干细胞培养上清的生发育发用途、化妆品或皮肤形成促进剂以及蛋白质的离子导入方法与流程

本申请是分案申请，其原申请的申请号为201380018559.0，申请日为2013年2月8日，发明名称为“以非人类干细胞的培养上清为原材料的化妆品或皮肤再生促进剂以及蛋白质的离子导入方法”。

本发明涉及以选自由非人牙髓干细胞、骨髓干细胞以及脂肪干细胞组成的组中的任意干细胞的培养上清作为原材料的化妆品等。

背景技术：

随着年龄增加、斑和皱纹增加是众所周知的，已知这是由于随着年龄增加、暴露于短波长紫外线(uvb)的暴露量也增加而导致的。并且，据认为，uvb会使人真皮中的皮肤成纤维细胞(hdf)所致的胶原酶的产生量增加，因而促进胶原蛋白的分解，诱导变性弹性组织的沉积，其结果皮肤表现出皱纹和黄变。

一直以来，化妆品是以各种植物来源成分为原材料进行制造并使用的，但是，最近以防止年龄增加导致的皮肤衰老(例如皱纹和细纹形成)、改善保湿性等为目的，大量销售有混配了胎盘素、角鲨烷、胶原蛋白等动物来源成分的化妆品。

另外，出于同样的目的，还在开发含有细胞的培养上清的化妆品等，提出了以下方案：培养人肺的平滑肌细胞、上皮细胞、成纤维细胞等，将其细胞破碎物或培养上清作为化妆品用组合物使用(参照日本特开2005-336188号公报、下文中称为现有技术1)。

另外，还已知将由人的骨髓或牙髓等得到的干细胞而非这种细胞的培养上清用作神经疾病治疗用医药组合物的方法(参照wo02/086108号公报、下文中称为现有技术2)。

另外，提出了将人的脱落乳牙的牙髓干细胞(stemcellsfromexfoliateddeciduousteeth；shed)的培养上清用作损伤部的治疗用组合物(参照国际公开wo2011/118795号公报、下文中称为现有技术3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2005-336188

专利文献2：国际公开wo02/086108号公报

专利文献3：国际公开wo2011/118795号公报

技术实现要素：

发明要解决的课题

现有技术1中，提出了将白血病抑制因子(lymphomainhibitionfactor:lif)、lif类似物、或者lif模拟物(下文中集体称为“lif等”)混配至化妆品用组合物中的技术。现有技术1中，若将含有lif的培养上清添加至冷冻保存的表皮细胞中，则在体外(invitro)形成品质优良的表皮细胞，从这点出发是优选的。

但是，由于无法保证体外的实验结果也会直接反映到体内(invivo)的实验中，因此存在无法证实混配于化妆品时的效果的问题。

另外，现有技术2使用了与通常的细胞相比增殖能力更高的干细胞，能够对它们所产生的生物体因子加以利用，从这点出发是优选的技术。

但是，由于使用了人来源的干细胞，因此存在下述问题：(a)随着年龄增加，能够采集的干细胞数减少；(b)由于年龄增加，基因的变异累积，因此未必可担保移植干细胞时的安全性；(c)骨髓干细胞(bmsc)的数量、增殖能力和分化能力随着年龄而降低，因此虽说是干细胞，细胞增殖能力也低；(d)利用骨髓穿刺采集干细胞对生物体的侵袭度大，伴有危险。另外，使用人的细胞时不仅难以提供充分的干细胞资源，而且在伦理方面也有很多问题。

现有技术3使用了人的牙髓干细胞的培养上清，因此与使用细胞本身时相比安全性更高，从这点出发是优选的技术。

但是，与现有技术2同样地，虽说是被称为医疗废弃物的脱落牙，但仍使用了人的细胞，因而存在伦理方面的问题，而且具有难以提供充分的干细胞资源的问题。

另一方面，具有多能性的干细胞被认为可在皮肤组织、骨组织、肌肉组织及其它各种组织中分化。而且，在老龄人口比例增高的现在，具有针对下述情况的社会性要求：通过对伴随年龄增加而出现的皮肤损伤、即斑及皱纹的产生进行预防等，将皮肤保持为健康状态。另外，无论年龄如何，还具有希望解决头发稀疏、脱发等与毛发有关的烦恼的社会性要求。

另外，具有针对减轻来自uvb的损害、或者改善效果高的化妆品等的强烈的社会性要求。

用于解决课题的方案

本发明的发明人为了解决上述课题进行了反复深入的研究，结果完成了本发明。

即，本发明的第1方式为一种化妆品，其含有非人哺乳类的选自由牙髓干细胞、骨髓干细胞和脂肪干细胞组成的组中的任意干细胞的培养上清粉末作为主要成分。此处，上述非人哺乳类的干细胞优选由选自由猪脱落乳牙的牙髓、猪骨髓以及猪脂肪组织组成的组中的任意组织得到。另外，上述培养上清粉末优选是将选自由上述猪脱落乳牙牙髓、猪骨髓干细胞以及猪脂肪细胞组成的组中的任意干细胞的培养上清进行醇浓缩后，进行冷冻干燥而得到的。

另外，上述培养上清粉末优选含有选自由血小板源性生长因子(pdgf)、血管内皮细胞生长因子(vegf)、胰岛素样生长因子(igf)、角质细胞生长因子(kgf)、肝细胞生长因子(hgf)以及转化生长因子(tgf)组成的组中的至少一种以上的生长因子。此外，上述化妆品优选为选自由液剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂、乳液剂以及硬膏剂组成的组中的任意剂形。另外，上述化妆品优选适用于包括头皮的皮肤或毛发。

本发明的第2方式为一种化妆品，其是容纳于容器中的化妆品，上述容器具备：第1隔间，其包含溶解剂；第2隔间，其包含有效成分组合物，所述有效成分组合物由选自由猪脱落乳牙牙髓干细胞培养上清粉末、猪骨髓干细胞培养上清粉末和猪脂肪干细胞培养上清粉末组成的组中的任意上清粉末和载体构成；和棒状部件，其用于贯通上述第1隔间和第2隔间的隔壁，所述化妆品的特征在于，在即将使用前，利用上述棒状部件在上述第1隔间和第2隔间的隔壁设置贯通孔，使上述有效成分组合物溶解于上述生理盐水中。上述溶解剂优选为选自由带负离子的液体、生理盐水和磷酸缓冲生理盐水组成的组中的任意液体。另外，上述化妆品优选适用于包括头皮的皮肤或毛发。

本发明的第3方式为一种蛋白质的离子导入方法，其特征在于，使片状的保湿性部件吸收上述的化妆品，并放置于希望吸收的部位，使带正电的电极与皮肤的所期望的部位接触，使带负电的棒状的电极一边在上述片上旋转一边移动。上述所期望的部位优选选自由手臂、手、手掌、腿、腘以及足底组成的组中。

本发明的第4方式为一种皮肤形成促进剂，其含有非人哺乳类的选自由牙髓干细胞培养上清粉末、骨髓干细胞培养上清粉末和脂肪干细胞培养上清粉末组成的组中的任意干细胞培养上清粉末作为有效成分。此处，上述非人哺乳类的干细胞优选由选自由猪脱落乳牙的牙髓、猪骨髓和猪脂肪组织组成的组中的组织得到。上述培养上清粉末优选是将选自由上述猪脱落乳牙牙髓干细胞的培养上清、上述骨髓干细胞的培养上清和上述脂肪干细胞的培养上清组成的组中的任意培养上清进行醇浓缩后，进行冷冻干燥而得到的。

另外，上述培养上清粉末优选含有选自由血小板源性生长因子(pdgf)、血管内皮细胞生长因子(vegf)、胰岛素样生长因子(igf)、角质细胞生长因子(kgf)、肝细胞生长因子(hgf)以及转化生长因子(tgf)组成的组中的至少一种以上的生长因子。上述的皮肤形成促进剂优选为选自由液剂、霜剂、软膏剂、凝胶剂、乳液剂以及硬膏剂组成的组中的任意剂形。

发明的效果

根据本发明，能够提供与含有人类干细胞或其培养上清的化妆品相比更安全、且具有优异的除皱、美白等效果以及生发、育发等效果的化妆品。

附图说明

图1是示意性示出猪干细胞的培养上清针对紫外线照射导致的皮肤老化(光导致的皮肤年龄增加)的皮肤再生效果的图。

图2是示出使溴脱氧尿苷(brdu)进入猪骨髓干细胞(pbmsc)、猪牙髓干细胞(pdpsc)和猪脱落乳牙牙髓干细胞(pshed)时吸收了brdu的细胞的比例的图。图2中，*表示p<0.05。

图3是示出猪生长因子(pgf)针对光导致的皮肤老化的效果的显微镜照片。图3是示出由未给与pgf的对照皮肤(图3的(a))、和由给与pgf时的皮肤(图3的(b))如后述那样形成复制品并用显微镜观察各复制品时的图像的显微镜照片。

图4是示出干细胞培养上清未给药的对照组、猪脱落乳牙牙髓干细胞培养上清给药组(pshed-cm)以及猪牙髓干细胞给药组(pshed)的皮肤的光老化状态的图。

图5是示出图4所示的各组的小鼠的皮肤状态的组织染色图像。图中，上侧的箭头表示表皮，下侧的箭头表示真皮。

图6是示出未进行uv照射的皮肤的细胞(阴性对照)、进行了uv照射的皮肤的细胞(uvs、光老化的皮肤细胞)、光老化后给与了猪生长因子的皮肤细胞(pgf)的图。图6中，**表示p<0.01。

图7是示出猪骨髓干细胞(pbmsc)和猪牙髓干细胞(pshed)的培养第3天和第7天的细胞状态的显微镜照片。

图8是示出试验开始前后的斑的状态的照片。图8的(a)表示试验开始前的斑的状态，图8的(b)表示试验结束后(6个月后)的斑的状态。

图9是示出试验开始前后的额头皱纹的状态的照片。图9的(a)表示试验开始前的额头皱纹的状态，图9的(b)表示结束后(12个月后)的额头皱纹的状态。

图10是示出由试验开始前后的皮肤与图3同样地制成的复制品的观察图像的显微镜照片。图10的(a)表示试验开始前的状态，图10的(b)表示试验结束后的状态。

图11是示出试验开始前的毛发状态的照片。

图12是示出试验开始14天后的毛发状态的照片。

图13是示出试验开始前的头皮状态的照片。

图14是示出试验开始3天后的头皮状态的照片。

图15是示出试验开始5天后的头皮状态的照片。

图16是示出试验开始7天后的头皮状态的照片。

具体实施方式

下面，更详细地说明本发明。

本发明的化妆品中使用的猪牙髓干细胞培养上清粉末可以如下得到。

首先，猪的颌优选使用刚屠杀后的食肉用猪的下颌和下颌齿。此处，优选刚屠杀后的猪是因为所得到的细胞的新鲜度好。另外，优选食肉用猪是因为牙髓的获得容易、未感染病毒或菌而安全性高、以及成本低。另外，从由下颌和下颌齿得到的干细胞的数量方面出发，优选生后3个月～12个月的猪，更优选生后5～6个月的猪。

首先，将获得的刚屠杀后的食肉用猪的下颌齿和颌骨在-40℃～-30℃进行冷蔵和搬运，例如，可以使用有制冷剂的冰箱(-30℃)等。

接着，为了对该下颌整体的表面进行杀菌，例如使用isodine等消毒药进行消毒。其后，例如使用牙科用的金刚石刻刀等从水平方向切断牙冠，接下来沿髄腔在垂直方向进行切削。通过这样切断，可以平稳地去除牙的端面(天蓋)后，例如利用牙科用手用牙垢刮器、牙科用手用锉刀等从如上处理后的牙冠和牙根部两者采集牙髓。

对于所得到的牙髓，例如利用眼科用刀(穿刀)等切碎，悬浮于含有所期望的血清和抗生物质的基本培养基中。作为此处使用的基本培养基，可以举出添加了5～20％(v/v)的牛血清、5×10³～5×10⁴u/ml的青霉素和5～50mg/ml的链霉素1％(v/v)的达尔伯克改良伊格尔培养基等。

接下来，制备含有所期望的浓度的胶原酶和分散酶的酶溶液，使用该酶溶液分离牙髓细胞。例如，悬浮于含有1～5mg/ml的胶原酶和分散酶的酶溶液中，在35～38℃的恒温槽中对细胞处理30分钟～1.5小时。

其后，进行2分钟～5分钟、优选3分钟的离心操作(例如约1,500rpm(约1,000×g))，将通过酶处理所分离的牙髓细胞回收。此时，由于会使shed或dpsc的神经干细胞组分的回收效率降低，因而不希望使用基于细胞过滤网的细胞筛选。

另外，脂肪干细胞可以如下得到。由于细胞的新鲜度高、而且容易获得，因而使用猪的肠系膜的脂肪组织。搬运条件与食肉用猪的下颌齿和颌骨的情况相同。首先，采集刚屠杀后的食肉用猪的肠系膜的脂肪组织汇集起来。接下来，去除附着在所得到的脂肪组织上的其它组织，用手术刀或剪刀等切碎细胞。

接下来，悬浮于含有所期望的血清和抗生物质的基本培养基中。此处使用的基本培养基如上所述。接着，与制备牙髓干细胞时同样地，如上述那样制备含有所期望的浓度的胶原酶和分散酶的酶溶液，利用该酶溶液得到脂肪干细胞。

接下来，使用所期望的培养基对分离后的牙髓细胞、骨髓细胞或脂肪细胞进行培养，得到培养上清。例如，将所得到的细胞再悬浮于2～8ml的上述基本培养基中，接种到适当大小的附着性细胞培养用皿中。例如，接种于直径6cm的上述皿中，添加培养液(例如含有10％fcs的dmem(达尔伯克改良伊格尔培养基))后，在5％co2存在下在调整为约35～38℃的恒温器中培养约10天～20天左右。

去除培养基后，利用pbs等将细胞清洗1次～数次。也可以代替以上操作(培养基的去除和细胞的清洗)而回收形成了菌落的粘附性细胞。该情况下，例如，用含有0.01～0.1％胰岛素和2mm的edta的溶液在37℃处理5分钟，将细胞从皿中剥离。通过回收所剥离的细胞，可以得到附着性的干细胞。

接着，对挑选出的粘附性细胞进行培养。例如，将细胞接种到与上述同样的附着性细胞培养用皿中，在同样的条件下进行培养，根据需要进行继代。例如，用肉眼观察，在达到近汇合(培养容器底面的约70％被所附着的细胞覆盖的状态)或汇合时，进行与上述同样的处理而从培养容器剥离回收细胞，再次接种到含有适当量的新鲜的同一组成的培养液的培养用容器中。继代培养可以反复进行至达到必要的细胞数为止。例如，若进行1～8次继代培养，则细胞数增加至约1×10⁷个/ml。

在进行了上述培养后，回收细胞，例如可以在液氮中保存。

在培养初期，至达到近汇合为止，根据需要、例如以每周2～3次的频率更换培养基。使用吸引器等将达到近汇合的培养烧瓶的上清除去，注入包含0.01～0.1％(v/v)的胰岛素的hepes溶液，将细胞从烧瓶底面剥离。向其中适量加入新鲜的培养基，将剥离的细胞悬浮，移至已灭菌的离心管中。接下来，以800～1,200×g(约1,500rpm)在室温下离心2～5分钟、优选3分钟。例如，制备包含0.05％胰岛素的hepes溶液，将少量该溶液加入至去除了培养基的烧瓶中，以使扩散于整个底面，细胞被剥离后，加入约5～8ml的新鲜培养基，以约1,500rpm在室温离心分离3分钟，从而可以进行浓缩。通过活细胞数求出浓缩后的每1ml细胞溶液的浓度，将约10～40ml添加至加入有新鲜培养基约10～40ml的培养烧瓶中，进行继代培养，得到猪脱落乳牙牙髓干细胞(pshed)、骨髓干细胞或脂肪干细胞。

另外，例如用牙科用金刚石刻刀等在猪的下颌骨体部的下颌前牙部的舌侧穿孔。在该孔中插入例如装有18g的注射针的注射器等，吸引骨髓。采集的骨髓如上培养至达到近汇合为止，从培养烧瓶的底面剥离，通过离心分离并继代培养，得到猪骨髓干细胞(pbmsc)。

如上得到的干细胞是作为间质来源的成体干细胞的、乳牙牙髓干细胞、骨髓干细胞或脂肪干细胞。在这些干细胞的培养上清中分泌血管内皮生长因子(vegf)、肝细胞生长因子(hgf)、胰岛素样生长因子(igf)、血小板源性生长因子(pdgf)、转化生长因子-β-(tgf-β)-1和-3、tgf-α、kgf、hbegf、sparc及其它细胞因子，因而优选使用这些干细胞。

为了得到本发明中使用的干细胞培养上清而使用的干细胞是由食用的猪得到的，细胞自身的安全性高、不需要从人的组织中采集，因此具有不存在如此采集所导致的侵袭的问题以及也不存在利用所得到的细胞时的伦理性问题的巨大优点。

另外，从胶原蛋白的再形成能力的高度的方面考虑，上述干细胞的培养上清(pshed-cm)优选包含选自由上述的vegf、hgf、igf、pdgf和tgf-β组成的组中的2种以上的组合。

需要说明的是，也可以向上述干细胞培养上清中添加1种以上公知的对应细胞因子而使用。

上述干细胞上清通过在特定条件下培养上述干细胞后通过离心分离等将细胞去除而得到。也可以对这样得到的培养上清进行例如离心、浓缩、溶剂的置换、透析、冷冻干燥、脱盐及其它各种处理，而对其进行使用。例如，若在干冰-丙酮中冷冻后使其干燥，则可以得到上述培养上清的冷冻干燥粉末。

干细胞的培养液可以使用基本培养基或在基本培养基中添加了血清等的培养基。作为基本培养基，除了上述的dmem以外，可以使用伊思柯夫改良达尔伯克培养基(imdm；gibco社制造等)、hamf12培养基(hamf12；sigma社制造、gibco社制造等)、rpmi1640培养基等。另外，也可以使用将两种以上的基本培养基合用的混合培养基。作为混合培养基的一例，可以举出将imdm和hamf12等量混合而成的培养基(例如以商品名：imdm/hamf12(gibco社制造)销售)。

另外，作为能够添加至培养基的成分，可以举出例如血清(胎牛血清、胎马血清、人血清、羊血清等)、血清代替物(knockoutserumreplacement(ksr)等)、牛血清白蛋白(bsa)、抗生物质、各种维生素、各种矿物质。

需要说明的是，为了得到不含血清的上述“干细胞的培养上清”，优选在干细胞培养的整个过程、或者最后或从最后倒数数次的继代培养时使用无血清培养基。上述干细胞的培养可以直接适用通常所用的条件来进行。

如上所述，本发明的化妆品所含有的pshed在其中包含各种生长因子。因此，通过在皮肤进行涂布等，可以使这些生长因子经皮吸收。作为能够添加至本发明的化妆品中的成分，可以举出透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白原(例如bolheal(注册商标))及其它有机系生物体吸收性材料；透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白胶及其它生物体亲和性高的凝胶化材料。另外，还可以添加制剂学上允许的其它成分(例如，载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。

从对本发明的化妆品的适合性的方面考虑，此处使用的胶原蛋白优选为可溶性(酸可溶性胶原蛋白、碱可溶性胶原蛋白、酶可溶性胶原蛋白等)的物质。

作为赋形剂，可以使用例如乳糖、淀粉、山梨糖醇、d-甘露醇、白糖等，作为崩解剂，可以使用羧甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等，作为乳化剂，可以使用阿拉伯胶、藻酸钠、黄蓍胶等。作为悬浮剂，可以使用单硬脂酸甘油、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、月桂基硫酸钠等。

作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等，作为防腐剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。除此以外，还可以含有ph调节剂等。

对本发明的化妆品的最终形态没有特别限定，例如可以制成化妆水、乳液、洗液、凝胶、霜等。

另外，上述化妆品优选适用于包括头皮的皮肤或毛发。

对上述化妆品的制造方法没有特别限定，例如在使用猪的下颌的情况下，优选如下制造。

首先，由如上得到的猪的下颌得到牙髓干细胞。代替猪的下颌而使用脂肪组织，如上得到脂肪干细胞。接下来，例如使用无血清培养基在上述条件下培养牙髓干细胞，例如使用滴管或移液管等将它们的培养上清回收。所回收的培养上清可以直接使用，或者也可以在进行了离心、浓缩、透析、冷冻干燥、稀释以及脱盐等中的一种以上处理后再使用。

需要说明的是，如后述实施例所示，所得到的干细胞的培养上清即使在未进行高度纯化的状态下也可显示出所期望的作用。这意味着能够简便且迅速地制造本发明的化妆品中使用的组合物，还具有可避免纯化中可产生的活性降低的优点。

对于如上得到的培养上清，首先测定蛋白量，其后测定胶原蛋白的纯化活性，求出比活。这是因为，通过将比活作为指标，可以恒定地保持品质。

在比活低的情况下，可以通过离心柱浓缩或乙醇沉淀进行浓缩。在进行离心柱浓缩的情况下，将能施加至该柱的最大量的培养上清移至所期望的离心柱，以3,000×g～5,000×g离心约30～90分钟。可以将与所得到的浓缩培养上清相同量的无血清的溶剂加入至该管，再次以3,000×g～5,000×g离心约30～90分钟，从而将培养上清的溶剂更换为无血清的溶剂。

例如，作为离心柱在使用amiconultracentrifugalfilterunits-10k(millipore社制造)的情况下，能够加载的最大量为15ml。因此，可以加载约15ml的培养上清，以4,000×g在4℃离心约60分钟时，浓缩至200μl。加入与浓缩至200μl的培养上清相同量的灭菌pbs，再次以4,000×g在4℃离心约60分钟，将培养上清的溶剂更换为pbs。将所得到的溶液回收至微型试管，制成浓缩干细胞培养上清。在最终得到的量达到约200μl时，浓缩度为75倍。

另外，在乙醇沉淀的情况下，例如按照以下顺序进行。首先，对于某种量的培养上清，加入9倍容积的100％乙醇并混合，在约-10～30℃放置30～90分钟。接下来，在约4℃以10,000～20,000×g离心约10～20分钟。去除上清，加入1/5容积的90％乙醇并充分搅拌。接着，在约4℃以10,000～20,000×g离心3～10分钟。去除上清，将所得到的颗粒溶解于所期望的量的灭菌水、例如500μl的灭菌水中，回收至微型试管，可以得到浓缩干细胞培养上清。

例如，在5ml的培养上清中加入45ml的100％乙醇并充分混合，在-20℃静置60分钟。接下来，在4℃以15,000×g离心15分钟，去除上清。其后，加入10ml的90％乙醇并充分搅拌。再次在4℃以15,000×g分离5分钟，去除上清。将所得到的颗粒悬浮于灭菌水500μl中，回收至微型试管，制成浓缩干细胞培养上清。该情况下，若最初使用的培养上清为5ml，则浓缩度为10倍。

另外，也可以如下将本发明的化妆品中使用的干细胞的培养上清制成冷冻干燥品。首先，将如上得到的干细胞的培养上清或浓缩干细胞培养上清分别以一定量加入至约50～150ml容量的容器中，盖上样品管的盖，在约-100℃～约-60℃冷冻2小时至半天。这些上清冷冻后，打开样品管的盖，设置于冷冻干燥机中。接下来，进行1～2天冷冻干燥，将所得到的试样作为冷冻干燥干细胞培养上清。该冷冻干燥干细胞上清可以在约-100℃～-60℃进行保存。

例如，在8个50ml容量的小瓶(带橡胶栓)中分别加入约20ml培养上清，盖上橡胶栓，在约-30℃冷冻数小时。接下来，打开该小瓶的盖，放置于冷冻干燥机(yamatosciencecorp.,制造、dc41a)中。接下来，进行冷冻干燥直至试样干燥为止，可以得到冷冻干燥培养上清。

通过以上的操作，可得到具有良好的保存稳定性的培养上清的冷冻干燥品。

将上述化妆品通过离子导入法导入皮肤的情况下，使片状的保湿性部件吸收上述化妆品，并放置于希望吸收的部位，例如脸和头皮，使带正电的电极与所期望的部位接触，使带负电的棒状的电极一边在上述片上旋转一边移动。

此处，对上述所期望的部位没有特别限定，由于能够使带正电的电极稳定地接触，因此优选从例如手臂、手、手掌、腿、腘以及足底组成的组中选择。

作为上述片状的保湿部件，可以使用由无纺布制作的市售的面膜用的片、纱布、棉花等。在上述化妆品为液状或乳液状的情况下，浸渗至上述片状的保湿部件中使用即可。另外，上述化妆品为霜或凝胶的情况下，涂布于皮肤上并在其上放置这样的保湿部件即可。

下面，以上述化妆品为化妆水的情况为例进行说明。

首先，将上述培养上清粉末溶解于适当量的生理盐水等中制成粉末溶解液，使其以从保湿部件滴落的程度浸渗。接着，将该保湿部件放置于所期望的部位、例如整个脸，使身体的一部分与带正电的电极接触。例如，用一个手握住带正电的电极。

接着，将带负电的辊放置于保湿部件上，缓慢地在保湿部件上转动。此时，不特别需要施加力。上述的粉末溶解液中含有的生长因子均带负电，因此与辊的负电荷排斥，向带正电的电极侧移动。通过该移动，生长因子被皮肤吸收。

另外，上述化妆品可以将上述溶解液保存于塑料制或玻璃制的瓶、塑料制或玻璃制的带滴管的瓶、带有细排出口的塑料制容器等各种容器中使用，在制成头皮用或毛发用的化妆品时，从附着于头皮的方面出发，优选使用带有细排出口的塑料制容器。

使上述化妆品附着于头皮和毛发，使其平均遍布至整个头皮后，与上述同样地进行离子导入。其后，利用塑料制的膜、例如聚乙烯膜等包住所有头发，进行发膜。

在上述任一情况下，若将产生蒸气的装置置于距离头部特定距离的位置，并喷雾蒸气，则导入效率变高。

下面对本发明的实施例进行说明，但并不限定于此。而且，只要不特别声明则实施例中的％为重量(质量)基准。

另外，本发明并不受上述发明的实施方式和实施例的说明的任何限定。在不脱离权利要求书的记载、本领域技术人员能够容易想到的范围内的各种变形方式也包含于本发明中。下面，使用实施例对本发明进行更详细的说明。

实施例1

猪shed/bm/脂肪组织来源的生长因子的制造和品质评价

<材料和方法>

(1)细胞的分级和培养

由食肉公社(日本国爱知县名古屋市港区)获得生后5～6个月的猪的颌骨(带有下颌齿的下颌骨)和肠系膜。刚屠杀后的食肉用猪的下颌齿、颌骨和肠系膜用装有制冷剂的冰箱(-30℃)搬运。

按照以下步骤，从上述猪的牙和下颌骨得到猪的牙髓干细胞(shed)。

将所搬运的猪的牙和下颌骨用isodine消毒，其后利用牙科用金刚石刻刀将附着于下颌骨的下颌齿的牙冠在水平方向切断，接下来，沿髄腔在垂直方向切削而去除端面。利用牙科用手用牙垢刮器由如此处理的牙冠和牙根部采集牙髓。

利用眼科用刀将所得到的牙髓切碎，悬浮于2mg/ml的胶原酶溶液中。将该悬浮液在37℃的恒温槽中放置1小时，分离细胞。为了得到继代用的细胞，将所分离的细胞在含有10％fbs和1％anti-anti(invitrogen社制造、carlsbad,ca)的达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem；sigma社制造、st.louis,mo)中在37℃、5％co2的条件下进行预培养。

首先，在培养初期，至达到近汇合为止，以每周2～3次的频率更换培养基，同时进行培养。利用包含0.05％胰岛素的hepes溶液将达到近汇合的细胞剥离，以1,500rpm于室温离心分离3分钟进行收集。将所得到的细胞移至新鲜的培养基，在与上述同样的条件下利用全部量进行继代培养。

猪骨髓(bm)由猪的下颌骨的下颌骨体部皮质骨得到。首先，利用牙科用金刚石刻刀对上述下颌前牙部舌侧穿孔，在该孔中插入装有18g的注射针的5ml注射器，吸引、采集骨髓。将所采集的骨髓移至含有10％牛血清、100u/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的dmem中，在与上述同样的条件下进行预培养，接着，在上述dmem中在37℃、5％co2的条件下培养至达到近汇合为止。上述添加量均以最终浓度表示。

与猪shed同样地使用上述0.05％胰岛素溶液进行剥离，以1,500rpm离心分离3分钟，进行继代培养。

利用解剖用剪刀和刀从猪的肠系膜切出脂肪组织并收集，去除多余的组织，在生理盐水中冲洗血液。除此以外，与上述同样地分离脂肪细胞，得到脂肪干细胞。

(2)细胞的增殖状况的分析

根据brdu染色试剂盒(invitrogen社制造、carlsbad,ca)所附的操作说明书，使溴脱氧尿苷(brdu)进入如上得到的shed或bm中，评价各细胞的12小时的增殖速度。对于各组的1个试样，准备3个玻片(スライド)，使用它们进行评价。将该实验反复5次。在单向方差分析后，通过tukey-kramer检验(tukey-kramertest)进行差异显著性检验。

为了进行stro-1的免疫荧光染色，用3％多聚甲醛固定猪shed或猪bm。其后，用磷酸缓冲生理盐水(pbs)漂洗2次，用100mm的甘氨酸溶液处理20分钟。接下来，用0.2％的triton-x(sigma-aldrich社制造、st.louis,mo)溶液将这些细胞于室温进行30分钟透过处理。其后，加入含有5％的驴血清和0.5％的牛血清白蛋白的pbs，在该溶液中于37℃培养20分钟。

接着，将一抗的小鼠抗人stro-1抗体(均为r&d社制造、minneapolis,mn)和细胞以1:100的比例混合，在pbs中于室温培养1小时。接下来，通过吸引去除pbs，将二抗的山羊抗小鼠免疫球蛋白m-fitc抗体(southernbiotech社制造、birmingham,al)和这些细胞以1:500的方式混合，在37℃培养30分钟。其后，使用vectorshield和dapi(vectorlaboratoriesinc社制造、burlingame,ca)进行装配。

(3)动物实验(参照图1)

5周龄的雌性无毛小鼠(hos；hr-1)由slc社(slcinc.社制造、日本国、静冈)提供。将全部小鼠在调节了温度和湿度的条件(22±1℃、湿度50％)下放置于12小时明暗循环中。使这些动物自由摄取水和固态饲料，各动物能够在放射线的暴露下的笼子中自由移动。每天进行观察。使用uvb放射装置rmx-3w(handokbiotech社制造、seoul,korea)，将从灯至动物背后的距离设为89cm，以1周5次的方式对小鼠的背后照射10周。该照射中，用10个se灯(株式会社东芝制造)构成列，以无uvb用的滤波器处理的方式进行。所照射的放射线的波长峰位于312nm附近。另外，关于辐照量，具有290～320nm波长的放射线的辐照量为与uvb总量的55％相当的量。

关于辐照剂量，最初的2周为1med(最小红斑量；60mj/cm²)、第3周为2med(120mj/cm²)、第4周为3med(180mj/cm²)、第5～8周为4med(240mj/cm²)。总uvb剂量为约115med(6.9j/cm²)，诱导皱纹形成。

皱纹诱导后5周，在小鼠背后的限定性的区域皮下注射pshed-cm(100％)。作为阳性对照，将悬浮于pbs的猪shed(4×10⁵)直接注射至真皮，作为阴性对照，仅将pbs直接注射至皮下。

(4)猪sh-cm的制备

将猪shed(4×10⁵细胞)在dmem/f12(invitrogen-gibco-brl社制造、grandisland,ny)无血清培养基中、在37℃、5％co2的条件下进行培养。培养72小时后，回收猪shed的培养上清，以300×g于室温离心5分钟，使用孔径为0.22μm的注射器用过滤器(millipore社制造)进行过滤。

(5)皮肤复制品和图像解析

在皱纹诱导时和进行了上述注射1周后，使用硅酮系印模材料flextime1(flextime1；heraeuskulzer社制造、newyork,ny)取得背后的皮肤表面的复制阴模。为了从相同的皮肤区域得到皱纹的复制品，用油性记号笔在皮肤上做标记。

从最后对皮肤注射猪sh-cm和猪shed起5周后，从做了标记的区域取得印模。为了易于测定，将全部复制品切成1cm见方，利用相同的印模材料，将各复制品的背面加工成平坦的面。以208°的角度照射光，使用ccd照相机从复制品捕获图像。

利用皱纹解析装置skinvisiometersv600(courage&khazaka社制造、cologne,germany)观察复制阴模的图像。皮肤皱纹的评价中使用的参数为单位面积的皱纹数、深度以及皱纹的面积。

(6)组织学解析

用含有10％(v/v)的福尔马林的中性缓冲溶液固定背后的皮肤(1cm×1cm)。接下来，包埋于聚酯蜡中，制作出6mm的切片。将切片暴露于苏木素&伊红(h&e)中，进行马森三色染色。

首先，进行苏木素&伊红染色(下文中简称为“h&e染色”)。用二甲苯(resomoll)进行3槽脱石蜡处理。用纯乙醇进行4槽脱水，用流水清洗3分钟。接下来，在mayer氏苏木素溶液中浸渍5分钟，将核染色，用约45℃的流水水洗3分钟。

接着，在伊红溶液中浸渍5分钟，其后用纯乙醇进行4槽组织的脱水，用二甲苯进行4次处理，轻柔装配，进行透徹、封入处理。

接着，进行马森三色染色。与苏木素&伊红染色同样地进行切片的脱石蜡并进行水洗。使用10％三氯乙酸(和光纯药工业株式会社制造、特级)水溶液与10％重铬酸钾(和光纯药工业株式会社制造、特级)水溶液的等量混合液，进行第1媒染。接着，水洗3分钟，用蒸馏水清洗1分钟。

将包含1.0g苏木素(merck社制造)的100ml95％乙醇(a液)、与包含2g氯化铁(iii)、1ml盐酸和95ml蒸馏水的b液(均为和光纯药工业株式会社制造、特级)在使用时混合，制成魏格特氏铁苏木素，在其中浸渍10分钟。接下来，水洗10分钟。

将2.5％磷钨酸(和光纯药工业株式会社制造、特级)水溶液和2.5％磷钼酸(和光纯药工业株式会社制造、特级)水溶液等量混合，在该溶液中浸渍1分钟，进行第2媒染。接下来，在0.75％orangeg(和光纯药工业株式会社制造、1级)溶液中浸渍2分钟。用1％乙酸水进行2槽处理。

接下来，将2倍容积的ponceaudexylidine(chroma社制造)以1％的比例溶解于1％乙酸水溶液中而得到的溶液与1容积的酸性品红(和光纯药工业株式会社制造、化学用)以1％的比例溶解于1％乙酸水溶液中而得到溶液混合，制备ponceaudexylidine·酸性品红溶液，在该溶液中浸渍20分钟。用1％乙酸水溶液进行2槽处理。

接着，在2.5％磷钨酸溶液中浸渍7分钟，用1％乙酸水溶液进行2槽处理。接下来，用苯胺蓝染色，用1％％乙酸水溶液进行2槽处理，一片一片地浸渍于异丙醇中，与苏木素&伊红染色同样地进行透徹、封入处理。

(7)人真皮中的皮肤成纤维细胞(hdf)的培养和uvb辐照剂量

在添加有10％的胎牛血清、100u/ml的青霉素以及100mg/ml的链霉素的dmem中，在5％co2、37℃的条件下培养hdf。在无血清培养基中培养24小时后，用pbs清洗培养烧瓶中的细胞，以到达50～250mj/cm²的范围的方式与3～4滴pbs一起暴露于uvb下。uvb照射使用上述uv光源(waldmann社制造、schwenningen,germany)进行。照射后立即吸引去除pbs，替换为完全培养基。uvb辐照剂量最终固定为70mj/cm²并用于之后的实验。

(8)细胞增殖分析

在96孔板的各孔中以5×10³细胞/孔接种hdf，使用cck-8试剂盒(dojindo社制造、gaithersburg,md)测定hdf的增殖速度。用无血清培养基培养24小时后，与猪sh-cm一起(或在不存在猪sh-cm的条件下)将hdf连续培养24小时，接下来暴露于uvb(70mj/cm²)90秒。

接着，将uvb照射细胞在完全培养基中培养24小时并回收。将hdf-f加入到10ml的cck-8溶液中，培养3小时。利用酶标仪(tecan社制造、gro¨dig,austria)测定了450nm的吸收。

基于使用对照组所制成的标准曲线，由各孔的od值求出细胞数。

(9)蛋白质印迹解析

将hdf(2×10⁴细胞/孔)接种至24孔板，如上进行前处理。接下来，在ripa缓冲液(包含0.15m的nacl、1mm的edta、1％的tritonx-100、1％的sds、50mm的naf、1mm的na3vo4、5mm的二硫苏糖醇、1mg/ml的亮抑酶肽以及20mg/ml的pmsf的50mmtris-hcl(ph7.4))中使细胞溶解。使用缩二脲试剂测定该细胞溶解液的蛋白量，将50μg的蛋白质供8％sds-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳。sds-page结束后，将凝胶电泳的泳动图案转印至pvdf膜。

将该膜与针对i型胶原蛋白的抗体(santacruz社制造、saintlouis,mo)、针对基质金属蛋白酶1(mmp-1)的抗体(calbiochem社制造、darmstadt,germany)一起在室温培养15分钟。接下来，利用pbs清洗该pvdf膜，与辣根过氧物酶-结合抗山羊igg抗体(1:100,000、santacruz社制造、saintlouis,mo)一起在室温培养15分钟。其后，利用免疫球蛋白蛋白质印迹试剂进行印迹，重叠x射线膜进行感光。

<结果>

(1)pshed和pbmsc的特征解析

pshed和pdpsc示出了与pbmsc同样的成纤维细胞的形态。由免疫荧光的解析表明，pshed和pbmsc包含stro-1阳性细胞。另外表明，pshed的增殖速度比pbmsc显著快(参照图2)。

(2)猪shed-cm对由uv诱导的皱纹的减轻

在uv暴露期间，观察小鼠皮肤的细小皱纹。在处置中观察到，pshed-cm处置组和pshed注射组与仅注射了pbs的pbs给药组相比皱纹更少(参照图3的(a)和(b)、各组的n＝8)。

图3的(a)和图3(b)中示出了通过pshed-cm的反复给药而得以减轻的结果(图中，pshed-cm的反复给药组表示为“pgf”)。pshed注射组也示出了与pshed-cm组同样的倾向。

如图4所示，利用皮肤检测仪(skinvisiometer)sv600测定了复制品的皱纹的参数，结果在注射天然水平的pshed-cm(100％)时，皱纹的全部参数显著降低。另外，pshed处置显示出比pshed-cm处置更高的有效性。

(3)组织学观察

uvb照射无毛小鼠中，在皮肤的附属器观察到大量变化，因此研究了pshed-cm对于uvb照射无毛小鼠中的真皮厚度的影响。

图5中示出利用苏木素-伊红染色(h&e染色)进行的无毛小鼠皮肤的真皮厚度的组织染色结果。如图5的(a)～(c)所示，胶原纤维的量(图中被上下箭头所夹持的部分)在pshed-cm处理组(图5的(b))和pshed注入组(图5的(c))中相对于对照组显著增多。

另外，由真皮厚度的测定表明，在pshed注射组和pshed-cm处置组中真皮厚度显著增加(图5的(b)和(c))。另外，在上述两组中观察到胶原纤维束的显著增加，但在对照组中未观察到(图5的(a))。

(4)由pshed-cm引起的hdf的增殖促进

为了调查与猪shed所引起的皮肤皱纹的改善有关的旁泌性机制，与pshed-cm一起，使用在与上述同样的条件下进行了一次培养的hdf进行了细胞增殖分析。如图6所示，通过uvb照射，hdf的增殖显著降低(图6中表示为“uvs”)，但若利用猪shed-cm进行前处理则增殖的降低幅度减少(图6中表示为“pgf”)，表明pshed-cm对于hdf具有保护效果。

由于上述pshed-cm包含多种生长因子，因而暗示上述猪shed-cm所引起的增殖促进是由pshed分泌的生长因子介导的。

由于上述猪shed-cm包含多种生长因子，因而暗示上述猪shed-cm所引起的增殖促进是由猪shed分泌的生长因子介导的。

(5)i型胶原蛋白和mmp1的表达

在上述猪shed-cm处置后的无毛小鼠中，真皮中的胶原蛋白含量显著增加。因此，研究了上述pshed-cm处理后的hdf中的i型胶原蛋白和mmp1的蛋白质表达。通过uvb照射，i型胶原蛋白的表达量明显降低，mmp1的表达被诱导而增加。

另外，i型胶原蛋白的表达量在pshed-cm前处理后显著增加，相反地，mmp1的表达量在pshed-cm前处理后降低。由上述情况表明，在进行了pshed-cm处理的无毛小鼠的真皮发现的胶原蛋白含量的增加是通过在真皮成纤维细胞中胶原蛋白合成被刺激以及胶原蛋白分解被抑制而产生的。

实施例2

猪shed/bm/脂肪干细胞来源的生长因子混合物的制造和品质评价

(1)生长因子混合物(粉末)的制备

将上述猪shed、猪bm或猪牙髓干细胞用于猪生长因子(pgf)混合物的制备。使用包含10％fcs的dmem，将猪shed、猪bm或猪牙髓干细胞继代培养2～8代，在培养皿中的细胞达到80％汇合的阶段采集10ml的上清(培养基：cm)，加入9倍容积的乙醇而制成乙醇稀释cm。将该乙醇稀释cm在-20℃培养60分钟后，加入到50ml容量的离心柱中，在4℃以15,000rpm离心15分钟，得到沉淀物。将该沉淀物用90％乙醇在-20℃进行清洗，再次加入离心柱并同样进行离心处理。

将如上浓缩的沉淀物冷冻干燥，得到包含生长因子的粉末。

(2)粉末中的生长因子

利用上述蛋白质印迹法对粉末中含有的各生长因子进行解析。检测出的生长因子为pdgf、vegf、igf、kgf、hgf以及tgf。

(3)品质评价

将细胞培养时加入了猪培养干细胞或猪骨髓干细胞的培养上清的结果示于图7的(a)～(d)。观察到增殖速度均比不加入这些物质时更快。

实施例3

非人来源牙髓干细胞的培养上清对于皮肤的效果

(1)非人来源牙髓干细胞的培养上清的制备

从实施例2中得到的非人来源(猪)的牙髓干细胞的培养上清液中采集1ml，冷冻干燥而得到粉末。

将该冷冻干燥粉末溶解于30ml的生理盐水中并装入洗瓶中，作为皮肤用试样1，研究了对于皮肤的效果。

(2)对于皮肤的试验的条件等

按照下述步骤进行对于皮肤的试验。首先，确认被测者的皮肤状态，咨询被测者自身现在认知为何种状态。接着，用照相机拍摄试验开始前的整个脸的状态(参照图8的(a))，用显微镜(200倍)拍摄皮肤的状态(参照图10的(a))。

接下来，使试样1的全部量渗入面膜用无纺布1(富士纸化学株式会社制造、facemask)。将该无纺布放置于被测者的脸上，以实施时间20分钟/次(手臂、手、手掌、腿、腘以及足底)、实施次数1～2次/周、0.2～1ma的条件进行离子导入。

在离子导入中，将蒸汽机(takarabelmont株式会社制造、noage)放置于距离脸30～50cm的位置，使蒸汽接触整个脸。其后，将面膜从脸上取下，用霜整理肌肤而结束。被测者为7名女性，年龄为20岁～79岁，平均为41岁。

(3)效果

将进行了14次离子导入的结果作为试验后，与试验开始前同样地用显微镜确认了皮肤的状态。对试验前后的皮肤状态进行了比较，结果被测者的肤色与试验开始前相比整体变白。另外，斑变浅(图8的(a)和(b))，同时皱纹(图9的(a)和(b))也变浅。

用显微镜观察皮肤的状态时，可确认到明显的变化，皱纹部分的凹下减少(图10的(a)和(b))。

通过使用包含猪牙髓干细胞的培养上清的化妆品，显示出具有使皱纹变浅的效果和使肤色变白的效果。

实施例4

生发和育发效果的研究

(1)非人来源脂肪干细胞的培养上清的制备

从实施例2中得到的非人来源(猪)的脂肪干细胞的培养上清液中采集1ml，冷冻干燥而得到粉末。

将该冷冻干燥粉末溶解于30ml的生理盐水中，作为生发、育发试验用的试样2，并装入洗瓶。

(2)生发、育发试验的条件等

生发、育发用试验按照以下步骤进行。首先，确认被测者的头发和头皮的状态，咨询被测者自身现在认知为何种状态。接着，用照相机拍摄试验开始前的头发的状态，另外用显微镜(20～200倍)拍摄头皮的状态。图13～16是以200倍拍摄的图。

接下来，在手掌取适量的清洁凝胶(nationaltotalproduct株式会社制造、pleasurecleansinggel)，将其涂布至头皮并进行头皮的按摩，使毛孔周围和毛孔中堵塞的污垢浮起。接着，使用市售的洗发水(株式会社cosmenist制造、pleasurecshampoo)洗掉浮起的污垢。污垢严重时，洗发2次。

其后，按照洗瓶的口接触头皮的方式，使如上制备的试样2附着于头皮。另外，也附着于毛发。

实施时间设为15分钟/次(手臂、手、手掌、腿、腘以及足底)、实施次数设为每周1～2次、以0.2～1ma进行离子导入。接着，用聚乙烯膜包裹全部头皮和毛发，从其上方如头巾那样卷上毛巾，进行10～20分钟发膜。其后，拿掉毛巾和聚乙烯膜，用毛巾干燥或用吹风机进行后处理。8名被测者中，男性为6名、女性为2名(年龄：30岁～59岁、平均为38岁)。

如上进行离子导入后，被测者自身在洗发后的干净头皮(裸肤)上应用了试样1或2。将容器的口的部分按压到裸肤上，使其直接附着，其后用手揉搓进裸肤，进行2～3分钟头皮按摩。另外，也附着于毛发上。

(3)生发和育发效果

图11～16中示出男性被测者的毛发在试验前后如何变化。

图11示出试验开始时的头发状态。另外，图12示出试验开始7天后的头发状态。由图11和12的对比可以确认，即使在目视时头发也是增加的。

将试验开始后的头皮变化示于图13(试验开始前)、图14(试验开始3天后)、图15(5天后)以及图16(7天后)。该观察的结果为，在试验开始3天后可确认到生发(参照图14的箭头)，在7天后确认到从一个毛孔生长出多根毛发(参照图16的箭头)。

在8名被测者中全部观察到生发和育发效果。具体来说，新生长的毛发在有白发的被测者的情况下也为黑色毛发，而不是白发。另外，对于所有被测者而言，毛发生长均快，毛发本身也粗，因而头顶部的毛发体积变多。

被测者中，在最早的时期用指尖感知到生发的是在试验开始的次日(1天后)。

由上述情况可以确认，通过使用包含猪脂肪干细胞的培养上清的化妆品，可显著表现出生发和育发效果。

实施例5

含有pshed/pbmsc来源的生长因子的化妆品的制造例如下所示。

[表1]

3gf润肤水(试制no.11k-614)

[表2]

(试制no.11k-641)

[表3]

3gf霜(试制no.11k-642)

[表4]

3gf美容液(试制no.11k-643)

[表5]

3gf去角质凝胶(试制no.11k-644)

工业实用性

本发明在化妆品领域中有用。