一种竹柳抗真菌活性组分的制备方法及应用与流程

本发明涉及一种竹柳抗真菌活性组分的制备方法及应用，属于天然产物有效成分的提取、分离纯化领域。

背景技术：

竹柳(Salix ssp.)又称美国竹柳，为杨柳科(Saliaceae)柳属(Salix)植物，是美国寒柳、朝鲜柳和筐柳杂交的优良品系(王子成，2008)，其在继承传统柳属植物众多的优良品性的同时表现出生长快、材质好、抗性强等优点(张健等，2009)，是常用的速生用材林树种和生物质能源树种(徐克顺，2011)。

近年来，竹柳种植面积在我国迅速扩大，据统计，其成片林已超过1300hm²(胡国涛等，2016)，竹柳的储备量丰富，但目前竹柳的产业化尚不成熟，鲜有深加工产品和高附加值产品。而同属柳树作为药用的历史悠久，明代《本草纲目》中就记载“柳为本经下品，其性苦寒、无毒，可治疗风水黄疽，疮痈肿痛，痰热淋疾，湿痹等疾症”，且其各部分都可入药，可谓“全身都是宝”。现代有关柳属植物的化学和药理活性的研究表明，其化学成分包括黄酮类、酚苷类、苯丙素类、醌类、甾体类、萜类、有机酸类等，具有抗炎、止痛、抗氧化、抗菌、抗诱变、降压、利尿等药理作用(刘墨祥等，1997；封士兰等，2001；赵红娟等，2010；毛竹君等，2013)。故作为同属的竹柳，虽然目前与其化学成分和生物活性方面相关的研究鲜有报道。但已有研究表明竹柳表现出与同属植物相似的生物活性，有巨大的潜力可开发成高附加值的药品。

CN105237594A公开了一种从竹柳皮中提取水杨苷的制备方法，该方法是：将竹柳树皮粉碎后，采用连续微波干燥法，制得竹柳树皮粉，用无离子水超声逆流提取后得提取液，提取液经纯化、浓缩、干燥后获得水杨苷。该发明中仅就竹柳中的水杨苷进行了提取，而未对竹柳中其他有效成分进行提取研究。且现有技术中也未有将柳或竹柳具有抗真菌活性的提取物的相关报道，及将该抗真菌活性组分用于真菌感染治疗的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有的竹柳化学成分、生物活性等相关研究的不足以及以竹柳为原料开发的医药产品的空白，提供一种从竹柳皮中制备抗真菌活性组分的方法，并研究了该活性组分在医药产品领域中的应用。

为了实现上述目标，本发明的第一个方面在于提供一种竹柳抗真菌活性组分的制备方法，将竹柳皮粉末，用5至20倍无水乙醇超声提取1～5次，每次30-120min，得提取液；提取液经水沉及石油醚浸提，减压硅胶柱梯度洗脱，收集体积比为1:1的石油醚-乙酸乙酯混合液洗脱段的洗脱液，即得竹柳抗真菌活性组分。

具体步骤如下：

A)提取：以竹柳皮为原料，以无水乙醇作为溶剂，超声波提取，提取方法为原料粒度10～40目，料液比1:5～1:20，超声频率9～18KHz，超声温度20～50℃，超声时间30～120min，超声次数1～5次；

B)水沉及石油醚浸提：步骤A)的提取液减压浓缩至无乙醇残留，加入与原料等量的蒸馏水，于4℃条件下保存12～24h，离心，取下层沉淀，沉淀用10～20倍量石油醚于20～40℃条件下浸提12～24h，抽滤，滤液浓缩至一定体积，得浸膏；

C)VLC(减压硅胶柱层析)分离：200～300目硅胶湿法装柱，径高比1:5，步骤B)所得浸膏石油醚溶解，湿法上样，以石油醚-乙酸乙酯体系为洗脱剂，梯度洗脱，收集体积比为1:1的石油醚-乙酸乙酯混合液洗脱段，HPLC检测；

D)干燥及保存：步骤C)洗脱液减压浓缩至一定体积，真空干燥，经消毒、杀菌后，得到以粉末形式保存的具有抗真菌活性的竹柳石油醚提取物，即竹柳抗真菌活性组分粉末。

进一步，优选的所述步骤A)竹柳皮粉末原料粒度为24目，料液比为1：10，超声频率18KHz，超声温度30℃，超声时间60min，超声次数3次。

进一步，优选的所述步骤B)水沉时间为18h；所述的石油醚的沸点为60～90℃，石油醚浸提温度为30℃，浸提时间为18h。

进一步，所述步骤C)梯度洗脱溶剂为石油醚，石油醚：乙酸乙酯＝5:5以及乙酸乙酯，每个梯度梯度洗脱至流出液为无色时，更换下一个梯度，每个梯度洗脱3个柱体积的洗脱剂。

进一步，所述步骤C)的HPLC检测的色谱条件为0-20min，30-65％甲醇水，20-70min，65-90％甲醇水，70-80min，90-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速为1ml/min，检测波长为220nm，柱温：25℃，YMC-pack ODS A色谱柱(250×4.6mm，5μm)；

进一步，优选的所述步骤D)的消毒、灭菌包括辐射灭菌、水蒸气灭菌、热空气灭菌中的一种或几种组合。

本发明研究发现上述竹柳石油醚提取物对霉菌、白色念珠菌、红色毛癣菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌等真菌有较好的抑制活性，该活性组分可以直接作为单方或复方制剂用于真菌感染所致疾病的治疗，如手足癣的治疗。

因此，本发明第二个方面，提供含有竹柳抗真菌活性组分的制剂，由上述制备方法获得的竹柳抗真菌活性组分和药学上可接受的载体或稀释剂组成。所述制剂为片剂、糖衣丸、胶囊、注射剂、溶液、乳液、油膏、乳膏、气雾剂或栓剂。所述的制剂类型优选为适用于外用的剂型，如，油膏、乳膏、气雾剂等。

本发明第三个方面，提供了竹柳抗真菌活性组分或含有竹柳抗真菌活性组分的制剂，在医药产品领域中的应用。优选的，在制备防治因真菌感染所致疾病的治疗，如手足癣的治疗。

所述药学上可接受的载体或稀释剂是指药学领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、溶剂、表面活性剂或矫味剂中的一种或几种。所述填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素或葡萄糖等；所述粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、淀粉、糊精、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解剂选自微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素或交联羧甲基纤维素钠；所述润滑剂选自硬脂酸、聚乙二醇、碳酸钙、碳酸氢纳、微粉硅胶、滑石粉或硬脂酸镁；所述助悬剂选自微粉硅胶、蜂蜡、纤维素、固态聚乙二醇；所述润湿剂选自甘油、吐温80、乙氧基氢化蓖麻油或卵磷脂；所述溶剂选自乙醇、液态聚乙二醇、异丙醇、吐温-80、甘油、丙二醇或植物油，所述植物油选自大豆油、蓖麻油、花生油、调和油等；所述表面活性剂选自十二烷基苯磺酸钠、硬脂酸、聚氧乙烯一聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯(吐温)等；所述矫味剂选自阿斯巴甜、蔗糖素、香精、柠檬酸或糖精钠。

本发明所提供的一种竹柳抗真菌活性组分的制备方法及应用，具有如下优点：

1.本发明创造性的以速生用材林树种和生物质能源树种的竹柳为研究对象，对竹柳提取方法进行探索研究，获得竹柳抗真菌活性组分。为竹柳在医药产品领域中的应用奠定基础，有助于竹柳附加值的提高。

2.本发明对竹柳抗真菌活性组分进行了药理及毒性研究，证明该组分抗真菌活性高，对常见的致病真菌(霉菌、白色念珠菌、红色毛癣菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌)均有较好的抑制效果。

3.本发明制备方法提取周期短、全程低温操作保证提取物化学稳定性，所用提取溶剂绿色无污染，可以循环使用，节约成本，适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明竹柳抗真菌活性组分制备步骤C)VLC洗脱石油醚段的HPLC图。

图2为本发明竹柳抗真菌活性组分制备步骤C)VLC洗脱石油醚-乙酸乙酯段的HPLC图。

图3为本发明竹柳抗真菌活性组分制备步骤C)VLC洗脱乙酸乙酯段的HPLC图。

具体实施方式

下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1

竹柳抗真菌活性组分的制备，包括以下步骤：

A)提取：精密称取粉碎后过24目筛的竹柳皮粉末100g，加入10倍量的无水乙醇，超声提取3次，每次60min，超声频率18KHz，超声温度为30℃，抽滤，提取液合并；

B)水沉及石油醚浸提：提取液减压浓缩至无乙醇残留，加入与原料等量的蒸馏水，于4℃条件下保存18h，离心，取下层沉淀，沉淀用15倍量沸点为60～90℃石油醚于30℃条件下浸提18h，抽滤，滤液浓缩至一定体积；

C)VLC分离：200～300目硅胶湿法装柱，径高比1:5，步骤B)所得浸膏用少量石油醚溶解(100mg/mL)，湿法上样，分别以石油醚、体积比为1:1的石油醚-乙酸乙酯混合液以及乙酸乙酯为洗脱液，梯度洗脱，每个梯度洗脱3BV，收集体积比为1:1的石油醚-乙酸乙酯混合液洗脱段，HPLC检测(色谱条件：0-20min，30-65％甲醇水，20-70min，65-90％甲醇水，70-80min，90-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速为1ml/min，检测波长为220nm，柱温：25℃，YMC-pack ODS A色谱柱(250×4.6mm，5μm))；检测结果如图1-3所示。

D)干燥及保存：洗脱液减压浓缩至一定体积，真空干燥，经辐射灭菌后，得到以粉末形式保存的具有抗真菌活性的竹柳石油醚提取物。

实施例2

竹柳抗真菌活性组分的制备，包括以下步骤：

A)提取：精密称取粉碎后过40目筛的竹柳皮粉末100g，加入5倍量的无水乙醇，超声提取3次，每次45min，超声频率18KHz，超声温度为25℃，抽滤，提取液合并；

B)水沉及石油醚浸提：提取液减压浓缩至无乙醇残留，加入与原料等量的蒸馏水，于4℃条件下保存20h，离心，取下层沉淀，沉淀用15倍量沸点为60～90℃石油醚于20℃条件下浸提24h，抽滤，滤液浓缩至一定体积；

C)VLC分离：200～300目硅胶湿法装柱，径高比1:5，步骤B)所得浸膏用少量石油醚溶解(100mg/mL)，湿法上样，分别以石油醚、体积比为1:1的石油醚-乙酸乙酯混合液以及乙酸乙酯为洗脱液，梯度洗脱，每个梯度洗脱3BV，收集体积比为1:1的石油醚-乙酸乙酯混合液洗脱段，HPLC检测(色谱条件：0-20min，30-65％甲醇水，20-70min，65-90％甲醇水，70-80min，90-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速为1ml/min，检测波长为220nm，柱温：25℃，YMC-pack ODS A色谱柱(250×4.6mm，5μm))；

D)干燥及保存：洗脱液减压浓缩至一定体积，真空干燥，经水蒸气灭菌后，得到以粉末形式保存的具有抗真菌活性的竹柳石油醚提取物。

实施例3

竹柳抗真菌活性组分的制备，包括以下步骤：

A)提取：精密称取粉碎后过10目筛的竹柳皮粉末100g，加入20倍量的无水乙醇，超声提取4次，每次90min，超声频率18KHz，超声温度为40℃，抽滤，提取液合并；

B)水沉及石油醚浸提：提取液减压浓缩至无乙醇残留，加入与原料等量的蒸馏水，于4℃条件下保存12h，离心，取下层沉淀，沉淀用15倍量沸点为60～90℃石油醚于40℃条件下浸提12h，抽滤，滤液浓缩至一定体积；

C)VLC分离：200～300目硅胶湿法装柱，径高比1:5，步骤B)所得浸膏用少量石油醚溶解(100mg/mL)，湿法上样，分别以石油醚、体积比为1:1的石油醚-乙酸乙酯混合液以及乙酸乙酯为洗脱液，梯度洗脱，每个梯度洗脱3BV，收集体积比为1:1的石油醚-乙酸乙酯混合液洗脱段，HPLC检测(色谱条件：0-20min，30-65％甲醇水，20-70min，65-90％甲醇水，70-80min，90-100％甲醇水，80-90min，100％甲醇，流速为1ml/min，检测波长为220nm，柱温：25℃，YMC-pack ODS A色谱柱(250×4.6mm，5μm))；

D)干燥及保存：洗脱液减压浓缩至一定体积，真空干燥，经热空气灭菌后，得到以粉末形式保存的具有抗真菌活性的竹柳石油醚提取物。

对比实施例1

按实施例1中的A)、B)和D)步骤制备相应粉末。

对比实施例2

实施例1中的C)步骤所得的石油醚洗脱液，经低温减压浓缩，冷冻干燥所制得的相应粉末。

对比实施例3

实施例1中的C)步骤所得的乙酸乙酯洗脱液，经低温减压浓缩，冷冻干燥所制得的相应粉末。

实验例1

竹柳抗真菌活性组分的抑制菌丝生长速率实验：

采用抑制菌丝生长速率法测定按实施例1、对比实施例1、对比实施例2和对比实施例3对霉菌(MJ)、白色念珠菌(BJ)、红色毛癣菌(HJ)、须癣毛癣菌(XJ)、犬小孢子菌(QJ)的抑制率。称取样品粉末适量，石油醚溶解制成浓度为5mg/mL的供试样品溶液，供试样品溶液用0.22μL针头式细菌滤器过滤后，量取2.4mL加入45mL培养基中混匀，用直径75mm培养皿制成三皿。选择已经培养好的生长均匀的菌落用打孔器制成直径5mm的菌饼。当含有供试样品溶液的培养基凝固后于培养皿中心接种菌饼。阴性对照组用2.4mL石油醚代替供试样品溶液，阳性对照组用1mg/mL的青霉素溶液替代供试品溶液，于37℃恒温培养箱中培养，待阴性对照组培养基长满菌丝时，用十字夹叉法测量供试样品组的菌落直径，取平均值，按下述公式计算抑制率(陈年春，1991)。每组平行三次。实验结果见表1。

表1各组对5种真菌菌丝生长率的抑制活性(n＝3)

注:*代表与空白对照组相比，P＜0.01；代表与阳性对照组相比，P＜0.01；代表与实施例1相比，P＜0.01.

由实验结果可以看出，与阴性对照相比，各组对上述5种真菌均表现一定的抑制效果，但是样品组只有实施例1和对比实施例1的抑制率与其呈现显著性差异(P＜0.01)，对5种真菌的菌丝生长抑制率均大于抑制率50％，表明实施例1和对比实施例1具有较强的抗真菌活性，同时也表明竹柳抗真菌活性制备方法中的C)步骤所述的收集体积比为1:1的石油醚和乙酸乙酯混合液的合理性；对比实施例1对5种真菌的菌丝生长抑制率较实施例1的菌丝生长抑制率低，且呈现显著性差异(P＜0.01)，表明竹柳提取物经VLC分离后，其抗真菌活性成分得到富集；实施例1对5种真菌的菌丝生长抑制率与阳性对照的菌丝生长抑制率相似，表明如发明所述的制备方法制得的竹柳石油醚提取物具有较好的抗真菌活性，可应用于由霉菌、白色念珠菌、红色毛癣菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌等真菌导致的疾病的治疗。

实验例2

竹柳抗真菌活性组分的临床应用-治疗手足癣人体试验

①竹柳抗真菌活性组分软膏的制备

将上述竹柳抗真菌活性组分粉末120g与30度醋精500mL充分混合，随后与500g凡士林充分混合30min，即得竹柳抑菌软膏。

②一般资料

病人100例，年龄18～65岁，其中手癣、灰指甲20例，足癣、灰趾甲30例，手足癣兼灰指/趾甲50例。

③主要症状

指间、趾间、足跖及其侧缘反复出现针头大小丘疱疹及疱疹，有不同程度炎性反应和瘙痒，角质层增厚，粗糙，脱屑，干燥等。

④治疗方法

本发明软膏使用方法为每天两次，涂抹软膏后封包患处不少于1h，连续使用30d。

⑤疗效判断标准

痊愈：自觉症状消失，长出新指甲/趾甲；

有效：自觉症状减轻，灰指甲/灰趾甲面积明显减少；

无效：自觉症状无改善，灰指甲/灰趾甲面积数量无变化。

本发明软膏对手足癣的治疗效果见表2。由实验结果可以看出，本发明软膏对手足癣均具有较好的治疗效果，且在治疗观察期间未出现任何不良反应或毒副反应，表明该软膏在临床上可用于由真菌引起的手足癣的治疗。

表2本发明软膏对100例手足癣患者的治疗效果