一种用于治疗眼部疾病的药物及其组合物的制作方法

本发明涉及生物化学和蛋白质工程
技术领域：
，具体地说，涉及一种能治疗干眼综合征的药物及其组合物。
背景技术：
：干眼症是指任何原因造成的泪液质或量异常或动力学异常，导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和(或)眼表组织病变特征的多种疾病的总称。又称角结膜干燥症。常见症状包括眼部干涩、容易疲倦、眼痒、有异物感、灼热痛感、分泌物黏稠、怕风、畏光及对外界刺激敏感;有时因基本泪液不足，眼部过度干涩，反而刺激反射性泪液分泌，而造成经常流泪;较严重者眼睛会出现红肿、充血及角质化，角膜上皮剥脱而有丝状物粘附，这种损伤日久则可造成角结膜病变，并会影响视力。国际干眼工作组于2007年将干眼症定义为:多种因素所致的一种泪液和眼表疾病，包括眼表不适症状，视力变化和泪膜不稳定并且伴有潜在的眼表损害，伴随泪液渗透压升高和眼表炎症反应。干眼症临床表现为干涩、眼红、易疲劳、烧灼感、异物感、畏光、视疲劳及疼痛，严重者可引起视力下降甚至失明。干眼症的发病机制主要有炎症、细胞凋亡、性激素水平失调等，其中炎症是导致干眼症发病的重要因素。干眼症治疗的终极目标是保护患者的视功能，抑制眼表的炎性反应，恢复眼表面的正常结构及功能。目前的干眼症治疗方法有药物治疗和手术治疗，主要以药物治疗为主。常用药物有人工泪液或自体血清、抗炎药物等，以滴眼液为主，如重组牛碱性成纤维细胞生长因子滴眼液，玻璃酸钠滴眼液等。虽然临床上使用药物很多，但都不能达到满意的治疗效果。胸腺素β4（以下简称Tβ4）是人体内天然存在的一种小肽类物质，Tβ4在人脾脏、胸腺、肺和腹膜巨噬细胞中的含量最高，其次是脑、肝、肾脏、睾丸和心脏。天然的Tβ4含有43个氨基酸，分子量约5kD，等电点为5.1。近年来胸腺素beta4（Tβ4）为药物研究的热点。深入研究已经证明：Tβ4是一种多功能分子，在促进创伤和角膜损伤愈合、心肌修复、促进组织再生、血管生成、抗细胞凋亡和抗炎症等方面起到重要作用。CN100360174C中公开了胸腺素β4（Tβ4）在促进眼睛退化逆转或抑制眼睛退化的药物中的应用。SosneG等人报道了胸腺素β4在小鼠干眼症模型能降低干眼症状（ExpertOpiniononBiologicalTherapy,15:sup1,155-161），动物试验剂量为0.1%。已有报道的胸腺素β4是采用化学合成方法合成的，其结构与天然Tβ4一致，均含有43个氨基酸。其缺点在于化学合成纯度低，含有结构类似的有机杂质及无机杂质，会产生毒副作用。同时，化学合成的胸腺素β4临床上使用剂量大，临床效果一般。同时，化学合成的多肽产量低，工业化生产难度大，不能满足临床使用。本发明人采用基因工程的方法对天然胸腺素β4的N-末端加以定点修饰，易于规模化制备，成本较低，对环境不造成污染，足以满足临床需求。同时，我们出乎意料地发现，获得的重组人胸腺素β4在治疗干眼症方面活性明显高于天然胸腺素β4。技术实现要素：本发明中的重组人胸腺素β4是通过基因工程技术生产的多肽类蛋白质药物，其结构与天然结构不同，含有44个氨基酸，其N-端序列和天然氨基酸N-端不同，将天然胸腺素β4的N-末端的乙酰化去除，并添加一个Gly或Ala，得到的天然胸腺素β4的突变体，增加了体内生物活性。本发明所述的重组人胸腺素β4为序列1和序列2，即Gly-rhTβ4和Ala-rhTβ4。CN100582121C中公开了该衍生物及其氨基酸序列。本发明的一个目的在于，一种含有重组人胸腺素β4的药物组合物在制备眼科疾病的药物中的应用，优选地，是干眼症方面的应用，其特征在于所述的重组人胸腺素β4的浓度为1μg/mL-1000μg/mL。在一些实施方案中，所述的重组人胸腺素β4的浓度为1μg/mL-500μg/mL。在一些实施方案中，所述的重组人胸腺素β4的浓度为10μg/mL-100μg/mL。本发明的另一个目的在于，所述的药物组合物含有药学上可接受的载体。所述的药物载体包括pH调节剂、渗透压调节剂、促进吸收剂、无菌注射用水的一种或几种。本发明中所述的pH调节剂包括盐酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠的一种或几种。本发明所述的渗透压调节剂为用于调节渗透压的试剂，包括但不限于氯化钠、葡萄糖、山梨醇、甘油、PEG、丙二醇、甘露醇、硼酸、硼砂、硫酸钠的一种或几种。本发明所述的促进吸收剂包括但不限于亚砜类，吡咯烷酮类、脂肪酸及其酯、表面活性剂、丙二醇、甘油等的一种或几种，优选地为丙二醇，甘油，氮卓，环糊精，卵磷脂、豆磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺的一种或几种。本发明的另一个目的在于，所述的药物用于局部给药。本发明的另一个目的在于，所述的药物组合物的形式可以为滴眼液、凝胶、溶液、乳膏、软膏、洗剂、冻干粉，优选为滴眼液、凝胶。附图说明图1：rh-Tβ4对大鼠干眼症模型治疗后的眼前节照相结果图2：rh-Tβ4对大鼠干眼症模型治疗后的角膜HE和PAS染色结果以下实施例用来说明本发明，但不用来限制本发明。实施例实施例一通过RT-PCR测定rhTβ4对MUC5AC、MUC1mRNA基因表达的影响药物来源：本实验中的天然β4是通过化学合成获得，重组人胸腺素β4由北京诺思兰德生物技术股份有限公司提供，分别为Gly-rhTβ4和Ala-rhTβ4，每种样品各两个规格（50,100μg/mL）。从眼库取捐献眼球分离结膜细胞，并进行结膜杯状细胞体外培养及纯化，培养过程中加入不同的胸腺素β4（Gly-rhTβ450μg/mL,Gly-rhTβ4100μg/mL，Ala-rhTβ450μg/mL,Ala-rhTβ4100μg/mL）,天然Tβ4即化学合成Tβ4（0.1%即1mg/mL，作为阳性对照），阴性对照组(negativecontrol)给予PBS。通过RT-PCR和Westernblot测定了胸腺素β4对黏蛋白表达相关基因MUC5AC、MUC1mRNA的影响。体外实验结果表明：rh-Tß4能促进人杯状细胞的增殖，促进MUC5AC和MUC1mRNA的表达，并促进MUC1黏蛋白的表达。四组试验组与阳性对照组相比，MUC5AC的表达均有显著性差异，P<0.05，MUC1的表达也明显高于阳性对照组。Gly-rhTβ4组和Ala-rhTβ4组MUC5AC、MUC1基因表达结果相似。检测结果见表1。表1RT-PCR测定MUC5AC、MUC1基因的表达分组剂量MUC5AC（2^ΔΔCT）MUC1（2^ΔΔCT）NegativeControl--1±01±0阳性对照组Tβ41mg/mL0.62±0.301.32±0.27Gly-rhTβ450ug/mL1.61±0.77*1.52±0.31Gly-rhTβ4100ug/mL1.65±0.421.57±0.43Ala-rhTβ450ug/mL1.60±0.40*1.54±0.26Ala-rhTβ4100ug/mL1.69±0.25*1.63±0.24注：与阳性对照组相比,*P<0.05。实施例二rh-Tβ4对大鼠干眼症模型角膜荧光素钠评分结果用0.3%苯扎氯铵制备的大鼠干眼症模型，干眼症动物随机分为6组，每组6只，分别给予rh-Tβ4（Gly-rhTβ450μg/mL,Gly-rhTβ4100μg/mL，Ala-rhTβ450μg/mL,Ala-rhTβ4100μg/mL）、天然Tβ4(0.1%即1mg/mL，阳性对照组）和PBS（阴性对照组），每日滴加3次，连续给药7天。观察rh-Tβ4对角膜荧光素钠评分。结果显示，rh-Tß4及阳性对照组同阴性对照组比较，评分有下降趋势，且Gly-rhTβ4100µg/mL剂量组和Ala-rhTβ4100µg/mL剂量组同阴性对照组比较差异显著（p<0.05）。Ala-rhTβ4100µg/mL剂量组、Gly-rhTβ450µg/mL剂量组和Gly-rhTβ4100µg/mL剂量组同阳性对照组比较，结果有显著差异。结果见表2。表2角膜荧光素钠评分注：与阴性对照组相比,*P<0.05。实施例三rh-Tβ4对大鼠干眼症模型治疗后裂隙灯眼前节照相、荧光素钠染色评分结果用0.3%苯扎氯铵制备的大鼠干眼症模型，干眼症动物随机分为6组，每组6只，分别给予不同的rh-Tβ4（Gly-rhTβ450μg/mL,Gly-rhTβ4100μg/mL，Ala-rhTβ450μg/mL,Ala-rhTβ4100μg/mL）、天然Tβ4(0.1%即1mg/mL，阳性对照组）和PBS（阴性对照组），每日滴加3次，连续给药7天。结果见图1。荧光素钠染色检查结果可见，Gly-rhTβ4100µg/mL剂量组和Ala-rhTβ4100µg/mL剂量组角膜修复作用最明显，与阳性对照药有显著差异，Gly-rhTβ450µg/mL剂量组与阳性对照组基本一致，而Ala-rhTβ450µg/mL和阴性对照组无明显差异。实施例四病理检查结果rh-Tβ4对大鼠干眼症模型治疗后的角膜HE和PAS染色结果即病理学检查结果见图2。正常组：HE染色的角膜和结膜上皮可见正常组织结构，PAS染色中杯状细胞可见；模型组：角膜和结膜上皮脱落；阴性对照组：上皮组织有一定程度的修复，可见少量杯状细胞；阳性对照组：上皮组织修复较好，可见杯状细胞；Ala-rhTβ450ug/mL组：上皮组织有一定程度的修复，但不明显；Ala-rhTβ4100ug/mL组：上皮细胞修复较完善，杯状细胞分布均匀；Gly-rhTβ450µg/mL组：上皮组织修复较好，可见杯状细胞；Gly-rhTβ4100µg/mL组：上皮细胞修复较完善，杯状细胞分布均匀；结论：Gly-rhTβ4100ug/mL组和Ala-rhTβ4100µg/mL组上皮组织修复较好，基本接近正常，且优于阳性对照组。<110>北京诺思兰德生物技术股份有限公司<120>一种用于治疗眼部疾病的药物及其组合物<160>2<210>1<211>44<212>PRT<213>人工序列<400>1GlySerAspLysProAspMetAlaGluIleGluLysPheAspLys151015SerLysLeuLysLysThrGluThrGlnGluLysAsnProLeuPro202530SerLysGluThrIleGluGlnGluLysGlnAlaGlyGluSer3540<210>2<211>44<212>PRT<213>人工序列<400>2AlaSerAspLysProAspMetAlaGluIleGluLysPheAspLys151015SerLysLeuLysLysThrGluThrGlnGluLysAsnProLeuPro202530SerLysGluThrIleGluGlnGluLysGlnAlaGlyGluSer3540当前第1页1 2 3