本发明涉及一种仿生骨支架及其制备方法，属于组织工程领域。
背景技术：
大段骨缺损的修复及特定形态骨的功能重建是骨科临床治疗上的一大难题，单纯采用自体骨嫁接或异体骨移植，或采用金属、陶瓷、高分子等各种人工骨替代材料在生物学和力学功能上均难以达到满意的效果。构建有生命活性的,可诱导组织再生的组织工程骨已成为当今修复骨缺损的前沿课题。生物活性诱导材料因采用仿生的理念，通过模拟细胞外基质成分和三维微结构构建利于细胞再生的良好的材料学环境，而成为组织工程领域基础而重要的因素。
目前，制备仿生骨支架多以生物仿生为主，如采用仿生矿化技术；多孔支架的表面固定生物活性分子如蛋白、多肽如RGD等；生长因子包埋诱导成骨技术；以及纳米加工技术，人工形成纳米尺度的工程骨支架等。前三种的仿生是模拟天然ECM活性诱导成分，第四种是从结构仿生的角度构建骨组织工程支架，但都是利用支架材料充当临时的人工ECM诱导骨组织形成，是活性诱导材料所关注的重点。但仿生骨的研究还有以下三点不足：
一是仿生的活性诱导成分仅限于ECM中某种活性成分，如蛋白、多肽、细胞因子等。研究显示，天然ECM中含有胶原、蛋白多糖、氨基聚糖以及多种活性蛋白和生长因子(成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、表皮生长因子等)，这些成分交织耦联，赋予ECM特殊形貌结构及一定生物活性，对成骨细胞具有得天独厚的诱导能力。
二是大部分研究只是针对薄膜表面或者很薄的3D结构表面模拟ECM改性由于缺少刚性结构因素使得此类支架的实用性不高。
三是单纯的化学环境在促进组织再生上还不完善，同时恢复缺损组织的力学环境，生理学环境对组织诱导再生具有重要作用。骨组织工程支架的研制，须符合生物力学和仿生学原理。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种仿生骨支架。
本发明的技术方案概述如下：
一种仿生骨支架，其特征在于，它是由聚己内酯(PCL)通过熔融法3D打印成不同结构的多孔支架，成骨细胞ECM作为涂层粘附于支架纤维构成的，ECM涂层由不同生理应变下周期压应力作用于成骨细胞，经脱细胞处理后得到。其特点PCL支架提供符合松质骨结构特征和力学特征，ECM涂层提供生物活性成分诱导成骨，力学刺激增强活性成分的质量和数量。
本发明仿生骨支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)选择粘均分子量4.32-5万的聚己内酯为原料，熔融法3D打印制备骨支架，纤维直径为0.1mm-0.3mm；纤维间距为0.1mm-0.7mm；横纵经纬纤维垂直交错，层与层之间间距0.1mm-0.3mm 3D打印成50×50×3mm的正方体多孔支架，用模具剪裁成直径为6mm，厚度3mm圆柱形支架，消毒后备用。
(2)配制含体积浓度为10％FBS和体积浓度为1％双抗的α-MEM培养基，将成骨细胞系以12000/cm2适当密度接种于培养瓶中，在体积浓度5％CO2，37℃细胞培养箱中进行培养；当细胞达到80％融合后，胰酶消化，以104-107/cm3密度接种于骨支架；4小时后加入培养基，细胞培养箱中进行培养。
(3)对成骨细胞-支架复合物施加表观应变为1000微应变-3000微应变的力学刺激，促使成骨细胞分泌各种活性物质，最终形成一定形貌和具有活性成分细胞外基质；以10毫摩尔/升NH4OH结合反复冻融5次进行脱细胞处理，后用磷酸盐缓冲液反复漂洗；与聚己内酯纤维结合的细胞外基质用100单位/毫升DNase处理1小时后，磷酸盐缓冲液漂洗，冻干后4℃保存。
本发明与现有技术相比所具有的优点在于：本发明采用3D打印技术制备符合天然骨结构特征的不同结构骨支架，引入力学载荷的作用，以天然的细胞外基质为支架涂层，来进行生物材料的研制，符合松质骨骨小梁结构和力学特征，可避免“应力屏蔽”效应；ECM涂层为支架提供生物诱导性，解决PCL材料表面光滑、疏水和生物诱导性弱的缺点；利用力学刺激提高生物活性成分质量和比例，增强诱导性；此外，PCL具有生物可降解性。将结构、力学性质和生物诱导活性三维立体仿生可有效发挥协同作用，使得骨支架兼具实用性和功能性，满足临床应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
3D打印技术现已应用于医疗器械植入物领域，我们采用北京先进有限公司的3D打印机订制不同规格的PCL多孔支架，以此为例仅是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
实施例1.
一种基于ECM仿生骨支架的制备方法，包括如下步骤：
(1)选择粘均分子量4.32-5万的聚己内酯(PCL)为原料，熔融法3D打印制备骨支架，纤维直径为0.3mm；纤维间距为0.3mm；横纵经纬纤维垂直交错，层与层之间间距0.3mm 3D打印成50×50×3mm的正方体多孔支架，用模具剪裁成直径为6mm，厚度3mm圆柱形支架，消毒后备用。
(2)配制含体积浓度10％FBS和体积浓度1％双抗的α-MEM培养基，将成骨细胞系以12000/cm2适当密度接种于培养瓶中，在体积浓度5％CO2，37℃细胞培养箱中进行培养。当细胞达到80％融合后，胰酶消化，以107/cm3密度接种于骨支架。4h后加入培养基，细胞培养箱中进行培养。
(3)对成骨细胞-支架复合物施加表观应变为3000με力学刺激，促使成骨细胞分泌各种活性物质，最终形成一定形貌和具有活性成分ECM；以10mM NH4OH结合反复冻融5次进行脱细胞处理，后用PBS反复漂洗。与PCL纤维结合的ECM用100units/ml DNase(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)处理1h后，PBS漂洗，冻干后4℃保存。
实施例2.
(1)选择粘均分子量4.32-5万的聚己内酯(PCL)为原料，熔融法3D打印制备骨支架，纤维直径为0.1mm；纤维间距为0.1mm；横纵经纬纤维垂直交错，层与层之间间距0.1mm 3D打印成50×50×3mm的正方体多孔支架，用模具剪裁成直径为6mm，厚度3mm圆柱形支架，消毒后备用。
(2)配制含体积浓度10％FBS和体积浓度1％双抗的α-MEM培养基，将成骨细胞系以12000/cm2适当密度接种于培养瓶中，在体积浓度5％CO2，37℃细胞培养箱中进行培养。当细胞达到80％融合后，胰酶消化，以104/cm3密度接种于骨支架。4h后加入培养基，细胞培养箱中进行培养。
(3)对成骨细胞-支架复合物施加表观应变为1000με力学刺激，促使成骨细胞分泌各种活性物质，最终形成一定形貌和具有活性成分ECM；NH4OH(10mM)结合反复冻融5次进行脱细胞处理，后用PBS反复漂洗。与PCL纤维结合的ECM用100units/ml DNase(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)处理1h后，PBS漂洗，冻干后4℃保存。
实施例3.
(1)选择粘均分子量4.32-5万的聚己内酯(PCL)为原料，熔融法3D打印制备骨支架，纤维直径为0.3mm；纤维间距为0.7mm；横纵经纬纤维垂直交错，层与层之间间距0.3mm 3D打印成50×50×3mm的正方体多孔支架，用模具剪裁成直径为6mm，厚度3mm圆柱形支架，消毒后备用。
(2)配制含体积浓度10％FBS和体积浓度1％双抗的α-MEM培养基，将成骨细胞系以12000/cm2适当密度接种于培养瓶中，在体积浓度5％CO2，37℃细胞培养箱中进行培养。当细胞达到80％融合后，胰酶消化，以105/cm3密度接种于骨支架。4h后加入培养基，细胞培养箱中进行培养。
(3)对成骨细胞-支架复合物施加表观应变为2000με力学刺激，促使成骨细胞分泌各种活性物质，最终形成一定形貌和具有活性成分ECM；以10mM NH4OH结合反复冻融5次进行脱细胞处理，后用PBS反复漂洗。与PCL纤维结合的ECM用100units/ml DNase(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)处理1h后，PBS漂洗，冻干后4℃保存。