，关闭电源。适当大小的经甲醛预浸泡的PVDF膜和3mm的滤纸浸泡于湿转液中5分钟，按照夹心法依次将滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸的顺序放好，小心赶走夹心中的所有气泡并小心夹好，浸于盛有湿转液的转膜槽中，并将转膜槽置于冰水混合物中以防转膜过程中温度过高影响转膜效果，接通电源90V恒压转移90分钟。将转移好的硝酸纤维膜浸入TBST配制的5％的脱脂牛奶中，置于摇床上，室温低速封闭至少1小时。一抗按说明书所建议比例稀释，与PVDF膜4℃共孵育过夜。次日用1×TBST溶液置于摇床上洗涤15分钟左右；二抗为羊抗兔IgG-HRP或者羊抗小鼠IgG-HRP，按1:1000(体积比)的比例稀释，室温孵育1小时。用1×TBST摇床上至少洗涤3次，每次15分钟。ECL发光剂按A液和B液1:1的体积的比例配制显色液。采用全自动图像分析系统对蛋白条带进行扫描，根据条带的灰度判定蛋白表达的变化；使用ImageJ图像分析软件对图片的灰度值进行扫描，进行相应的统计分析。

实施例2：在重建的矽尘引起小鼠肺纤维化模型中qRT-PCR实验检测miR-503水平

确定模型建立成功后，根据肺组织病理切片选取对照组和第7、14、28d矽尘处理组各5只小鼠的肺组织提取总RNA进行qRT-PCR检测。为了避免偏倚以及减小误差，各组小鼠的样本均采用随机方法选取，每个样本上样时需设置至少3平行。结果发现，在重新建立的矽尘引起的小鼠肺纤维化模型中，相比于对照组，7d、14d以及28d矽尘组的小鼠肺组织中miRNA-503的表达水平显著降低，并具有一定的时间依赖性(图4)，与前期芯片结果一致。

实验方法：

(1)提取肺组织的总RNA

①将消毒后的组织研磨器置于冰上，加入1mL的Trizol，剪取约绿豆大小小鼠肺组织于研磨器中，研磨至溶液呈匀浆状。②将肺组织匀浆转移到1.5mL的进口EP管中，加入200μL三氯甲烷，于涡旋混合器上剧烈震荡15s，使之充分混合，室温静置5分钟。③4℃、12000转离心15分钟。④吸取上清至1.5mL进口EP管中，加入500μL在-20℃事先预冷的异丙醇，上下颠倒EP管混匀，-20℃放置10分钟，以防降解。⑤4℃、12000转离心15分钟。⑥小心弃去上清，并用滤纸吸去多余液体，加入1mL在-20℃事先预冷的75％的乙醇，轻轻弹起沉淀，上下颠倒混匀。⑦4℃、7500转离心5分钟。⑧小心弃去上清，观察RNA的量，倒置于干净的滤纸上片刻，室温5000转离心3分钟，吸去多余乙醇，置于超净台抽真空至乙醇挥发。⑨加入20μL DEPC水，4℃溶解过夜。待RNA完全溶解后用NanoDrop 2000核酸蛋白分析仪测RNA浓度，用DEPC水将RNA稀释到1μg/μL，-80℃冰箱长期保存备用。

(2)使用Takara试剂盒进行qRT-PCR实验

1)miRNA逆转录反应：逆转录体系包括5×miRNA Reaction Buffer Mix(for Real Time)2μL、miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μL、has-miR-503 RT Primer(5μM)0.2μL、U6RT Primer(5μM)0.2μL、Total RNA(10pg/μL～1μg/μL)1μL及6.1μL DEPC水。反应条件为42℃15分钟；85℃5秒。反应结束后加入20μL DEPC水，立即使用或置于-20℃保存。使用仪器为BIO-RAD T100Thermal Cycler。逆转录引物由广州锐博生物科技公司设计和合成。

2)qRT-PCR扩增反应：反应体系总体积为5μL，包括SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×)2.5μL、ROX Reference Dye(50×)0.1μL、miR-503 PCR Forward Primer(5μM)0.2μL、miR-503PCR Reverse Primer(5μM)0.2μL、U6PCR Forward Primer(5μM)0.2μL、U6PCR Reverse Primer(5μM)0.2μL、DNA模版1.0μL、DEPC水1.0μL。使用ABI Prism7900荧光定量PCR仪，反应条件为：95℃，30秒→95℃，5秒；60℃，34秒(40个循环)→95℃，15秒；60℃，1分钟；95℃，15秒。扩增反应正向引物和反向引物均由广州锐博生物科技公司设计和合成。

实施例3：上调miRNA-503水平的矽尘诱导的小鼠肺纤维化动物实验

采用胆固醇共轭的miRNA-503激动剂(agomir)上调小鼠体内miRNA-503的水平。32只6～8周、体重18-22g的C57BL/6雄性小鼠按随机数字法随机分为4组(每组8只)，分别为空白对照组、矽尘处理组、干预对照组(矽尘+miR-NC)、干预组(矽尘+miR-503)。以200nmol/kg miR-503agomir或miR-NC agomir与50mg/kg的SiO2加入到50μL生理盐水中对小鼠进行气管滴注，并每周对干预组和干预对照组尾静脉继续注射120nmol/kg的miR-503agomir或miR-NC agomir溶液，于第28天处死小鼠，收集小鼠肺组织样本。取右下肺肺组织进行病理切片的HE染色，结果发现在干预对照组(矽尘+miR-NC)可见有炎症反应、肺泡结构破坏以及典型的矽结节的出现(图5)；而上调miRNA-503后，这些改变均明显减轻。病理切片纤维化评分结果显示干预组(矽尘+miR-503)的肺损伤的严重程度和分布范围均低于干预对照组(矽尘+miR-NC)(表1)。PCR法检测各组小鼠肺组织中miRNA-503水平，结果显示与干预对照组(矽尘+miR-NC)比较，干预组(矽尘+miR-503)小鼠肺组织中miRNA-503的表达水平明显升高(图6)，表明模型建立成功。采用Western blot法在建立成功的miRNA-503干预小鼠矽肺模型中检测各组小鼠肺组织与纤维化相关的蛋白表达水平，结果显示与干预对照组(矽尘+miR-NC)相比，干预组(矽尘+miR-503)小鼠肺组织中间充质标志物(vimentin、α-SMA)的表达明显降低，而上皮标志物(E-cadherin)水平也有一定程度的恢复(图7)。结合上述结论我们可以得出在小鼠体内上调miRNA-503具有一定的减轻肺纤维化的作用。

实验方法：

(1)HE染色、qRT-PCR及Western blot实验

具体实验方法同实施例1与实施例2

(2)小鼠肺组织纤维化病理评分

根据小鼠肺组织病理切片，以肺泡壁增厚、细胞增殖情况、炎性损伤情况、胶原沉积及纤维化程度作为评判纤维化程度的基础依据，对每只小鼠的病理切片都进行评分，具体评分系统参照文献进行。按文献报道，将纤维化严重程度判定等级为：无异常情况的为0分，边缘的为1分，轻微的为2分，中度的为3分，严重的为4分，非常严重的为5分；损伤分布范围判定等级为：无损伤为0分，少见或机会性出现(占肺部面积的10％)为1分，少的/有限的(占肺部面积的10％～25％)为2分，中度(占肺部面积的25％～50％)为3分，扩增性或广泛分布(占肺部面积的50％～75％)为4分，非常广泛分布(分布面积超过肺部面积的75％)为5分。

实施例4：上调人支气管上皮细胞中miRNA-503水平的实验

在转染前一天将人支气管上皮细胞(HBE细胞)正常传代于六孔板中，分组设置：①空白对照组；②SiO2处理组(200μg/mL SiO2处理细胞24h)；③miR-NC+SiO2处理组(用50nM阴性对照转染细胞之后用200μg/mL SiO2处理细胞24h)；④miR-503+SiO2处理组(用50nM miR-503mimic转染细胞之后用200μg/mL SiO2处理细胞24h)。Western blot法检测细胞纤维化相关指标显示与矽尘组比较，采用miRNA-503 mimic转染人支气管上皮细胞上调细胞中miRNA-503水平后可明显降低间充质细胞标志物vimentin和α-SMA的表达，而恢复上皮细胞标志物E-cadherin的表达，从而达到抑制纤维化的效果(图8)。

(1)细胞转染miRNA-503 mimic

待细胞长至50％左右时进行转染：①用PBS将10×riboFECT^TM CP Buffer稀释为1×应用液；②稀释mimic：用120μL1×riboFECT^TM CP Buffer稀释5μL浓度为20μM的miR-503mimic储存液，混匀，室温孵育5分钟；③制备混合液：加入12μL riboFECT^TM CP Reagent，轻轻混匀，室温孵育15分钟；④在混合液中加入1830μL的细胞培养基，轻轻吹打混匀，加入到细胞中。miR-NC的转染操作步骤同上。

(2)细胞用SiO2处理

转染24小时后，弃去培养液，用PBS洗细胞后加入用细胞培养基稀释的200μg/mL SiO2悬浊液2mL，空白对照组同时更换培养基，置于37℃恒温培养箱中培养。

(3)细胞总蛋白提取及western blot实验

弃去六孔板中的培养基，用1mL PBS洗去残留培养基及杂质。配制细胞裂解液：将10μL PMSF加入到1mL的RIPA裂解液中，使终浓度为1mM。取适量裂解液于各孔中，置于4℃摇床30分钟，使细胞充分裂解。用细胞刮刀将裂解后的细胞轻轻刮下，并转移至1.5mL的EP管中。4℃、12000转离心15分钟，小心吸取上清，用BCA法测定蛋白浓度。采用Western blot法检测人支气管上皮细胞中纤维化指标上皮细胞标志物(E-cadherin)以及间充质细胞标志物(vimentin、α-SMA)的蛋白表达情况。

表1 miRNA-503对肺组织纤维化严重程度和分布范围的影响

表1.显示上调小鼠体内miRNA-503水平后，对小鼠肺组织病理切片进行纤维化严重程度和分布范围评分。^#P<0.05，与矽尘+miR-NC组比较差异有统计学意义。综上所述，上调小鼠体内与人支气管上皮细胞中的miRNA-503的表达水平可显著抑制纤维化进程中的上皮间质转化过程，从而可在纤维化治疗中发挥重要的作用。miRNA-503的抗纤维化作用的发现为肺纤维化以及其他纤维化疾病的靶向治疗提供了新的靶点，具有良好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京医科大学

<120> 一种miRNA在制备治疗矽肺药物中的应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

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<210> 2

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