用于治疗化疗抗性癌症起始细胞的方法与流程

本申请要求于2015年7月29日提交的美国临时专利申请序列号62/198,670的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。

背景技术：

本公开提供了通过选择性抑制p-s⁵⁵²-β-链蛋白，p-t²¹⁷-β-链蛋白，p-t³³²-β-链蛋白和/或p-s⁶⁷⁵-β-链蛋白的产生和/或活性以治疗癌症的方法。这样的方法还减少和/或限制了癌症起始细胞。

相关技术描述

癌症干细胞(csc)模型提出，肿瘤由独特的具有自我更新能力而可分化成大部分非致瘤性后代的细胞亚群维持。有证据表明，这些常常罕见的csc优先存活于标准的化疗治疗中，但将csc与大部分肿瘤区分开并且特异性靶向它们仍然是相当大的挑战。最近在理解克隆进化在肿瘤发生中的作用的复兴提示了获得性抗性的挑战，并导致了两种主要的肿瘤发生模型，即癌症干细胞和克隆进化。这些不一定是相互排斥的，可以是互补的。两者都表明，持久治愈的主要障碍是癌症的异质性。然而，现有的抗癌疗法很大程度上无法解释这两种模式。靶向疗法的最新进展是有希望的，但是由于癌症的异质性和进化呈现多个移动靶标，所以抗性的发展是常见的。不幸的是，在靶向导致复发的化疗抗性细胞方面进展甚微。然而，无论是克隆进化、癌症干细胞还是混合模型最能解释治疗抗性，已经注意到干细胞特性可能代表一个关键的靶标。干细胞特性是指支配和维持干细胞状态的分子程序，而这种状态的核心是自我更新的能力。缺乏自我更新，癌症不能在化疗后持续或再生，但理解的是，然后靶向自我更新仍然是一个未满足的挑战。

wnt/β-链蛋白和pi3k/akt信号通路说明了肿瘤发生与异常自我更新之间的联系。wnt信号在这些过程中起着突出但复杂的作用。一些研究表明csc中β-链蛋白起关键作用，并且表明可以通过β-链蛋白通路抑制靶向csc，但是表明单独这个是不足以消除肿瘤的。由肿瘤抑制因子pten负调控的pi3k/akt通路由于其在细胞增殖、生长、存活和代谢以及干细胞调控中的关键作用而常常在癌症中失调。大量的努力都集中在药理学抑制这种抗癌疗法的通路上。尽管如此，新兴的临床数据显示pi3k通路抑制剂的功效仅仅是有限的，而动物研究表明pi3k抑制剂治疗可能导致抗性克隆的生长。事实上，使用pten突变t-细胞急性淋巴细胞性白血病(t-all)小鼠模型显示罕见的自我更新化疗抗性白血病干细胞(lsc)被鉴定为谱系阴性(lin^-)cd3⁺c-kit^mid细胞，而且它们大量的母细胞后代对不同的靶向治疗具有不同的敏感性。wnt/β-链蛋白和pi3k/akt通路甚至已被证明在肿瘤发生中具有协同作用。pten缺失导致过度的肠干细胞活性引起的肠息肉病。从机制上看，这种效应部分是由于在丝氨酸552(ps⁵⁵²-β-链蛋白)上的β-链蛋白的akt磷酸化所致，导致β-链蛋白的激活。实际上，β-链蛋白显示赋予对pi3k和akt抑制剂的抗性并促进结肠癌的转移。显示出β-链蛋白的间接抑制剂(端锚聚合酶抑制剂xav-939)可以在体外逆转这种抗性。不幸的是，该抑制剂在体内的低活性阻碍了有效的临床应用。

技术实现要素：

靶向wnt/β-链蛋白和pi3k/akt通路而获得的更有效的抗癌活性提供了上述潜力，但也具有上述提及的局限性。本发明人发现wnt/β-链蛋白和pi3k/akt通路协同作用以促进hsc自我更新和扩增。尽管单独激活任一通路与长期自我更新不兼容—pten缺失导致hsc增殖(但是由于过度分化耗尽)与β-链蛋白激活阻断分化(但导致hsc的凋亡)相结合，但是两者协调通过阻断增殖的hsc中的分化和凋亡来促进自我更新和hsc扩增(perry,j.m等.cooperationbetweenbothwnt/β-cateninandpten/pi3k/aktsignalingpromotesprimitivehematopoieticstemcellself-renewalandexpansion.genesdev25,1928-1942(2011)，通过引用并入)。在遗传正常的hsc中刺激两种通路的药物试剂导致未转化的干细胞的扩增；然而，这两种通路的永久基因激活导致白血病转化。

有多条证据表明，自我更新的csc/lsc是化疗抗性的原因。因为wnt/β-链蛋白和pi3k/akt通路相互作用刺激自我更新，并通过akt(ps⁵⁵²-β-链蛋白)磷酸化β-链蛋白，靶向ps⁵⁵²-β-链蛋白可抑制致癌的自我更新。在本公开的方法中，刺激正常的自我更新以发现致癌的自我更新的抑制剂。

因此，在广泛的方面，本发明提供了治疗癌症的方法，其包含向有需要的受试者施用能够选择性抑制p-s⁵⁵²-β-链蛋白，p-t²¹⁷-β-链蛋白，p-t³³²-β-链蛋白和/或p-s⁶⁷⁵-β-链蛋白的产生和/或活性的药物活性分子，其中，以有效降低和/或限制癌症起始细胞的量施用药物活性分子。

令人惊奇的是，本发明人发现长效化疗剂多柔比星(dxr或doxo或dox)选择性抑制ps⁵⁵²-β-链蛋白，而对总β-链蛋白的影响最小。在临床常用的高剂量时，dxr通过抑制拓扑异构酶ii而起到dna损伤剂的作用。dxr和其它化学治疗剂优先靶向肿瘤，并且dxr相对于其它化学治疗剂具有如此广泛和有效的抗癌活性。本发明人发现，通过使用较低的节拍剂量的dxr，特别是通过缓释的长循环dxr纳米颗粒(纳米dxr或纳米doxo)，可以抑制lsc的白血病起始活性，同时节省hspc。在体内，这种治疗降低了lsc中的ps⁵⁵²-β链蛋白水平，防止lsc的扩增，基本上消除了lsc致瘤活性，并伴有造血干/祖细胞(hspc，lin^-sca1⁺c-kit⁺)的恢复和显著增加了存活。本发明人还发现了细胞毒性化疗对罕见lsc与其大量白血病母细胞后代之间的动态关系。值得注意的是，发现通过靶向ps⁵⁵²-β-链蛋白-依赖性致癌自我更新并使用细胞毒化疗和化疗抗性lsc以二元靶向大量白血病母细胞对于最佳存活是必需的。在区分lsc及其后代的独特性质时，本发明人发现两种群体必须差异地靶向癌症的“根”和“分支”。

附图说明

图1显示了wnt/β-链蛋白和pi3k/akt通路的协同活化相继扩增了hspc，lsc和t-all原始细胞。pten：β-cat^act小鼠由他莫昔芬诱导。a，在9wpi时，bm的流式细胞仪分析显示所有双突变体，而不是单突变体，发展出以≥20％cd45^hi原始急变细胞为特征的白血病。b，这些细胞主要表达cd3但缺乏cd4和cd8表达，表明早期的t-all。c，在t-all发展之前，pten：β-cat^act小鼠显示通过流式细胞仪鉴定为lin^-sca-1⁺c-kit⁺(lsk)细胞的hspc的扩增。d，随着lsc(被鉴定为lin^-c-kit^midcd3⁺细胞)扩增，hspc群体崩溃。e，kaplan-meier存活曲线表明所有双突变体，而不是单突变体，以12wpi死于白血病。f，对照的单突变和双突变脾脏的抗ps⁵⁵²-β-链蛋白抗体染色(深灰色)在8wpi用浅h&e复染。频率基于总有核细胞的百分比±标准偏差(sd)。比例尺为10μm。

图2显示了dxr抑制β-链蛋白的pser⁵⁵²活性形式。a，总结hts设计的流程图。b，针对hek-293topflashakt^actβcat^act(top)和对照hek-293fopflashakt^actβcat^act(fop)细胞对验证库的化合物活性进行在多重剂量下抑制萤光素酶活性的测试。还测定了化合物的细胞毒性谱(ctg)。所示为3种感兴趣化合物的代表性数据。使用剂量响应数据(b)计算化合物的有效浓度，其使用非线性回归分析对发光或细胞毒性(ec90、ec50和ec25)进行90％，50％和25％的抑制。用(b)的ec90、ec50和ec25的候选化合物处理top和fop细胞48小时，洗涤并快速冷冻用于蛋白质分析(c)。请参见方法了解额外细节。d，显示了预测的akt和dxr与β-链蛋白结合的计算模型。e-f，fret分析验证akt和β-链蛋白之间的相互作用。用载体或25，50，100和200nm多柔比星处理用egfp-akt和mcherry-β-链蛋白转染的细胞，并测定fret效率(e)。f，加入多柔比星(200nm)后0.5，1，2和3小时的fret效率。

图3显示了化疗诱导ps⁵⁵²-β-链蛋白在lsc中的高表达受到低剂量dxr治疗的抑制。a，白血病治疗小鼠模型系统的实验装置示意图。b，将dxr重新定位为靶向治疗策略的说明。空心箭头表示dxr的典型临床应用的单个治疗周期以及被绘制成相对尺度的靶向使用策略(内盒)。三角形表示按比例绘制的dxr治疗。累计靶向剂量(连续5天分布)由内三角(白色)指示相对比例(参见方法)。c，代表性流式细胞仪分选门指示hspc，lsc和(非lsc)t-all原始细胞群体。d，将(c)的群体从如(a，b)所示治疗白血病小鼠中用载体、化疗、[低]dxr或化疗+[低]dxr分选，并用抗-ps⁵⁵²-β-链蛋白抗体染色。平均荧光强度(mfi)指示每个群体和治疗。e，如从(d)所示治疗小鼠中分选的lsc的ps⁵⁵²-β-链蛋白染色的代表性图像。比例尺为30μm(插图3μm)。

图4显示了lsc和原始细胞对化疗和[低]dxr治疗的不同响应。如图3a所示，用载体、化疗、[低]dxr或化疗+[低]dxr治疗白血病小鼠。a-c，在治疗后10天，通过流式细胞仪分析bm以确定原始细胞(a)、lsc(b)和hspc(c)的频率。显示的是有代表性的图。d，来自a-c的每个群体的平均频率±sd(每组n≥6)。e，在由化疗治疗的白血病小鼠分选的原始细胞和lsc上以及从[低]dxr治疗的小鼠分选的hspc上进行限制性稀释测定以确定cru频率。移植后10-12周在nsg受体中测定移植(≥1％原始细胞)。

图5说明了化疗诱导结合维持ps⁵⁵²-β-链蛋白抑制明显改善治疗结果。a，b，如图3a中所示，用载体、化疗、[低]dxr或化疗+[低]dxr治疗白血病小鼠组。在治疗后12天，从治疗的小鼠收获bm并移植到亚致死照射的nsg受体中。a，受体小鼠的治疗示意图和kaplan-meier曲线。b，[低]dxr治疗的白血病小鼠的bm的受体在移植后6个月通过流式细胞仪进行分析。所示为原始细胞、lsc和hspc的代表性图，本组29/30个受体的平均频率±标准差。c，如白血病发展后指示的那样治疗的小鼠的治疗示意图和kaplan-meier曲线。d，化疗和游离[低]dxr或[低]纳米dxr治疗后10天白血病小鼠的bm中的lsc和hspc频率。e，化疗+每周[低]纳米dxr治疗总共10周的治疗示意图和kaplan-meier曲线。虚线表示最终[低]纳米dxr治疗的天数。f，通过流式细胞仪在治疗后230天分析存活[低]纳米dxr治疗的小鼠。

图6说明了对照，pten，β-catact和pten：β-catact小鼠中的造血谱系分析。a，通过facs分析确定的对照，单突变和双突变骨髓8-9wpi的未成熟(b220低，igm+)，成熟(b220高，igm+)和pre-prob(b220低，igm-)细胞的百分比。b，通过facs分析确定的在8-9wpi对照，单突变体和双突变体中的骨髓(顶部)和脾脏(更低)中的mac-1+gr1+骨髓细胞的百分比。c，facs图说明了在d中定量的t-细胞谱系细胞的对照和双突变骨髓分析。d，在8-9wpi时在对照，单突变和双突变的骨髓中的cd3+，双阳性t细胞和单阳性t细胞的百分比。请注意对数刻度。e-f，在8-9wpi时对照，单突变和双突变胸腺中双阴性(dn)群体。e中示出了对照(上图)和双突变(下图)胸腺的代表性facs图。g-h，对照，单突变和双突变的双阳性和单阳性胸腺细胞群体。g中示出了对照(左图)和双突变(右图)胸腺的代表性facs图。结果绘制为平均值±sd。

图7说明了pten：β-catact白血病小鼠的骨髓和脾脏组织学。a，对照(左)和pten：β-catact突变体(右)的股骨。骨髓骨干和骨小梁骨区骨骺的h&e切片。b，对照、单突变和双突变的代表性脾脏。1cm比例尺。c，来自b的脾脏切片染色的masson'strichrome。

图8显示β-链蛋白的抑制防止化疗响应中lsc的扩增，但增加发病率。a-b，用化疗(奈拉滨+地塞米松)或结合或不结合泛β-链蛋白抑制剂治疗双突变小鼠。流式细胞仪分析显示，化疗刺激了lsc的扩增。用泛β-链蛋白抑制剂的额外治疗防止了这种扩增；然而，β-链蛋白在正常细胞功能中的关键作用导致存货差(c)。

图9显示了akt和β-链蛋白之间的fret验证。在mcherry-β-链蛋白+egfp-akt转染的细胞中观察到fret且其可被dxr抑制，但当仅用egfp转染mcherry-β-链蛋白时，基本上不出现可辨别的fret(也见图2e-f)。

图10说明了dxr优先抑制体外lsc扩增。a-b，在8wpi将从白血病的pten：β-catact小鼠分离的bm在hsc扩增培养基中培养。将多柔比星，0105375和硫鸟苷添加到11nm、33nm或100nm并培养72小时，并如图1所示通过流式细胞仪分析lsc(a)和hspc(b)。相对于等同的载体对照浓度指示每个群体培养前后的倍数变化。

图11显示了正常剂量的dxr在减少原始细胞方面与化疗相似，但是与[低]dxr不同。a，用载体，化疗(奈拉滨(nei.)+地塞米松(dexa.))，具有dexa的[低]dxr或正常剂量具有dexa的dxr(8×高于[低])治疗如图3a所述建立的白血病小鼠。在治疗后10天，通过流式细胞仪分析bm以确定原始细胞的频率。平均频率±sd(每组n≥6)。应注意的是，与图4不同，该实验使用正常或[低]dxr作为奈拉滨的替代物，但是由于单个dna损伤剂不能有效减少原始细胞，所有组均保留地塞米松治疗。这些数据显示，即使与地塞米松组合，[低]dxr也不能作为传统的化疗剂，而正常的dxr则可以。

图12显示了在化疗治疗的白血病小鼠中，单剂量dxr负载的纳米颗粒相对于游离dxr进一步减少了lsc。a-b，在有和没有化疗下，每天用0.5或0.15μg/g的游离dxr注射5次治疗如图3a中所述建立的白血病小鼠。或者，在有或没有化疗下，在第1天以0.8或2.5μg/g的dxr负载的纳米颗粒(纳米dxr)给予单次注射。治疗后10天，通过流式细胞仪分析bm以确定lsc(a)和hspc(b)的频率。显示的是平均频率±sd(每组n≥6)。应注意的是，5个剂量的0.15μg/gdxr是无效的；然而，具有相似累积剂量(0.8μg/g)的单次纳米dxr注射对于减少lsc是最有效的，同时允许hspc恢复。

图13说明了[低]纳米dxr治疗减少了体内功能性lsc。a-b，如图3a所示制备和治疗的白血病小鼠的组，但用[低]纳米dxr治疗。在治疗后12天，从治疗的小鼠收获bm并移植到亚致死照射的nsg受体中。a，受体小鼠的治疗示意图和kaplan-meier曲线。显示图5a的用于比较的游离[低]dxr治疗组(实线)(每组n＝30)。b，在移植后6个月通过流式细胞仪分析[低]dxr和[低]纳米dxr治疗的白血病小鼠bm受体的原始细胞，hspc和lsc(每组n＝27-29)。

图14说明了与相比，多柔比星纳米颗粒在消除白血病干细胞方面具有增强的有效性并且促进正常的造血干/祖细胞恢复。用载体、化疗或化疗结合每天五次低剂量的多柔比星(doxo)，纳米颗粒包封的多柔比星(纳米doxo)或(参见材料和方法)注射白血病小鼠。治疗后5-6天收集骨髓，通过流式细胞仪分析hspc(鉴定为谱系阴性，sca-1⁺，c-kit⁺细胞)和lsc(谱系阴性，c-kit^mid，cd3⁺细胞)。通过频率(a，c)和每股股骨绝对数量(b，d)量化lsc和hspc。

图15提供了a，游离多柔比星(dox)和多柔比星纳米颗粒(dox-nps)的体内循环时间。b，显示了注射24小时后荷瘤scid小鼠中dox和dox-nps的组织分布。数据表示为平均值±sd(n＝5)*p<0.05，**p<0.01。c在施用游离多柔比星(dox)和多柔比星纳米颗粒(dox-nps)后提供心脏肌钙蛋白i水平。

具体实施方式

在描述所公开的方法和材料之前，应该理解的是，本文描述的方面不限于具体的实施方式、方法、装置或配置，因此当然可以变化。还应该理解的是，本文使用的术语仅仅是为了描述特定方面的目的，除非在本文中具体定义，并不意在限制。

鉴于本公开，本文所述的方法可以由本领域普通技术人员配置以满足所需的需要。例如，在某方面，本公开内容提供了治疗癌症的方法，该方法包含向有需要的受试者施用能够选择性抑制p-s⁵⁵²-β-链蛋白，p-t²¹⁷-β-链蛋白，p-t³³²-β-链蛋白和/或p-s⁶⁷⁵-β-链蛋白的产生和/或活性的药物活性分子，其中，以有效降低和/或限制癌症起始细胞的量施用药物活性分子。在某些实施方式中，癌症对传统治疗有抗性。例如，本公开的癌症对放射疗法、化疗、免疫疗法或其任何组合具有抗性。

在其它实施方式中，癌症选自由白血病，淋巴瘤，前列腺癌，乳腺癌，子宫内膜癌，胃肠癌，肺癌，黑素瘤，肉瘤，成神经细胞瘤，间皮瘤，睾丸癌，甲状腺癌，卵巢癌，子宫癌症，胰腺癌，肝癌和肾母细胞瘤组成的组。在一种实施方式中，癌症是白血病。

在某些实施方式中，以低剂量和/或缓释和/或纳米颗粒制剂施用药物活性分子。在一种实施方式中，低剂量是药物活性分子对已知需要较高剂量的拓扑异构酶ii依赖性细胞毒性的抑制作用降低的剂量。例如，当制剂用于化疗时，低剂量可以是药物活性分子临床剂量的约1/5至约1/50，其中，临床剂量是批准在任何国家使用的人剂量。

在某些实施方式中，当制剂用于化疗时，低剂量可以是药物活性分子的临床剂量的约1/5至约1/40，或约1/5至约1/30，或约1/5至约1/25，或约1/5至约1/20，或约1/5至约1/15，或约1/5至约1/10，或约1/6至约1/50，或约1/7至约1/50，或约1/10至约1/50，或约1/15至约1/50，或约1/20至约1/50，或约1/25至约1/50，或约1/30至约1/50，或约1/40至约1/50，1/10至约1/40，或约1/10至约1/30，或约1/10至约1/25，或约1/10至约1/20，或约1/10至约1/15，1/20至约1/40，或约1/20至约1/30，或约1/20至约1/25，或约1/30至约1/40，或约1/15至约1/25，或约1/6至约1/30，或约1/7至约1/30，或约1/10至约1/30，或约1/15至约1/30，或约1/20至约1/30，或约1/25至约1/30，或至多约1/50，或至多约1/40，或至多约1/35，或至多约1/30，或至多约1/25，或至多约1/20或至多约1/15，或至多约1/10，或至多约1/8，或至多约1/6，或至多约1/5，其中，临床剂量是批准用于美国或任何其它国家的人剂量。

在某些实施方式中，低剂量可以是约0.01至约30mg/m²/天的药物活性分子。在其它实施方式中，低剂量为约0.01至约25，或约0.01至约20，或约0.01至约15，或约0.01至约10，或约0.01至约9，或约0.01至约7.5，或约0.01至约5，或约0.01至约3，或约0.01至约2，或约0.1至约30，或约0.1至约25，或约0.1至约20，或约0.1至约15，或约0.1至约10，或约0.1至约9，或约0.1至约7.5，或约0.1至约5，或约0.1至约3，或约0.1至约2，或约1至约30，或约1至约25，或约1至约20，或约1至约15，或约1至约10，或约1至约9，或约1至约7.5，或约1至约5，或约1至约3，或约1至约2，或约5至约30，或约5至约25，或约5至约20，或约5至约15，或约5至约10，或约5至约约9，或约5至约7.5，或约10至约30，或约10至约25，或约10至约20，或约10至约15，或约15至约30，或约15至约25，或约15至约20，或约20至约30，或至多约0.01，或约0.01且至多约0.05，或者至多约0.1，或者至多约0.5，或者至多约1，或者至多约2，或者至多约3，或者至多约4，或者至多约5，或者至多约6，或至多约7，或至多约8，或至多约9，或至多约10，或至多约15，或至多约20，或至多约25，或至多26，或至多28，或至多30mg/m²/天的药物活性分子。在非限制性实施例中，可以以约7至约8，或约7.5至约8.5mg/m²/天的剂量施用多柔比星。在非限制性实施例中，可以以至多约10mg/m²/天的剂量施用多柔比星。在非限制性实施例中，可以以约2至约3，或约2.45mg/m²/周(例如约0.34mg/m²/天)的剂量施用多柔比星纳米颗粒。

在某些实施方式中，低剂量可以是约20至约50mg/m²/天的药物活性分子。在其它实施方式中，低剂量为约25至约50，或约30至约50，或约40至约50，或约20至约45，或约20至约40，或约25至约45，或至多约50，或至多约45，或至多约40，或至多约35mg/m²/天的药物活性分子。

在某些实施方式中，药物活性分子是蒽环类抗生素或其药学上可接受的盐。蒽环类抗生素是一类来自链霉菌属的化合物。实施例包含但不限于多柔比星(doxorubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，表柔比星，伊达比星，戊柔比星和米托蒽醌。在一种实施方式中，药学活性分子是多柔比星或柔红霉素。在另一种实施方式中，药学活性分子是柔红霉素或其药学上可接受的盐。在又一种实施方式中，药物活性分子是多柔比星或其药学上可接受的盐。

在某些实施方式中，药物活性分子是疏水性分子。

在某些实施方式中，药物活性分子是国际公开号wo2015/054269和国际公开号wo2016/061310中公开的组合物中的任一种，两者均通过引用整体并入本文。

在一个方面，本公开的方法可以包含以纳米颗粒形式(例如核/壳纳米颗粒形式)施用药物活性分子。这样的纳米颗粒能够在自组装过程中将大量的疏水性药物分子包封到纳米颗粒中。亲水性表面保护纳米颗粒免受网状内皮系统(res)的吸收，并促进身体中的长循环。此外，纳米颗粒显著增加了药物在循环中的持续时间并减少了药物的心脏累积。最后，本公开的纳米颗粒可用于细胞内递送具有最小毒性的抗癌药物。

在一些实施方式中，其中，如上所述的药学活性分子以包含核/壳形式的嵌段共聚物的一种或多种纳米颗粒组合物施用，其中，所述嵌段共聚物包含：

第一嵌段，其结构式为：

和第二嵌段，其结构式为：

其中

m和n独立地为约3至约500的整数；

a独立地选自聚降冰片烯，聚环戊烯，聚环辛烯，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，聚硅氧烷，聚乳酸，聚己内酯，聚酯和多肽；

r1是任选地包含连接子的类固醇部分；以及

r2是聚环氧烷部分。

可用于本公开方法中的嵌段共聚物要求r1包含任选包含连接子的类固醇部分。如本领域普通技术人员理解的，可以选择合适的类固醇以满足所需的需要。例如，适用于本公开的材料的类固醇部分包含胆固醇，胆酸，脱氧胆酸，牛磺胆酸，羊毛甾醇，雌二醇，睾酮，胆汁酸，地塞米松，开环甾类化合物(secosteroid)或植物甾醇类。在一些实施方式中，类固醇部分包含胆固醇，胆酸，脱氧胆酸或牛磺胆酸等。在一种实施方式中，类固醇部分包含胆固醇。

类固醇部分可以通过合适的连接子与聚合物骨架连接。连接子的一些示例包括但不限于：

聚内酯或硅氧烷的低聚物。在一种实施方式中，r1处的连接子是：在另一种实施方式中，r1处的连接子是

可用于本公开方法的嵌段共聚物要求r2包含聚环氧烷部分。如本领域普通技术人员理解的，可以选择合适的聚环氧烷来满足所需的需要。在一些实施方式中，聚环氧烷部分包含聚环氧乙烷或聚环氧乙烷硫醇盐。在另一种实施方式中，聚环氧烷部分包含聚环氧乙烷。

可用于本公开方法的嵌段共聚物需要骨架部分a。本文所述的嵌段共聚物可包含例如本领域技术人员可获得的聚降冰片烯，聚环戊烯，聚环辛烯，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯和聚硅氧烷骨架a，并可根据所需产品而变化。在一种实施方式中，本公开的嵌段共聚物是其中每个a独立地为聚降冰片烯或聚丙烯酸酯的嵌段共聚物。在另一种实施方式中，每个a独立地是聚降冰片烯。在另一种实施方式中，每个a独立地为聚丙烯酸酯。

在一种实施方式中，可用于本公开方法的嵌段共聚物包含以下结构：

其中，x是约3至约100之间的整数；m是约5至约200之间的整数；并且n是约5至约100之间的整数。在一些实施方式中，x在约5至50之间。在其它实施方式中，x是约8或x是约44。

m和n的值可由本领域技术人员选择，并可根据所需产品而变化。例如，m可以在约10至约100之间；和/或n可以在约15至约85之间。本公开的嵌段共聚物的分子量可以在约10000至约1000000da之间。在一种实施方式中，本公开的嵌段共聚物为约40000至约750000da，或约60000至约700000da，或约60000至约100000da，或约40000至约200000da。

在一些其它实施方式中，其中，如上所述的药物活性分子以包含核/壳形式的嵌段共聚物的一种或多种纳米颗粒组合物施用，其中，所述嵌段共聚物包含：

第一嵌段，其结构式为：

和第二嵌段，其结构式为：

其中

q是约3至约500的整数；

a¹独立地选自聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，聚降冰片烯，聚环戊烯，聚环辛烯，聚硅氧烷，聚乳酸，聚己内酯，聚酯和多肽；

r¹¹是任选包含连接子r¹⁴的类固醇部分；

r¹²是聚环氧烷，聚酯或多肽部分；以及

r¹³是二硫键连接子部分。

在一些实施方式案中，r¹¹中的类固醇部分包含胆固醇，胆酸，脱氧胆酸，牛磺胆酸，羊毛甾醇，雌二醇，睾酮，胆汁酸，地塞米松，开环甾类化合物或植物甾醇类等。在另一种实施方式中，r¹¹中的类固醇部分选自胆固醇，胆酸，脱氧胆酸和牛磺胆酸。在另一种实施方式中，r¹¹中的类固醇部分包含胆固醇。

类固醇部分可以通过合适的连接子r¹⁴与聚合物骨架连接。连接子r¹⁴的一些示例包括但不限于：

聚内酯或硅氧烷的低聚物。在一种实施方式中，r¹⁴处的连接子是在另一种实施方式中，r¹⁴处的连接子是：在另一种实施方式中，r¹⁴处的连接子是：在一种实施方式中，r¹⁴处的连接子是：

在一种实施方式中，可用于本公开方法的嵌段共聚物是其中每个a¹独立地为聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯或聚酯的嵌段共聚物。在另一种实施方式中，每个a独立地为聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯。在另一种实施方式中，每个a¹独立地为聚丙烯酸酯。在另一种实施方式中，每个a¹独立地为聚甲基丙烯酸酯。在另一种实施方式中，每个a¹独立地为聚酯。

在示例性实施方式中，第一嵌段具有下式：

在一种实施方式中，r¹²是聚环氧烷部分。可以选择合适的聚环氧烷以满足所需的需要。在一些实施方式中，聚环氧烷部分包含聚环氧乙烷，聚环氧乙烷硫醇盐，聚环氧丙烷或聚环氧丙烷硫醇盐。在另一种实施方式中，聚环氧烷部分包含聚环氧乙烷或聚环氧乙烷硫醇盐。在另一种实施方式中，聚环氧烷部分包含聚环氧乙烷。

在一种实施方式中，r¹²是聚酯部分。合适的聚酯包括在其主链中含有酯官能团的聚合物。实例包括但不限于聚乳酸，聚乙交酯(polyglycolides)，聚己内酯等。

在一种实施方式中，r¹²是多肽部分。合适的多肽包括通过肽(酰胺)键连接在一起的一个或多个氨基酸单体链，并且可包含l-氨基酸，d-氨基酸(其对体内l-氨基酸特异性蛋白酶具有抗性)或d-氨基酸和l-氨基酸的组合。通常，本文所述的多肽是指长度小于约100个氨基酸的链。本文所述的多肽可以是化学合成的或重组表达的。

第二嵌段还包含含有可还原二硫键的r¹³连接子部分。在一种实施方式中，r³选自由以下组成的组：

在一种实施方式中，r¹³是在另一种实施方式中，r¹³来源于在某些实施方式中，本公开的共聚物可以进一步包含链末端部分x：在一种实施方式中，x是三硫代碳酸酯、二硫代氨基甲酸酯或二硫代酯。在另一种实施方式中，x是-sc(s)s-(c1-c24烷基)。在另一种实施方式中，x是-sc(s)s-c12h25。

在一种实施方式中，可用于本公开方法的嵌段共聚物包含以下结构：

其中，q是约5至约200之间的整数；r是约5至约100之间的整数。

q和r的值可以由本领域技术人员选择，并且可以根据所需产品而变化。例如，q可以在约10至约100之间；和/或r可以在约15至约85之间。本公开的嵌段共聚物的分子量可以在约5000至约200000da之间。在一种实施方式中，本公开的嵌段共聚物为约5000至约150000da，或约5000至约100000da，约5000至约60000da，或约10000至约150000da，或约10000至约100000da，或约10000至约60000da，或约20000至约150000da，或约20000至约100000da，或约20000至约60000da。

在一种实施方式中，本公开的方法包括以两种不同的纳米颗粒组合物的组合施用药物活性分子。在一些实施方式中，第一纳米颗粒组合物包含为多柔比星的疏水性药物活性分子。在其它实施方式中，第二纳米颗粒组合物包含选自由柔红霉素，长春新碱，表柔比星，伊达比星，戊柔比星，米托蒽醌，紫杉醇，多西他赛，顺铂，喜树碱，伊立替康，5-氟尿嘧啶，甲氨蝶呤或地塞米松组成的组的疏水性药物活性分子。在一些其它实施方式中，第二纳米颗粒组合物包含选自柔红霉素和表柔比星的疏水性药物活性分子。

可用于本公开的方法中的纳米颗粒可以进一步包含金属纳米颗粒(例如金纳米颗粒和/或磁性纳米颗粒和/或量子点(例如近红外(nir)量子点、cdse等))中的一种或多种。

可用于本公开内容的方法中的纳米颗粒的尺寸可以是约5至约900nm的任何值。例如，纳米颗粒可以在约5至约200nm之间，或者在约10至约100nm之间，或者在约10至约200nm之间，或者在约50至约150nm之间，或者在约100至约250nm之间，或者在约100至约200nm之间，或者在约120至约150nm之间，或者在约110至约150nm之间，或者在约120至约180nm之间，或者在约150至约250nm之间，或者在约150至约200nm之间。

定义

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”和“包括”以及变体(例如，“包含了”，“包含有”，“包括了”，“包括有”)将被理解为表示包含所述组件、特征、元素或步骤，或组件、特征、元素或步骤的组，但不排除任何其它整数，或步骤，或整体或步骤的组。

如在说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数指代物。

范围可以在本文中表达为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个方面包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当数值被表达为近似值时，通过使用先行词“约”，应理解的是，该特定值形成另一方面。进一步理解的是，每个范围的端点对于另一个端点是有意义的，并且独立于另一个端点。在一些实施方式中，术语“约”是指所述值±10％。在另一种实施方式中，术语“约”是指所述值的±5％。

本文使用的术语“活性”，例如蛋白质活性包括该蛋白质的直接活性和该蛋白质的间接下游活性。例如，与蛋白14-3-3ζ的相互作用导致β-链蛋白的稳定化，β-链蛋白的核定位增强，对tcf/lef转录因子位点的结合/活性增强，或导致干细胞增殖的分子程序的活化。

本文使用的术语“癌症起始细胞”(cic)，例如“癌症干细胞”(csc)包括具有产生或再生肿瘤能力的细胞。在某些实施方式中，cic对标准的化疗治疗具有抗性。

如本文所用，术语“结合”包括向反应混合物中加入一种或多种物质。

如本文所用，术语“分散度”，“多分散度”，“多分散指数”，“pdi”和“mw/mn”可互换使用，指的是聚合物均匀性相对于分子量分布的关系。分散度可以通过重均分子量(mw)除以数均分子量(mn)(即mw/mn)计算。在某些实施方式中，分散度可根据聚合度计算，其中，分散度等于xw/xn，其中，xw是重均聚合度，xn是数均聚合度。

除非另外指明，否则本文中的所有百分比、比率和比例均以重量计。除非特别说明，否则组分的重量百分比(重量％，也作为wt％)是基于其中包括组分的组合物的总重量(例如以反应混合物的总量计)。

术语“减少和/或限制癌症起始细胞”包括与不接受治疗的细胞相比，任何绝对减少量(约5％，约10％，约25％，约50％，约75％，约95％或更多，或完全消除)的癌症起始细胞，以及限制扩增速率约5％，约10％，约25％，约50％，约75％，约95％或更多的任何量。

“治疗有效量”是指当施用于受试者时足以实现对本文所述疾病或病症的治疗效果的化合物的量。构成“治疗有效量”的化合物的量将根据化合物、病症和其严重程度以及待治疗的受试者的年龄而变化，但是可以由本领域普通技术人员常规确定。

本文使用的“治疗”或“治愈”涵盖本文所述的受试者(优选人类)的疾病或病症的治疗，并且包括：

i.抑制疾病或病症，即阻止其发展；

ii.缓解疾病或病症，即导致病症消退；

iii.减缓病症的进展；和/或

iv.抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。

“受试者”是指患有或可能患有本文所述的一种或多种疾病和病症的恒温动物，例如哺乳动物，优选人类，或人类的儿童。

“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性，刺激性，过敏反应，或者与合理的利益/风险比相称的其它问题或并发症，或者美国食品和药物管理局另外已批准可接受用于人类或家畜的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

“药学上可接受的盐”是指酸和碱加成盐。

本文使用的术语“聚酯”包括在其主链中含有酯官能团的聚合物。非限制性实例包括聚乳酸，聚乙交酯，聚己内酯等。如本文所用，术语“多肽”包括通过肽(酰胺)键连接在一起的氨基酸单体链，并且可以包含l-氨基酸，d-氨基酸(其对体内l-氨基酸特异性蛋白酶具有抗性)或d-氨基酸和l-氨基酸的组合。通常，本文所述的多肽是指长度小于约100个氨基酸的链。本文所述的多肽可以是化学合成的或重组表达的。

实施例

以下实施例进一步说明了本发明的材料和方法，这些实施例不应被解释为将本发明的范围或精神限制于其中描述的具体步骤和材料。

材料和方法

动物

小鼠被安置在斯托瓦斯医学研究所(simr)的动物设施中，并根据研究所和nih指南进行处理。所有程序均由simr的iacuc批准。hsc-scl-cre-er^tpten^loxp/loxpβcat(ctnnbl)^{loxp(exon3)/+}(以下称为pten：β-cat^act)小鼠模型结合了loxp侧翼pten的条件缺失以导致pi3k/akt通路的活化，以及β-链蛋白(β-cat^act)的外显子3以导致β-链蛋白的组成型活化。采用造血干/祖细胞(hspc)特异性cre重组酶(hscscl-cre-er^t)研究hspc起始的两种通路的结合作用，以及没有干扰素诱导的hsc活化作用。通过腹膜内注射他莫昔芬5天，在第1天使用5mg和第2天至第5天各2mg(溶解在0.1ml玉米油中)以诱导原代hsc-scl-cre小鼠。使用超声波仪完全溶解他莫昔芬。通过将移植受体置于他莫昔芬饲料(1mg/g)上2周以在移植受体中诱导hsc-scl-cre。hsc-scl-cre，pten和β-cat^act分别从joachimgoethert(德国埃森-杜伊斯堡大学)，hongwu(加州大学洛杉矶分校)和makototaketo(日本京都大学)获得。

移植测定

从未诱导的hsc-scl-cre⁺pten^fx/fxβcat^fx(exon3)/+(pten：β-cat^act)小鼠中分离全骨髓，并将其与等同的来自同窝出生的cre阴性骨髓组合并移植到经照射的(10gy)b6.sjl-ptprc^apepc^b/boyj(ptprc)受体中。受体在移植后4-6周置于他莫昔芬饲料上以诱导重组，导致在所有受体小鼠中诱导后7-8周的白血病发展。

如上所述，通过建立白血病小鼠进行限制性稀释和致瘤性测定，并正如在诱导后8周进行治疗。对于限制性稀释移植物，用化疗或[低]dxr治疗小鼠，并且在治疗后10天(基于第一次治疗)，从化疗治疗的小鼠中分选cd45^h1cd³⁺c-kit^-原始细胞或lin^-cd³⁺c-kit^midlsc。从[低]dxr治疗的小鼠中分选lin^-sca-1⁺c-kit⁺hspc。将所示数目的这些群体移植到3.25gy照射的nod.cg-prkdc^scidil2rg^tm1wjl/szj(nsg)受体小鼠中。在移植后10-12周通过流式细胞术分析受体骨髓，且骨髓中具有≥1％cd45^hi原始细胞的细胞被认为是移植的。使用elda分析确定cru频率。

通过将治疗后12天的治疗小鼠的0.5，1.5或4.5×10⁴个骨髓细胞移植到3.25gy照射的nsg受体小鼠中以进行致瘤性测定。每个剂量组使用10名受体。每组使用一名男性和一名女性捐献者。通过分析cd45^hicd3⁺细胞频率而在由于健康状况差而被安乐死的小鼠中评估白血病。在骨髓中具有>20％的原始细胞的小鼠被认为是白血病。nsg和ptprc小鼠最初从杰克逊实验室(jacksonlaboratory)获得。

体外治疗

将诱导后8周的白血病小鼠的骨髓细胞在hsc扩增培养基中在96孔u-底部组织培养板(becton，dickinsonandcompany；目录号353077)中以每孔5至20×10⁴个细胞在如前所述的低氧气条件下培养过夜(perry,j.m.等.cooperationbetweenbothwnt/{beta}-cateninandpten/pi3k/aktsignalingpromotesprimitivehematopoieticstemcellself-renewalandexpansion.genesdev25,1928-1942(2011))。将多柔比星(sigma；d1515)，0105375((s)-n-(2-溴苄基)-n-(1-羟基-3-苯基丙-2-基)乙烯磺酰胺，堪萨斯大学cmld化合物)或硫鸟苷与hsc扩增培养基混合并添加到培养物中以获得最终浓度为11nm、33nm、100nm。将等量的单独的dmso(载体对照)加入到平行培养物中用于比较。大约每24小时进行半介质改变。暴露于指定药物72小时后分析培养物。

体内治疗

化疗由奈拉滨(selleck)和地塞米松(biovision)连续5天每天施用构成。根据公式通过尾静脉静脉内施用43.4mg/ml奈拉滨：体重(g)×5＝注射体积(μl)，以得到217mg/kg。根据公式腹腔注射2.5mg/ml地塞米松：体重(g)×4＝注射体积(μl)，以得到10mg/kg。[低]dxr(也被称为[低]doxo或全文)治疗由0.5mg/kg的连续每日剂量组成，使用0.1mg/ml盐酸多柔比星(sigma；d1515)，根据公式通过尾静脉静脉内注射：体重(g)×5＝注射体积(μl)，以产生0.5mg/kg。[低]纳米dxr(全文中也称为[低]纳米doxo)治疗使用多柔比星纳米颗粒，如国际专利公开号wo2015/054269(通过引用整体并入)中所述的，相对于使用0.8mg/kg的上述治疗，在第1天每周一次以单次iv注射施用。维持[低]纳米dxr由每周一次注射0.4mg/kg构成。将奈拉滨和多柔比星结合在一起的组合使用含有两种药物的单次注射。所有药物溶解在45％(2-羟丙基)-β-环糊精(hbc)中。

多柔比星剂量的理论依据：对于临床all疗法，多柔比星通常以每21至28天一次的40至75mg/m²单一剂量施用。使用60mg/m²作为临床等效剂量，相当于成人的1.6mg/kg(60mg/m²×1m²/37kg＝1.6mg/kg)。换算成小鼠，相当于约20mg/kg(1.6mg/kg×12.3(km(人)/km(小鼠))＝19.7mg/kg(freireich，ej等，quantitativecomparisonoftoxicityofanticanceragentsinmouse,rat,hamster,dog,monkey,andman.cancerchemotherapyreports.part150,219-244(1966))。累积地，施用2.5mg/kg多柔比星，因此，在5天内相当于临床剂量的1/8。

流式细胞仪

从骨髓(股骨和胫骨)，脾脏，外周血和胸腺收集细胞。对于细胞表面表型分型，使用谱系混合物(lin)，包括cd3(用于hspc但不是lsc分析)，cd4，cd8，mac-1，gr1，b220，igm和ter119(ebioscience，sandiego，ca)。在指明的情况下，也使用针对cd3的单克隆抗体(用于lsc分析的单独荧光团)，sca-1，c-kit，cd45.1和cd45.2。使用influx(bd)，moflo(dako，ft.collins，co)和/或cyanadp(dako，ft.collins，co)进行细胞分选和分析。数据分析使用flowjo软件(ashland，or)进行。

免疫染色

将细胞分选到赖氨酸包被的载玻片上，用甲醇固定，使用universalblock阻断，并以1:50稀释度对ps552-β-链蛋白染色。

fret测定

使用受体光漂白方法进行fret测量。简而言之，用egfp-akt和mcherry-β-链蛋白(addgene，#39531，#55001)转染293t细胞。使用带有csu-x1yokogawa光盘的perkin-elmerultraview旋转盘系统进行成像。使用40x1.2na平场复消色差物镜，并将发射收集到c9100hamamatsuphotonicsem-ccd上。用488nm激光激发egfp，通过500至555nm带通滤波器收集发射。mcherry被照亮，并用561nm激光进行光漂白。用580至650nm带通滤波器收集mcherry的发射。在561nm强光的mcherry漂白之前获得6个egfp的图像并在561nm强光的mcherry漂白之后获得8个egfp的图像。在减去照相机背景之后，在受体漂白剂(i1)之前的4个图像或在受体漂白剂(i2)之后的4个图像中测定跨漂白细胞的感兴趣区域中的egfp的平均强度。fret效率报告为1-(i1/i2)。计算是基于>500个细胞图像。

高通量筛选

从cmld(1920)，prestwick(1120)和microsourcespectrum(2000)抽取的验证库(5040个化合物)的初步筛选中选择243种化合物，并以10个浓度的剂量反应再确认。针对hek-顶细胞与hekfop细胞测试化合物的活性以抑制萤光素酶活性。还使用celltiterglo测定(promega)在hek-top细胞系上测试化合物的细胞毒性谱。使用剂量响应数据，使用非线性回归分析来计算ec50(导致发光或细胞毒性的50％抑制的化合物的有效浓度)。大约90种化合物显示top和fop细胞之间的ec50差异为2.2至3倍。这36个化合物中，发光抑制和细胞毒性之间显示出一个窗口。通过化学信息学分析对化合物的结构进行了分析，医药化学家鉴定了25种化合物以新鲜粉末形式回购。将回购的化合物用于处理化合物浓度的细胞，其导致对来自hektop细胞系中的发光抑制的剂量响应曲线产生90％，50％和25％的发光抑制(ec50，ec50和ec25)。将hek细胞和hek顶细胞以300000个细胞/孔接种在6孔板中，并用ec90，ec50和ec25浓度的25个回购化合物以及三个对照重复处理。暴露48小时后，用pbs洗涤细胞并快速冷冻。将冷冻的细胞直接在板中裂解以用于蛋白质分析。

统计分析

数据以平均值±标准偏差表示。使用student’st检验进行配对比较。

实施例1.wnt/β-链蛋白和pi3k/akt通路的同时激活导致hspc，lsc和t-all原始细胞的连续扩增。

以前的工作表明wnt/β-链蛋白和pi3k/akt通路的协同活化驱动自我更新，但导致白血病转化。探讨活化hspc中两种通路的pten：β-cat^act小鼠中的白血病个体发生和性质。pten：β-cat^act双重突变体始终如一且强烈地发展出原始急变细胞，如>20％的cd45^hi白血病原始细胞。这些细胞对于主要谱系标志物是阴性的，但是在对cd4和cd8是阴性的同时表达cd3，表明在早期t-细胞发育中阻断成熟(图1a-b)。来自bm、脾脏和胸腺的主要谱系的分析显示成熟谱系减少，胸腺中未成熟(双重阴性)胸腺细胞大量增加，并且在诱导后9-10周cd3⁺原始细胞超过bm区室(wpi)(图6)。为了追踪这种t-细胞急性淋巴细胞白血病(t-all)的个体发生，我们在更早的时间点分析了用于hspc和lsc的骨髓，前者被鉴定为谱系阴性(lin^-)，sca-1⁺c-kit⁺细胞，且后者为cd3⁺(但另有lin^-)和c-kit^mid细胞²⁰。与我们以前的研究相似，我们发现在6wpi的双突变体中hspc的显著累积与广泛分化阻断的更成熟(lin^-c-kit⁺sca-1^-)祖细胞的相应减少相一致(图1c；参见perry等，2011关于hsc扩增的更多细节)。在这个阶段，我们也发现了一个罕见的lsc群体，随着hspc群体的崩溃，这个群体更频繁达8wpi(图1d)。所有双突变小鼠12wpi后死于t-all(图1e)。这种快速和一致的t-all发展是双突变体独特的。诱导后6个月内仅有25％的pten单突变体发生白血病。在组织学上，骨髓腔主要由白血病原始细胞所占据，但小梁骨区域(hsc生态位的主要位点)保持了造血功能的残余保留(图7a)。双突变体也表现出脾肿大和正常结构的破坏(图7b-c)。有趣的是，ps⁵⁵²-β-链蛋白阳性细胞在双突变体脾脏中特别增加(图1f)。总的来说，这些数据表明wnt/β-链蛋白和pi3k/akt通路的协同活化驱动表型hspc的进行性扩增，并转化为lsc而导致t-all。

实施例2.dxr靶向ps552-β-链蛋白同时节省总β-链蛋白。

由于正常hsc中wnt/β-链蛋白和pi3k/akt通路的药理活化协同驱动自我更新和扩增，测试了这种协同的抑制是否可以阻止致癌的自我更新。虽然在使用新的泛β-链蛋白抑制剂减少lsc中取得了一些成功，但重点是抑制β-链蛋白的ps⁵⁵²-β-链蛋白活性形式以更特异性靶向通路的协同活性并且比泛β-链蛋白抑制剂具有更低的毒性(图8)。高通量筛选(hts)鉴定了这种特异性抑制的几种候选物(图2a)，根据它们抑制ps⁵⁵²-β-链蛋白的能力，其范围缩小至3种化合物，对泛β-链蛋白的影响较小：dxr，0105375，和硫鸟苷(图2b-c)。有趣的是，dxr和硫鸟苷是已知的抗癌剂，其中dxr是最成功的抗癌疗法之一，硫鸟苷原来被用于all和随后的其它肿瘤。新型化合物0105375有效地抑制了ps⁵⁵²-β-链蛋白，而对泛β-链蛋白没有显著影响，但仅在相对高浓度(>1μm)下才有效(图2c)。尽管硫鸟苷在抑制ps⁵⁵²-β-链蛋白的同时大部分地节省了泛β-链蛋白，但其总体毒性水平较高(图2b-c)。最有希望的似乎是dxr，它能有效地抑制ps⁵⁵²-β-链蛋白，而在相对较低的浓度下对泛β-链蛋白的影响很小(图2b-c)。实际上，计算模型表明，akt和dxr都在β-链蛋白的ps⁵⁵²位点附近结合(图2d)。

为了测试dxr是否可以阻断akt和β-链蛋白之间的相互作用，使用egfp-akt和mcherry-β-链蛋白转染的细胞进行荧光共振能量转移(fret)分析。在载体处理的细胞中，fret效率为2.24％，但随着dxr浓度(图2e)和dxr暴露时间(图2f)的增加而降低。然而，仅用egfp和mcherry-β-链蛋白转染的细胞没有显示可辨别的fret，并且载体与dxr处理没有差异(图9)。这些数据表明akt与β-链蛋白相互作用，并且dxr有效地抑制了这种相互作用。

在体外进行这些候选药物对从白血病双突变体分离的bm细胞作用的测试。相对于载体，dxr显著减少了lsc而不是hspc(图10)。由于硫鸟苷不仅减少了lsc，而且还减少了hspc，并且由于0105375的效力远低于dxr，所以我们关注了dxr的体内研究。总之，这些数据显示dxr可以抑制ps⁵⁵²-β-链蛋白，而对总β-链蛋白的影响最小。有趣的是，dxr表现出最广泛的已知抗癌活性，几十年来一直被用作标准的化疗试剂，但严重的副作用限制了它的使用。然而，如果将dxr用作靶向ps⁵⁵²-β-链蛋白抑制剂而不是dna损伤剂，毒性可能会降低。

实施例3.低剂量dxr处理抑制化疗抗性lsc中高水平的ps552-β-链蛋白独特的过表达。

接下来确定dxr是否可以抑制体内ps⁵⁵²-β-链蛋白。为了获得相对较大的可以在诱导后的同一阶段一致使用的白血病小鼠以测试不同治疗方案，将来自未诱导的pten：β-cat^act小鼠的全部bm移植到照射的受体中。这与来自同窝的cre阴性bm以1：1的比例结合以允许正常细胞和白血病细胞之间的潜在竞争，并更密切地反映临床情况。在4至6周的恢复和移植后，将小鼠置于他莫昔芬饲料上以诱导重组。8周后，在所有受体中建立白血病，然后接受各种治疗(图3a)。

为了将dxr重新定位为ps552-β-链蛋白的靶向抑制剂而非细胞毒性化疗药物，使用了远低于典型临床剂量的剂量。虽然dxr通常是每3至4周弹丸注射一次，但连续5天每天施用临床当量剂量(0.5μg/g)的1/40，产生典型量的1/8的累积剂量(称为[低]dxr)(图3b)。为了确定dxr是否可以抑制ps552-β-链蛋白以及在哪个细胞中，使用流式细胞仪从治疗的小鼠中分选hspc，lsc和非lsc原始细胞，并对ps552-β-链蛋白染色(图3c)。尽管ps552-β-链蛋白在原始细胞和hspc中接近背景水平，但lsc具有ps552-β-链蛋白的平均升高。尽管一致的变异性在这种差异中没有统计学意义，但是从最近用[低]dxr治疗的小鼠分离的lsc中这个平均值降低了(图3d-e)。

为了了解hspc，lsc和原始细胞如何对化疗响应，以及这可能如何影响其ps⁵⁵²-β-链蛋白状态，其它组单独用化疗(见方法)或用[低]dxr进行化疗。有趣的是，lsc在化疗响应中持续表达高水平的ps⁵⁵²-β-链蛋白，而hspc和原始细胞都不能。值得注意的是，与[低]dxr治疗结合，ps⁵⁵²-β-链蛋白水平显著降低至背景水平(图3d-e)。这些数据首先证明了化疗能够在lsc中持续高水平特异性地和独特地诱导ps⁵⁵²-β-链蛋白，其次，可以使用低剂量重新定位dxr以作为ps⁵⁵²-β-链蛋白的抑制剂。

实施例4.靶向ps⁵⁵²-β-链蛋白选择性地消除化疗抗性lsc

接下来测定化疗和[低]dxr对原始细胞、lsc和hspc的不同作用。正如所料，与载体相比，化疗大大减少了原始细胞。但是，这也导致了lsc的大规模扩增，但hspc没有显著变化。值得注意的是，[低]dxr不能显著减少原始细胞(图4a-d)，但dxr的临床等效剂量与其化疗的降低相似(图11)，[低]dxr治疗支持更特异更少的细胞毒作用。然而，与载体相比，[低]dxr显著减少lsc，并且允许hspc显著恢复。总体而言，化疗和[低]dxr显示对这些群体的二分法影响，化疗靶向原始细胞，但诱导lsc扩增，而[低]dxr没有显著靶向原始细胞，但减少了lsc。结合时，[低]dxr治疗的化疗不仅减少了原始细胞和阻止了lsc的扩增，而且基本上消除了可检测的lsc。结合治疗也使得hspc的一致和显著恢复(图4a-d)。

为了定量在化疗治疗的小鼠中lsc相对于原始细胞的致瘤活性，在亚致死剂量照射的nod-skid-il2rg^-/-(nsg)受体中进行限制性稀释移植物。与从相同供体分选的原始细胞(图4e；表1)相比，由化疗治疗的小鼠分选的lsc显示出竞争性再增殖单位(cru)活性增加>1300倍。由化疗治疗的小鼠分选的lsc也比从[低]dxr治疗的小鼠分选的hspc具有10倍的cru频率，并且与lsc和原始细胞不同，这些hspc仅以低水平移植，而在移植后10至12周没有发展成白血病(图4e；表1)。总之，图3和图4显示化疗不仅不能消除lsc，而且还诱导ps⁵⁵²-β-链蛋白的表达和功能性lsc扩增。然而，[低]dxr治疗抑制ps⁵⁵²-β-链蛋白表达和lsc扩增。值得注意的是，这些治疗对lsc和原始细胞表现出不同的作用。

表1

实施例5.大量白血病原始细胞和化疗抗性lsc的二元靶向实质上增加了长期存活。

接下来确定lsc是否不仅在表型上而且在[低]dxr治疗中功能性降低。如图3a所示建立了一组小鼠。用载体、化疗、[低]dxr或化疗+[低]dxr完成治疗一周后，我们将来自治疗小鼠的bm移植到经照射的nsg受体中以测试致瘤细胞。用载体治疗的受体在诱导后以与初级突变体类似的方式死于白血病(图5a)。然而，用化疗治疗的白血病小鼠的bm受体更快地死亡，尽管组中25％的小鼠表现出延长存活。大多数受体的存活率降低与化疗诱导的lsc扩增一致(图4)。几乎所有(29/30)来自单独用[低]dxr治疗的小鼠的bm的受者在移植后近6个月保持健康。对这29名幸存者的分析显示只有微量的原始细胞和lsc，hspc在正常参数范围内(图5b)。这些数据通过[低]dxr治疗支持功能性lsc的特异性靶向。

来自化疗+[低]dxr治疗的小鼠的bm的大部分受体也在移植后6个月内死于白血病；然而，与单独化疗组相比，它们的中位生存期(mediansurvival)从44.5天显著延长至104.5天(图5a)。因此，尽管结合治疗基本上消除了表型lsc，但是功能性lsc最终在化疗暴露中恢复。尽管如此，[低]dxr治疗显著减少具有lsc活性的化疗抗性细胞。

为了确定长期存活，如图3a所示建立了白血病小鼠组，但是这次观察到长期治疗的小鼠没有移植到nsg小鼠中。虽然单独用载体治疗的小鼠以与未治疗小鼠相似的速度死于白血病，但单独用化疗治疗的小鼠表现出稍微改善的总体存活；尽管如此，仍然在治疗后50天死亡(图5c)。[低]dxr单独治疗的小鼠表现出轻微的和微不足道的改善，可能是由于[低]dxr治疗对原始细胞的最小和微不足道的作用(图4a)。然而，与单独的化疗(p<0.05)或[低]dxr(p<0.01)相比，将化疗和[低]dxr治疗结合显著增加了存活率(图5c)。

虽然有意义，但在初级治疗的小鼠中这些改善是渐进的(图5c)。由于功能性lsc在结合(化疗+[低]dxr)治疗(图5a)后仍然存在，所以白化(whiteout)受到特定理论的约束，假设仅使用单个周期的化疗结合更持续的维持治疗[低]dxr可能更好地防止lsc重新形成白血病。多柔比星造成的潜在组织损伤，特别是在进行多次注射时，使得dxr的长期维持剂量不切实际。然后使用装载有dxr的纳米颗粒(纳米dxr)不仅减少了潜在的组织损伤，而且还允许在化疗治疗期间缓慢，更持续地释放dxr。由于这些纳米颗粒提供稳定，持续释放的dxr，使用纳米dxr可以改变剂量方案以避免重复的每日dxr注射。测试多剂量的游离dxr和纳米dxr以进一步优化该治疗(图12)。在第1天以单次注射形式递送的1/8临床当量剂量的纳米dxr与在5天内分布的游离dxr的等效累积剂量一样可以有效减少lsc(参见补充方法)。此外，这种单次注射可以减少至1/25的临床量(相当于至少相同的功效)(图12)。因此，一组白血病小鼠如前所述进行了化疗测试，在第1天仅结合了单次1/25纳米dxr注射。由于高水平的ps⁵⁵²-β-链蛋白似乎仅对化疗有响应，随后的每周注射纳米dxr进一步减少到1/50以进行9周的维持治疗。与游离[低]dxr相比，该方案显著减少了lsc，同时也促进了hspc的显著恢复(图5d)。值得注意的是，中位生存期延长至139天，大多数小鼠只有在停止维持[低]纳米dxr后才死亡(图5e)。在化疗治疗后存活7个月以上的小鼠最多只显示微量水平的原始细胞和具有正常水平hspc的lsc(图5f)。如图5a所示，通过将来自[低]纳米dxr治疗的小鼠的骨髓移植到nsg受体中来测试致瘤性lsc。受体表现出与游离[低]dxr治疗的小鼠受体相似的存活率和甚至更低数量的lsc(图13)。总之，这些数据首先显示了功能性lsc是通过化疗和[低]dxr差异化靶向的，其中化疗活化lsc，同时[低]dxr抑制肿瘤发生测定中的lsc(图5a-b)。其次，这种结合疗法对于大幅提高白血病小鼠的存活率是必要的，因为化疗可以消除原始细胞，而[低]dxr可以降低lsc频率并防止由此产生的化疗抗性lsc扩增(图5c)。最后，化疗结合使用[低]纳米dxr的维持治疗可以大大提高长期存活率(图5e)。

讨论

致瘤性细胞不仅能抵抗标准化疗，而且实际上也能扩大对其的响应，这就说明为何抗癌治疗往往失败。靶向csc/lsc在理想情况下对正常干/祖细胞的影响最小，对未来的成功至关重要。出乎意料的是，本公开提供了可用于此目的的长期使用的化疗剂。dxr作为高浓度的拓扑异构酶ii抑制剂起作用并表现出最广泛的已知抗癌活性，但不清楚为何dxr在许多癌症中具有比其它拓扑异构酶ii抑制剂更高的功效。然而，用作dna损伤剂的抗癌药物可能具有无法预料的效果。拓扑替康是另一种拓扑异构酶ii抑制剂，当以相对较低的剂量使用时，发现ube3a基因的正常休眠父本等位基因没有沉默。当母本等位基因发生突变时，ube3a负责安格曼(angelman)综合征，所以通常正常的父本等位基因的表观抑制可能会减轻这种综合征。已知dxr通过从开放染色质中去除组蛋白来影响表观遗传状态，其发生与其诱导dna断裂的能力无关，并且显示出改变癌细胞的转录组；然而，这些影响的后果在很大程度上是未知的。尽管半个多世纪以来一直使用化疗药物，但技术熟练的工匠仍然不完全理解其作用机制或为何它们优先杀死癌细胞。正如目前的研究表明，理解这些影响和使用基于这种理解的药物将允许更合理的治疗癌症。关于dxr，尽管其成功，但其使用受到严重的心脏毒性，需要最大的生命期剂量和其它细胞毒性作用的限制。复发在t-all中很常见，其伴有预后不良，且通过加强化疗无法改善。pi3k活化突变在all中很常见，而复发的儿科患者往往显示wnt通路的额外活化，通常由表观遗传改变引起。因此，将dxr重新用作对化疗抗性细胞的靶向疗法可以避免严重的毒性并减少复发。dxr纳米颗粒由于其缓慢持续的释放和组织分布而特别适合于这种效果，已显示其对肿瘤优先，但在心脏和其它重要器官中明显减少(tran，th等，longcirculatingself-assemblednanoparticlesfromcholesterol-containingbrush-likeblockcopolymersforimproveddrugdeliverytotumors.biomacromolecules15,4363-4375(2014)，其通过引用并入本文)。

考虑到wnt/β-链蛋白和pi3k/akt协同信号传导在正常hsc自我更新中的关键作用，预期抑制ps⁵⁵²-β-链蛋白对正常hsc具有不利影响，并且预期需要用hsc移植挽救治疗的小鼠，可能使用已建立的体外hsc扩增系统。出乎意料的是，[低]dxr治疗允许甚至促进hspc的回收。当白化受到特定理论的约束时，类似于癌基因成瘾的现象，lsc可能对β-cat/akt自我更新机制“上瘾”，而hspc可能在使用替代通路时更加灵活。lsc和原始细胞的消除减少了竞争，允许随后hspc的恢复。由于lsc与hspc竞争生态位(niche)占位，特别是消除lsc有助于hspc的净回收。所公开的模型系统对于关于lsc和hspc之间的这种动态竞争的未来研究是理想的，特别是关于响应于不同治疗的正常和致瘤性生态位。

在癌症干细胞和正常干细胞中发现的相似基因表达特征可预测临床结果。临床证据还表明，具有自我更新能力的罕见细胞通常能够在化疗治疗中存活，表明自我更新可能是一种常见的核心特性，如果有靶向性的话，会导致更持久的治愈。本公开支持这种潜力，并展示化疗抗性lsc、大量白血病细胞和hspc之间的动态关系。如果转化为临床，将肿瘤发生细胞从其大部分后代中分开靶向并优先于正常的干/祖细胞能够显著改善患者结果。

实施例6

用于这里描述研究的白血病小鼠可由如下获得。从未诱导的scl-cre阳性pten：β-catact小鼠中分离全骨髓，并与等量的同类系野生型骨髓混合，并移植到经照射的(10gy)ptprc受体小鼠中。移植4-6周后，将受体小鼠置于他莫昔芬饲料上2周以诱导重组，这导致所有受体小鼠诱导后7周内白血病的发展。诱导后7周内，向白血病小鼠静脉内(通过尾静脉)注射0.5mg/kg多柔比星(‘[低]doxo’)5次剂量(连续每天一次)或给予单次注射多柔比星纳米颗粒(仅第1天)(单次0.8mg/kg注射)('[低]纳米doxo')或单次注射(仅第1天)(单次0.8mg/kg注射)。同时使用化疗(每天一次，连续5天)，其由以217mg/kg静脉内注射的奈拉滨和10mg/kg的地塞米松(腹膜内注射)构成。所有药物溶解在45％(2-羟丙基)-β-环糊精(hbc)中。将含有或不含奈拉滨(selleck)的盐酸多柔比星(sigma；d1515)溶解于hbc(43.4mg/ml奈拉滨+/-0.1mg/ml多柔比星)中，并根据下式施用iv：体重(g)×5＝注射体积(μl)。将地塞米松(biovision)以2.5mg/ml溶解于hbc中并按照下式注射ip：体重(g)×4＝注射体积(μl)。

多柔比星纳米颗粒具有138nm的平均粒径。载药量高达22.1％(w/w)。dox在pbs中的释放稳定在每天大约2％，12天内释放24％。与游离dox相比，纳米颗粒显著增加了血液中药物的循环时间。在静脉内注射24小时后，与心脏、肺、肾、脾脏和肝中的游离dox相比，在患有皮下肿瘤小鼠中基于纳米颗粒的dox药代动力学和生物分布显示具有更高的血液浓度和更低的积累，表明更大的安全性(图15a-b)。根据心脏肌钙蛋白i水平和组织学检测心脏毒性。在用多柔比星纳米颗粒(每周一次5mg/kg)治疗2个月后没有发现心脏损伤，而1mg/kg(8个剂量)和高单剂量的游离dox显示出心脏毒性(图15-c)。

图14显示与相比，多柔比星纳米颗粒在消除白血病干细胞和促进正常的造血干/祖细胞恢复方面具有增强的有效性。尽管细胞毒性化疗诱导lsc扩增，但是每天施用低剂量多柔比星共5天可防止这种扩增，甚至有助于hspc的恢复。多柔比星纳米颗粒与游离多柔比星相比可以进一步减少lsc，并有效地消除这些群体。在第1天仅通过单次低剂量注射即可获得这种效果。在预防化疗引起的lsc扩增或促进hspc恢复方面不如多柔比星纳米颗粒有效。

可以理解的是，这里所描述的实施例和实施方式仅用于说明的目的，本领域的技术人员将会想到对其进行各种修改或改变，并且这将被包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文。