本发明总体上涉及神经损伤领域。本发明的特征在于一种药物组合，该药物组合促进神经再生和针对内质网(er)应激的神经保护，并且可用于治疗和/或预防神经学损伤，特别是周围神经损伤。本发明还涉及用于治疗和/或预防神经学损伤特别是周围神经损伤和脑神经损伤的药物组合物和方法。
背景技术：
周围神经系统(pns)的创伤性损伤是世界范围内残疾的主要原因，占和平时期i级创伤中心案例的2％至3％且战时更多。由于这种高发生率带来了相当大的经济和社会影响，过去几年中，这一领域的关注一直在稳步增长。
周围神经是广泛的神经网络，是大脑和脊髓与身体其他部位交流的工具。神经分别是到感觉神经元或来自运动神经元的一束封闭的传入和传出纤维。神经是脆弱的，并且容易损伤。当这些神经中的一个受到损伤或创伤时，手术治疗有时是唯一的补救措施。存在影响一个神经或许多神经的超过一百种周围神经障碍。一些是其他疾病像糖尿病神经问题和其他的像在病毒感染后发生的自身免疫性疾病格林-巴利综合征的结果。还有其他的是来自神经压迫，像腕管综合征和胸廓出口综合征，或者在损伤后出现的如复杂的局部疼痛综合征和臂丛神经损伤。
由于椎间盘突出和肿瘤，如神经纤维瘤或脑膜瘤，可导致脊神经根受压迫。涉及上肢牵引或强烈颈侧偏的高能量事故可能导致臂丛神经损害。此类损伤导致多种感觉和运动功能障碍。在这种情况下，脊柱根部可能会被撕脱、粉碎和牵引，导致复杂的伴有炎症反应的损害、横断神经的沃勒变性，并可能导致逆行性神经变性，但有时由于上皮(epi)和周围神经结缔组织仍保留，损伤程度被低估。因此，也在腹根粉碎(如由椎间盘突出产生的)后预期神经元损失，这可能反过来降低某些外科手术如神经移植和端侧神经缝合术的成功。远端神经压迫(例如腕管综合征后)虽然很少导致逆行性神经变性，但轴突受损，并且较长时间的压迫可能最终危及整个神经系统、神经元功能和存活。
在造成周围神经纤维破裂的损伤后，轴突变性通过两种不同的机制发生：向远端轴突发生的沃勒或直行性变性，以及向近端细胞体进行的逆行性变性，而沃勒变性试图建立有利于远侧轴突再生的环境，逆行性变性促进邻近节段的一系列表型变化和神经元反应的启动。轴突分解立即通过受损的轴突膜产生ca2+和camp水平的迅速提高，逆向运输的靶标衍生神经营养因子的剥夺以及生存所必需的突触连接性和神经元活性的损失。通过膜泄漏破坏严格的离子浓度梯度可导致几个级联信号传导通路的激活。
与根性撕脱(ra)后mn的广泛损失形成对比，远端神经轴突切开术(da)将在周围神经系统和其中枢神经系统神经纤维的部分中导致顺行轴突变性，但很少导致神经元死亡(参见valero-cabréa,peripheralandspinalmotorreorganizationafternerveinjuryandrepair[神经损伤和修复后的周围和脊柱运动重组],jneurotrauma.[神经创伤杂志]2004)。为了阐明这种神经变性过程，在过去几年中，我们收集了越来越多的证据显示ra后激活的分子事件，尽管与术后最初几天(dpo)da后触发的分子事件类似，但它们在第7dpo开始发生分歧，其特征在于对促生存机制的不平衡应答，如对er应激或自体吞噬的应答(参见penasc,autophagy,andbipleveldecreaseareearlykeyeventsinretrogradedegenerationofmotoneurons[自体吞噬和bip水平下降是运动神经元逆行性变性的早期关键事件],celldeathdiffer.[细胞死亡与分化]2011)。
人类神经元，并且更确切地说运动神经元(mn)固有地具有再生能力的事实表明，增强或优化这种先天能力的疗法可能是适用的。神经损伤后mn存活的神经保护策略在临床实践中并不存在。已经在实验模型中测试了几种分子，其总结在表1中。两种主要模型是最知名的并且被使用：脊神经或根性撕脱(有或没有再植)，以及面部神经撕脱。在本表中，药物是以如下方式组织，使得对于每个类型的模型，具有较高的报告的神经保护作用的那些处于顶端。尽管利鲁唑在再植模型中具有观察到的最大神经保护作用，但在没有再植的根性撕脱模型中，其显示无神经保护作用(参见chewdj,theeffectsofminocyclineorriluzoletreatmentonspinalrootavulsion-inducedpaininadultrats[米诺环素或利鲁唑治疗对成年大鼠脊神经根性撕脱诱导的疼痛的作用],jpain.[疼痛杂志]2014)。发现的最好的神经保护剂是pre084，诱导约50％至60％的mn存活率(参见penas,c.等人sigmareceptoragonist2-(4-morpholinethyl)1phenylcyclohexanecarboxylate(pre084)increasesgdnfandbipexpressionandpromotesneuroprotectionafterrootavulsioninjury[σ受体激动剂2-(4-吗啉乙基)1苯基环己烷羧酸(pre084)增加gdnf和bip表达且促进根性撕脱损伤后的神经保护].j.neurotrauma[神经创伤杂志],2011,28,831–840)。在面部神经模型中，维生素e以及多种神经营养因子的组合产生的面部mn的神经保护高达80％，但最近导致了临床上的附带健康问题。
表1.在神经撕脱的实验模型中具有一些神经保护作用的药物
(1)请注意，在撕脱的瞬间再植给予神经保护方面的额外益处，但在临床情况下，由于损伤后需要患者稳定，因此不可能这样执行。
除了mn神经保护外，为了重建轴突损伤引起的神经功能损失，应考虑两个其他因素：没有治疗的神经性疼痛的预防和轴突再生的促进。神经再生由神经组织、细胞或细胞产物通过新神经元、神经胶质、轴突、髓磷脂或突触的生成而再生长或修复组成。
确定这一过程的结果的关键机制还没有充分表征。然而，在需要的几个因素中，再生和功能性神经再支配的成功取决于受损神经元存活和转变为再生表型的能力(参见navarrox,neuralplasticityafterperipheralnerveinjuryandregeneration[周围神经损伤和再生后的神经可塑性],progneurobiol.[神经生物学进展]2007)。
由于介导细胞死亡及其后续再生的众多生理途径，变得越来越清楚的是需要多靶标多药理学研究来与不同的靶标相互作用并修饰不同的分子途径。已在其他病理如哮喘(氟替卡松和丙酸酯/沙美特罗)、高脂血症(洛伐他汀和缓释烟酸组合)、hiv-1(azt-3tc)或癌症中显示多成分疗法和多靶向药物的临床成功。
大量神经障碍被认为与运动神经元损伤有关，并且特别是与er应激有关。er应激是由未折叠的蛋白质聚集物的积累或过量的蛋白质运输诱导的，导致蛋白质合成机构的超载。这些聚集物的积累通过各种机制如perk、ire-1和atf-6导致细胞死亡。本组中的疾病和障碍可能包括传出纤维损害，如多发性神经病变、神经卡压、神经压迫综合征(压迫性神经病)和神经创伤；脊髓后根(背根)损害，像神经根病变，椎间盘突出症，肿瘤和放射疗法；脊髓后根(腹根)运动神经元损害，包括急性脊髓灰质炎；以及累及下mn的疾病，像周围神经病变、肌萎缩侧索硬化(als)、脊髓性肌萎缩(sma)(参见montaguek,endoplasmicreticulumstressinspinalandbulbarmuscularatrophy:apotentialtargetfortherapy[脊髓延髓肌肉萎缩症的内质网应激：疗法的潜在靶标],brain.[脑]2014)。此外，促再生治疗可用于预防植入手术假体后接着发生的炎性和神经变性过程。
此外，er应激与广泛的神经变性疾病有关(参见hetzc,disturbanceofendoplasmicreticulumproteostasisinneurodegenerativediseases[神经退行性疾病中内质网蛋白质稳态的扰动],natrevneurosci.[神经系统科学自然评论]2014)，如肌萎缩侧索硬化和与运动神经元死亡无关的其他疾病：亨廷顿氏病、克雅氏病、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆症、帕金森病等。
需要新的对神经学损伤(如周围神经损伤)的治疗。具体而言，没有促进神经再生和针对内质网(er)应激的神经保护的治疗。
技术实现要素：
诸位发明人已经发现阿坎酸和利巴韦林的组合(c1)能够在体内促进使神经元变性的神经保护。在体外，c1治疗能够促进针对er应激的神经保护。此外，c1治疗能够促进神经元再生特征，并通过减少神经胶质增生来减少神经组织的炎症。诸位发明人还发现参与c1作用机制的组分之一是通过激活瑟土因(sirtuin)1(sirt1)。瑟土因已被证明参与促进寿命延长，并且增加其活性可在几种病理如代谢紊乱、神经变性和炎症之前提供保护。
因此，本发明涉及阿坎酸和利巴韦林的组合，涉及用于治疗和/或预防神经学损伤的药物组合物、试剂盒和方法，该神经学损伤特别是周围神经损害和传出/传入纤维的其他损害，如多发性神经病变、神经卡压和神经压迫综合征(如腕管综合征、感觉异常性股痛、胸廓出口综合征、尺神经卡压、压迫性神经病)和神经创伤(如臂丛神经损伤、足下垂损伤、脊髓副神经损伤、创伤性神经损伤、复杂的局部疼痛综合征)；脊髓后根(背根)损害，像神经根病变、椎间盘突出症，或由肿瘤(如恶性神经鞘瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤)和放射疗法引起的；累及脑神经(嗅神经、动眼神经、滑车神经、外展神经、面部神经、前庭蜗神经、副神经和舌下神经、三叉神经和神经节、视神经和视交叉)的损害或创伤性脑神经病变；脊髓后根(腹根)运动神经元疾病(包括急性脊髓灰质炎)或运动轴突疾病如格林-巴利综合征；以及累及下运动神经元的疾病，像周围神经病变、肌萎缩侧索硬化(als)、脊髓性肌萎缩(sma)；急性和慢性炎性疼痛、神经性疼痛、神经炎、幻肢痛、神经根病变、创伤性损伤。此外，新的组合对于预防手术假体植入后接着发生的炎性及其相关神经变性过程或疼痛状态也是有用的。
在第一方面，本发明涉及包括阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合。
在第二方面，本发明涉及包括包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合的药物组合物。
在第三方面，本发明涉及包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合，或涉及包含用于医学中的所述组合的药物组合物。
在第四方面，本发明涉及包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合，或涉及包含所述组合的药物组合物，其用于治疗和/或预防神经学损伤。
包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合特别适合于治疗和/或预防神经学损伤，特别是周围神经损害和传出/传入纤维的其他损害，如多发性神经病变、神经卡压和神经压迫综合征(如腕管综合征、感觉异常性股痛、胸廓出口综合征、尺神经卡压、压迫性神经病)和神经创伤(如臂丛神经损伤、足下垂损伤、脊髓副神经损伤、创伤性神经损伤、复杂的局部疼痛综合征)；脊髓后根(背根)损害，像神经根病变、椎间盘突出症，或由肿瘤(如恶性神经鞘瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤)和放射疗法引起的；累及脑神经(嗅神经、动眼神经、滑车神经、外展神经、面部神经、前庭蜗神经、副神经和舌下神经、三叉神经和神经节、视神经和视交叉)的损害或创伤性脑神经病变；脊髓后根(腹根)运动神经元疾病(包括急性脊髓灰质炎)或运动轴突疾病如格林-巴利综合征；以及累及下运动神经元的疾病，像周围神经病变、肌萎缩侧索硬化(als)、脊髓性肌萎缩(sma)；急性和慢性炎性疼痛、神经性疼痛、神经炎、幻肢痛、神经根病变、创伤性损伤。此外，本发明的组合也可用于预防植入手术假体后接着发生的炎性和神经变性过程。
在第五方面，本发明涉及包括包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合的试剂盒，其中阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐被布置于分开的容器中。
附图说明
图1.c1促进体内神经保护。顶图，在随后的代表性显微镜照片中分析的取景同侧腹角的脊髓图。假手术对照的荧光尼氏染色的脊髓腹角或l4-l5水平的同侧损害部位的照片。将大鼠在其右侧撕脱并且用运载体acsf，1.7μg/kg/天pre084与组合c1＝96μg/kg/天阿坎酸钙(相当于86.9μg/kg/天游离阿坎酸)+0.48μg/kg/天利巴韦林进行鞘内治疗。底图，损伤后21天后，在具有或不具有分别治疗的情况下，同侧的存活运动神经元的数目相对于对侧非损伤侧的相对百分比的平均值+/-sem的条形图。(对于假手术，n＝3，pre084，对于受损伤的，n＝6；对于其他组，n＝4，anova，相对于运载体，bonferroni事后检验*p<0.05)。比例尺＝100μm。
图2.c1减少中枢神经系统处的神经胶质增生。左图，在l4-l5级同侧损害部位脊髓的荧光标记的星形胶质细胞(顶图，gfap标记)或小神经胶质细胞的低倍和高倍放大(两个中间的图，iba1标记)或促再生轴突(底图，gap43标记)的代表性显微镜照片。将大鼠在其左部位撕脱并且用运载体acsf，1.7μg/kg/天pre084(p)，或组合c1＝96μg/kg/天阿坎酸钙(相当于86.9μg/kg/天阿坎酸游离酸)+0.48μg/kg/天利巴韦林进行鞘内治疗。右图，在不同条件下，同侧腹角处感兴趣的固定区域内免疫荧光强度(％if强度)相对于对侧的百分比平均值的条形图。(n＝3-6，anova，bonferroni事后检验*p<0.05，相对于运载体)。比例尺＝100μm。
图3.c1对面临er应激有神经保护作用，并呈现超加性作用。a.条形图显示当用c1或单独的每种药物组分以100μl终体积内剂量为0.11mm阿坎酸钙(aca)、4μm利巴韦林(rib)治疗时，非应激nsc-34细胞中细胞密度的百分比的平均值+/-sem。b.条形图显示当用不同浓度的衣霉素(tn)(100μl终体积内0.1至10μg/ml，或伴随着用1μg/mltn和运载体c1(2x，由0.11mm阿坎酸钙和:4μmrib形成)或单一药物(0.11mm阿坎酸钙或:4μmrib或10μmpre084)的疗法进行治疗时，er应激细胞的细胞存活百分比的平均值+/-sem，通过mtt测试来分析(密度测定法562nm读出)(n＝3-8，相对于运载体*p<0.05，相对于1μg/mltn，#p<0.05)。
图4.c1的计算机模拟预测作用模式揭示itgb1、kif5c和sirt1作为靶标。a.免疫染色的mn的显微镜照片，用以揭示用运载体(veh)或c1(c，对侧，i，同侧)治疗的受损伤动物的l4-l5脊髓腹角中用绿色荧光尼式复染的这些靶标中每个的存在。底图，每个条件下侧向灰质中感兴趣的预定区域(roi)内对侧和同侧之间的免疫荧光强度比的平均值的条形图。对于sirt1分析，选择mn核作为roi以比较运载体和c1治疗的动物的同侧的免疫荧光强度(％if强度)(n＝4只动物，5mn/切片，3个切片，*p<0.05，比例尺＝50μm)。b.在不同条件下治疗的动物腹角处的轴突trak中dctn1染色的图像。底图，同侧和对侧之间的免疫荧光强度比率(左图)或每侧roi内积分密度(intdens)(右图)的条形图，以显示c1针对特定病理状态上的分析效果的特异性。
图5.c1神经保护由sirt1激活来介导。尼式染色腹角的代表性显微镜照片(左图)和直方图(右图)，显示了用亚精胺(s)或ex-527(有或没有c1)进行的不同治疗后mn存活的百分比的平均值+/-sem(n＝4，anova，相对于未治疗的，bonferroni事后检验*p<0.05，相对于veh#p<0.05，相对于c1+ex527$p<0.05，*p<0.05)。比例尺＝100μm。
图6.c1加速神经再生，并改善肌肉神经再支配和功能恢复。(a)在用运载体(veh)或c1治疗的动物的坐骨神经粉碎后，来自同侧腓肠肌和足底肌的复合动作电位(cmap)的振幅均值(n＝5，anova，相对于对veh，bonferroni事后检验*p<0.05)。右侧，代表性的记录。(b)在不同时间点在足底肌处呈现神经再支配的电生理学证据的经治疗的动物的百分比的直方图(c)由用运载体(veh)或c1治疗的坐骨神经粉碎的动物的行走轨迹分析获得的坐骨神经功能指数(sfi)的绘图。右图，在损伤后35天(dpi)获得的来自同侧和对侧爪的代表性足迹。(d)显示足底肌处的神经再支配的运动终板的百分比的条形图；以及神经再支配的神经肌肉接合处的代表性图片(右)，其显示针对nf200免疫染色的神经纤维(红色)和用金环蛇毒素标记的终板(绿色)。(e)腹角处脊髓mn的显微镜照片，显示在损伤后3周，由于神经粉碎，没有细胞死亡的迹象。
具体实施方式
组合
在第一方面，本发明涉及包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合。在本发明的上下文中，此组合也被指定为“c1”。
阿坎酸(也被称为n-乙酰牛磺酸)用于指定化合物3-乙酰氨基丙烷-1-磺酸，并具有以下化学结构
目前，它在名称
利巴韦林用于指定化合物1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)氧杂戊环-2-基]-1h-1,2,4-三唑-3-甲酰胺，并且具有以下化学结构
术语“组合”或“组合产品”是指1或2种组合物的组，其中上述产品阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐分布在该1或2种组合物中，并且其中该1或2种组合物中的每一种包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐中的至少一种。除其他之外，组合的实例是：
-包括第一组合物和第二组合物的组合，第一组合物包含阿坎酸或其药学上可接受的盐，第二组合物包含利巴韦林或其药学上可接受的盐；以及
-包括如下组合物的组合，该组合物包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐。
在优选的实施例中，阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐形成相同组合物的部分。
在另一个实施例中，阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐形成不同组合物的部分。
术语“药学上可接受的盐”包括通常用于形成金属盐并形成游离酸或游离碱的加成盐的盐。盐的性质不是关键性的，只要它是药学上可接受的。合适的药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸或有机酸制备。此类无机酸的实例是盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸以及磷酸。适当的有机酸可选自脂肪族、脂环族、芳香族、芳基脂肪族、杂环、羧酸和磺酸类的有机酸，其实例为甲酸、乙酸、己二酸、丁酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、氨茴酸、甲磺酸(mesylic)、4-羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、亚甲基双羟萘酸(embonic)(扑酸(pamoic))、甲烷磺酸、乙烷磺酸、乙二磺酸、苯磺酸、泛酸、2-羟基乙烷磺酸、甲苯磺酸、磺胺酸、环己基氨基磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、二葡糖酸、环戊丙酸、十二烷基磺酸、葡庚糖酸、甘油膦酸、庚酸、己酸、2-羟基乙烷磺酸、烟酸、2-萘磺酸、草酸、棕榈酸、果胶酸、过硫酸、2-苯基丙酸、苦味酸、特戊丙酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、甲磺酸、十一烷酸、硬脂酸、藻酸、[β]-羟基丁酸、水杨酸、粘酸和半乳糖醛酸。合适的药学上可接受的碱加成盐包括金属盐，例如由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制成的盐；或由有机碱(包括伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺，包括环胺)制备的盐，如咖啡因、精氨酸、二乙胺、n-乙基哌啶、组氨酸、葡糖胺、异丙胺、赖氨酸、吗啉、n-乙基吗啉、哌嗪、哌啶、三乙胺、三甲胺。所有这些盐可以通过常规手段由本发明的相应化合物通过例如使适当的酸或碱与本发明的化合物反应来制备。当碱性基团和酸性基团存在于同一分子中时，本发明的化合物也可以形成内盐。
优选的阿坎酸的药学上可接受的盐是具有以下化学式的阿坎酸的钙盐(也称为阿坎酸钙)：
包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合可以使用范围如下的重量比的阿坎酸或其药学上可接受的盐:利巴韦林或其药学上可接受的盐来配制，例如按重量计从5000:1至1:1的阿坎酸或其药学上可接受的盐:巴韦林或其药学上可接受的盐，优选从500:1至1:1，更优选从50:1至1:1，甚至更优选从10:1至1:1，优选从5:1至1:1，最优选从50:1至30:1。在优选的实施例中，阿坎酸或其药学上可接受的盐:利巴韦林或其药学上可接受的盐的重量比为从4100:1至40:1。在具体的实施例中，该重量比选自下组，该组由以下比例组成：从4100:1至4000:1、从410:1至400:1、从190:1至170:1、从41:1至40:1和从4.1:1至4.0:1，优选地重量比为从41:1至40:1。
在本发明上下文中，除非另有说明，否则本文所述组合的组分的比例和量指处于其游离形式的阿坎酸和/或利巴韦林的当量，即，不对成盐反离子进行计数，即使所述化合物在组合中以药学上可接受的盐的形式存在。例如，当定义在包含作为钙盐的所述化合物(即阿坎酸钙)的组合中阿坎酸的量或比例时，所述量或比例是指该组合中存在的阿坎酸游离酸的当量。
该组合的医疗用途
本申请的实例显示，本发明的组合对运动神经元具有意想不到的神经保护和神经再生作用，在轴突损伤后减少中枢神经系统的炎性相关状态，并促进促再生神经元表型的出现。
因此，如上所述，本发明的包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合可用于治疗和/或预防选自下组的障碍中的神经学损伤，该组由以下组成：传出/传入纤维损害、脊髓或运动轴突的后根和腹根损害、和累及下运动神经元的疾病以及与er应激相关的其他病症。
因此，在一个方面，本发明涉及如上所述的包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合，其用作药物。
在另一方面，本发明涉及如上所述的包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合用于制造药物的用途。
在另一方面，本发明涉及如上定义的包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合，其用于治疗和/或预防神经学损伤。
如本文所用，术语“神经学损伤”指神经系统的损伤，特别是运动神经元的损伤。优选地，“神经学损伤”是指周围神经损害以及传出和传入纤维的其他损害，如多发性神经病变、神经卡压和神经压迫综合征(如腕管综合征、感觉异常性股痛、胸廓出口综合征、尺神经卡压、压迫性神经病)和神经创伤(如臂丛神经损伤、足下垂损伤、脊髓副神经损伤、创伤性神经损伤、复杂的局部疼痛综合征)；脊髓后根(背根)损害，像神经根病变、椎间盘突出症、肿瘤(如恶性神经鞘瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤)和放射疗法；累及脑神经(嗅神经、动眼神经、滑车神经、外展神经、面部神经、前庭蜗神经、副神经和舌下神经、三叉神经和神经节、视神经和视交叉)的损害或创伤性脑神经病变；脊髓后根(腹根)运动神经元疾病(包括急性脊髓灰质炎)或运动轴突疾病如格林-巴利综合征；以及累及下运动神经元的疾病，像周围神经病变、肌萎缩侧索硬化(als)、脊髓性肌萎缩(sma)；急性和慢性炎性疼痛、神经性疼痛、神经炎、幻肢痛、神经根病变、创伤性损伤。术语“神经学损伤”还指由在植入手术假体后接着发生的神经变性过程引起的神经损伤。
本发明的另一方面涉及如上定义的包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合在制造用于治疗和/或预防神经学损伤的药物中的用途，特别地该神经学损伤是周围神经损害以及传出和传入纤维的其他损害，如多发性神经病变、神经卡压和神经压迫综合征(如腕管综合征、感觉异常性股痛、胸廓出口综合征、尺神经卡压、压迫性神经病)和神经创伤(如臂丛神经损伤、足下垂损伤、脊髓副神经损伤、创伤性神经损伤、复杂的局部疼痛综合征)；脊髓后根(背根)损害，像神经根病变、椎间盘突出症、肿瘤(如恶性神经鞘瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤)和放射疗法；累及脑神经(嗅神经、动眼神经、滑车神经、外展神经、面部神经、前庭蜗神经、副神经和舌下神经、三叉神经和神经节、视神经和视交叉)的损害或创伤性脑神经病变；脊髓后根(腹根)运动神经元疾病(包括急性脊髓灰质炎)或运动轴突疾病如格林-巴利综合征；以及累及下运动神经元的疾病，像周围神经病变、肌萎缩侧索硬化(als)、脊髓性肌萎缩(sma)；急性和慢性炎性疼痛、神经性疼痛、神经炎、幻肢痛、神经根病变、创伤性损伤。此外，该组合也可用于预防植入手术假体后接着发生的炎性和神经变性过程。
另一方面涉及在有需要的受试者中治疗和/或预防神经学损伤的方法，特别地该神经学损伤是周围神经损害以及传出和传入纤维的其他损害，如多发性神经病变、神经卡压和神经压迫综合征(如腕管综合征、感觉异常性股痛、胸廓出口综合征、尺神经卡压、压迫性神经病)和神经创伤(如臂丛神经损伤、足下垂损伤、脊髓副神经损伤、创伤性神经损伤、复杂的局部疼痛综合征)；脊髓后根(背根)损害，像神经根病变、椎间盘突出症、肿瘤(如恶性神经鞘瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤)和放射疗法；累及脑神经(嗅神经、动眼神经、滑车神经、外展神经、面部神经、前庭蜗神经、副神经和舌下神经、三叉神经和神经节、视神经和视交叉)的损害或创伤性脑神经病变；脊髓后根(腹根)运动神经元疾病(包括急性脊髓灰质炎)或运动轴突疾病如格林-巴利综合征；以及累及下运动神经元的疾病，像周围神经病变、肌萎缩侧索硬化(als)、脊髓性肌萎缩(sma)；急性和慢性炎性疼痛、神经性疼痛、神经炎、幻肢痛、神经根病变、创伤性损伤，该方法包括给予治疗有效量的如上定义的包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合。此外，该组合也可用于预防植入手术假体后接着发生的炎性和神经变性过程。
在上述任何方面的具体实施例中，该临床病症是创伤性神经损伤，优选周围神经损伤。
在另一个实施例中，本组合还可以与其他类型的疗法一起使用，用于治疗和/或预防传出和传入纤维的其他损害，如多发性神经病变、神经卡压和神经压迫综合征(如腕管综合征、感觉异常性股痛、胸廓出口综合征、尺神经卡压、压迫性神经病)和神经创伤(如臂丛神经损伤、足下垂损伤、脊髓副神经损伤、创伤性神经损伤、复杂的局部疼痛综合征)；脊髓后根(背根)损害，像神经根病变、椎间盘突出症、肿瘤(如恶性神经鞘瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤)和放射疗法；累及脑神经(嗅神经、动眼神经、滑车神经、外展神经、面部神经、前庭蜗神经、副神经和舌下神经、三叉神经和神经节、视神经和视交叉)的损害或创伤性脑神经病变；脊髓后根(腹根)运动神经元疾病(包括急性脊髓灰质炎)或运动轴突疾病如格林-巴利综合征；以及累及下运动神经元的疾病，像周围神经病变、肌萎缩侧索硬化(als)、脊髓性肌萎缩(sma)；急性和慢性炎性疼痛、神经性疼痛、神经炎、幻肢痛、神经根病变、创伤性损伤，并且用于预防在植入手术假体后接着发生的炎性和神经变性过程。
在另一个实施例中，本发明组合还可以与其他药物组合使用或给予，以用于治疗和/或预防创伤性神经损伤，优选周围神经损伤。
如本文所用，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善疾病或障碍的进展、严重性和/或持续时间，或改善疾病或障碍有关的一个或多个症状(优选一个或多个可辨别症状)。
如本文所用，术语“预防(prevent、prevention和preventing)”是指获得或发展给定疾病或障碍的风险的降低，或者复发或疾病或障碍的减少或抑制。
如本文所用，术语“受试者”、“患者”可互换地使用。术语“受试者”和“患者”是指动物(例如，鸟，如鸡、鹌鹑或火鸡，或哺乳动物)，优选哺乳动物，包括非灵长类(例如母牛、猪、马、绵羊、兔、豚鼠、大鼠、猫、狗和小鼠)和灵长类动物(例如猴子、黑猩猩和人类)，并且更优选是人类。在一个实施例中，受试者是非人类动物，如农场动物(例如马、母牛、猪或绵羊)或宠物(例如狗、猫、豚鼠或兔)。在另一个实施例中，该受试者是人类。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指按适用于任何医学治疗的合理利益/风险比，足以减少或改善神经学损伤的严重性、持续时间、进展或发作的本发明组合的量，特别地该神经学损伤是周围神经损害以及传出和传入纤维的其他损害，如多发性神经病变、神经卡压和神经压迫综合征(如腕管综合征、感觉异常性股痛、胸廓出口综合征、尺神经卡压、压迫性神经病)和神经创伤(如臂丛神经损伤、足下垂损伤、脊髓副神经损伤、创伤性神经损伤、复杂的局部疼痛综合征)；脊髓后根(背根)损害，像神经根病变、椎间盘突出症、肿瘤(如恶性神经鞘瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤)和放射疗法；累及脑神经(嗅神经、动眼神经、滑车神经、外展神经、面部神经、前庭蜗神经、副神经和舌下神经、三叉神经和神经节、视神经和视交叉)的损害或创伤性脑神经病变；脊髓后根(腹根)运动神经元疾病(包括急性脊髓灰质炎)或运动轴突疾病如格林-巴利综合征；以及累及下运动神经元的疾病，像周围神经病变、肌萎缩侧索硬化(als)、脊髓性肌萎缩(sma)；急性和慢性炎性疼痛、神经性疼痛、神经炎、幻肢痛、神经根病变、创伤性损伤，并且该量用于预防在植入手术假体后接着发生的炎性和神经变性过程，或预防上述疾病的进展，引起上述疾病的消退，预防与上述疾病相关的症状的复发、发展、发作或进展，或者增强或改进另一种疗法的一个或多个预防或治疗效果。对于任何具体患者的特定治疗有效的剂量水平将会取决于多种因素，包括：所治疗的障碍和障碍的严重程度；所使用的特定化合物的活性；所使用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别以及饮食；给药时间、给药途径以及所使用的特定化合物的排泄速率；治疗持续时间；与所使用的特定化合物组合或同时使用的药物；以及在医学领域中熟知的类似因素。
在具体实施例中，本发明的包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合按以下使用：剂量为从0.0002mg至152500mg的阿坎酸或其药学上可接受的盐/m2身体/天，优选0.0002mg/m2/天至8000mg/m2/天的阿坎酸或其药学上可接受的盐，和剂量为从0.0000003mg/m2/天至110400mg/m2/天的利巴韦林或其药学上可接受的盐，优选0.0000003mg/m2/天至6000mg/m2/天的利巴韦林或其药学上可接受的盐，其中化合物的量是相对于该药物的游离形式表示，即游离阿坎酸或游离利巴韦林。
优选地，本发明的包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合按以下使用：剂量为从0.014mg/m2/天至1500mg/m2/天的阿坎酸或其药学上可接受的盐和剂量为从0.000349mg/m2/天至1100mg/m2/天的利巴韦林或其药学上可接受的盐，特别地用于肠胃外给药；优选地从0.014mg/m2/天至1.5mg/m2/天的阿坎酸或其药学上可接受的盐和剂量为从0.000349mg/m2/天至0.0349mg/m2/天的利巴韦林或其药学上可接受的盐，用于鞘内给药，如对脑脊液给药；优选从15mg/m2/天至1500mg/m2/天的阿坎酸或其药学上可接受的盐和剂量为从11mg/m2/天至1100mg/m2/天的利巴韦林或其药学上可接受的盐，用于静脉内、肌内、真皮内或皮下给药。优选地，本发明的包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合按以下使用：剂量为从76mg/m2/天至7600mg/m2/天的阿坎酸或其药学上可接受的盐和剂量为从55.2mg/m2/天至5520mg/m2/天的利巴韦林或其药学上可接受的盐，特别地用于口服给药。优选地，本发明的包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的组合按以下使用：剂量为从3.5mg/m2/天至152500mg/m2/天的阿坎酸或其药学上可接受的盐和剂量为从2mg/m2/天至110400mg/m2/天的利巴韦林或其药学上可接受的盐，特别地用于局部给药。
活性成分的剂量可以按mg活性成分/kg体重或按mg活性成分/平方米体表面表示。来自reagan-shaws.“dosetranslationfromanimaltohumanstudiesrevisited[回访的动物到人类研究的剂量转化]”.fasebj[美国实验生物学会联合会会志]2007,22:659-661的文章提供了用于将mg/kg转化为mg/m2的标准转换因子。
剂量(mg/kg)xkm＝剂量(mg/m2)
该文章还解释，此转换是将第一动物物种中的剂量转换为第二动物物种中的剂量(异速生长剂量转化)的基础。因此，使用下式可以将mg/kg的动物剂量(ad)转换为mg/kg的人类当量剂量(hed)：
其中每个物种的km示于表2(数据摘自reagan-shaws.“dosetranslationfromanimaltohumanstudiesrevisited[回访的动物到人类研究的剂量转化]”.fasebj[美国实验生物学会联合会会志]2007,22:659-661)。
表2.ad到hed转换的km因子
阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐可以同时、依次或分开给予。在任何这些特定给药方式中，根据本发明的组合被设计成实现同时、依次或分开给予阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐。
同时给药可以例如以包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐的一种组合物的形式发生，或者通过同时给予，即同一时间给予独立配制(即，不形成相同组合物的部分)的阿坎酸或药学上可接受的盐和阿坎酸或其药学上可接受的盐发生。
连续给药优选地意指在一个时间点给予阿坎酸或其药学上可接受的盐，并且在不同的时间点以长期交错的方式给予利巴韦林或其药学上可接受的盐。
分开给药优选地意指在不同时间点彼此独立地给予阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐。
当依次或分开给药时，阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐可以按任何顺序给予。在一个具体实施例中，阿坎酸或其药学上可接受的盐是被首先给予的。在另一个具体实施例中，利巴韦林或其药学上可接受的盐是被首先给予的。该组合中给予单独化合物之间的特定延迟时间可以延长至数天、数小时、数分钟或数秒。
在具体的实施例中，如上定义的，本发明的组合包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐，形成用于同时给予的相同组合物的部分。
在另一个具体的实施例中，如上定义的，根据本发明的组合包含阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐，其作为单独的组合物提供，优选用于同时给予。这些单独的组合物也适于依次和分开给药。
药物组合物
本发明还提供了包含本发明的组合的药物组合物，其中阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的载体一起配制在单一组合物中。该药物组合物可以专门配制用于任何医学上可接受的给药方式，意指任何产生有效水平的活性化合物而不引起临床上不可接受的副作用的方式。
在一个优选的实施例中，本发明的组合物经口服给药。其他给药方式包括局部、经颊、透皮、植入物内/植入物上、或肠胃外途径。术语“肠胃外”包括皮下、鞘内、心室内、静脉内、鼻内、眼内、肌内、腹膜内、关节内、蛛网膜下、背侧静脉丛注射(dorsalisvenousplexisinjection)或者输注或直接输注至脑脊液。本发明的药物组合物可以处于缀合物、凝胶、脂质体、微球体、纳米颗粒、载体、泵、导管、植入物、控释微芯片和类似物的形式。本发明的药物组合物可以添加到生理流体中。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指无毒的、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、封装材料或任何类型的配制助剂。可以用作药学上可接受载体材料的一些实例是糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可油和栓剂蜡；油，如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、椒揽油、玉米油和大豆油；乙二醇，例如丙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇、和磷酸盐缓冲溶液，以及其他无毒相容的润滑剂，如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和香味剂，防腐剂和抗氧化剂也可根据配方设计者的判断存在于组合物中。本发明提供了如下药物组合物，其包含与一种或多种无毒的药学上可接受的载体一起配制的本发明的化合物。本发明的用于注射的药物组合物包含药学上可接受的无菌的水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液和用于在无菌的注射溶液或分散液中重构的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或运载体的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油、1,3-丁二醇等)、其适合的混合物、植物油(如橄榄油)以及可注射有机酯(如油酸乙酯、林格氏溶液、u.s.p.和等渗氯化钠溶液)。此外，常规采用无菌的固定油作为溶剂或悬浮介质。为了这一目的，可以采用任何温和的非挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，还使用脂肪酸(如油酸)来制备注射剂。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过维持所需的粒度并且通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
这些药物组合物还可含有佐剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过各种抗细菌剂以及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸以及类似物质来确保防止微生物的作用。还可以令人希望的是包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。可通过使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长的吸收。
在一些情况下，为了延长药物的作用，通常希望减缓药物(阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐)从皮下或肌内注射的吸收。这可通过使用水溶性不佳的结晶或非晶态物质的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率进而可取决于晶体大小以及晶型。可替代地，通过将药物溶解或悬浮于油性运载体中实现肠胃外给予的药物的吸收延迟。
除了含有活性化合物(阿坎酸或其药学上可接受的盐，以及利巴韦林或其药学上可接受的盐)外，悬浮液还可以含有助悬剂，如例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxide)、膨润土(bentonite)、琼脂、黄芪胶、和其混合物。
如果希望，并且为了更有效地分布，本发明的组合中包含的阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐可以掺入缓释或靶向递送系统，如聚合物基质、脂质体和微球体。
本发明的药物组合物可以例如通过细菌截留过滤器滤过，或通过并入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，这些无菌固体组合物可以在临使用前溶解于无菌水或一些其他无菌可注射介质中。
活性化合物(阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐)还可以呈微囊化形式，如果适当的话，与如上所述的一种或多种药学上可接受的载体一起。片剂、糖衣片、胶囊、丸剂、颗粒剂以及装置的固体剂型可用包衣和外壳(如肠溶包衣、控释包衣和药物配制领域中所熟知的其他包衣)来制备。在此类固体剂型中，该活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂(例如蔗糖、乳糖或淀粉)混合在正常的情况下，此类剂型还可包括另外的不同于惰性稀释剂的物质，例如，压片润滑剂和其他压片助剂(如硬脂酸镁和微晶纤维素)。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包括缓冲剂。它们任选地可包含遮光剂，并且还可以具有这样的组合物：使得它们仅释放一种或多种活性成分，或优选地，在肠道的某一部分中以延迟的方式释放。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
通过在生物可降解的聚合物(如聚乳酸交酯-聚乙交酯)中形成药物的微胶囊化基质来制得可注射的贮库形式。取决于药物与聚合物的比率以及所使用的特定聚合物的性质，可以对药物释放的速率进行控制。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。长效可注射配制品还通过将药物包陷入与人体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
用于口服给予的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉末以及颗粒剂。在这样的固体剂型中，活性化合物是与至少一种药学上可接受的惰性载体混合，例如柠檬酸钠或磷酸钙和/或a)填充剂或增补剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和水杨酸；b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)湿润剂，例如甘油；d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、和碳酸钠；e)溶液延迟剂，例如石蜡；f)吸收加速剂，例如季铵化合物；g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂，例如高岭土和膨润土，以及i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠以及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，该剂型还可以包括缓冲剂。
一种相似类型的固体组合物还可以在使用乳糖或奶糖以及高分子量的聚乙二醇等的软和硬填充胶囊中被用作填充剂。
片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂以及颗粒剂的固体剂型可用包衣和外壳(如肠溶包衣和药物配制领域中所熟知的其他包衣)来制备。它们任选地可包含遮光剂，并且还可以具有如下组合物：使得它们仅释放一种或多种活性成分，或优选地，在肠道的某一部分中以延迟的方式释放。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
用于直肠给予的组合物优选是栓剂，其可通过将本发明的化合物与适当的非刺激性载体(例如，可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡，它们在环境温度下为固体但在体温下为液体并且因此可在直肠中融化并释放出活性化合物)相混合来制备。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物以外，液体剂型可含有在本领域中通常使用的惰性稀释剂，如例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(具体地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇酐的脂肪酸酯，以及它们的混合物。
除了惰性稀释剂，这些口服组合物还可以包含佐剂，如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂、以及芳香剂。
除了惰性稀释剂，这些口服组合物还可以包含佐剂，如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂、以及芳香剂。
本发明的化合物的局部的或经皮给予的剂型包括软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、粉末、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片。将活性组分在无菌条件下与药学上可接受的载体和任何所需要的防腐剂或缓冲液根据可能需要的进行混合。眼用配制品、滴耳剂、眼膏、粉末和溶液也被考虑在本发明的范围内。
除本发明的活性化合物之外，这些软膏剂、糊剂、霜剂以及凝胶还可以含有动物和植物脂肪、油类、蜡类、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石以及氧化锌或其混合物。
除本发明的化合物之外，粉末和喷雾剂还可以含有乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可以另外地含有常规推进剂，如氯氟烃。
本发明的化合物也可以按脂质体形式给予。如本领域中所已知，脂质体通常源自磷脂或其他脂质物质。脂质体由分散在水性介质中的单层或多层水合液体晶体形成。可以使用能够形成脂质体的任何无毒的、生理学上可接受的和可代谢的脂质。除了本发明的化合物之外，处于脂质体形式的本发明组合物还可以含有稳定剂、防腐剂等。优选的脂质是天然的和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，单独地或一起使用。
形成脂质体的方法是本领域中已知的。参见，例如prescott,ed.,methodsincellbiology,volumexiv,academicpress,newyork,n.y.,(1976),p33etseq[prescott编辑,细胞生物学方法,第xiv卷,学术出版社,纽约,纽约州,(1976),第33页以及下列等等]。
本发明的药物组合物适于与上文对于本发明的组合定义的相同的医疗用途和治疗和/或预防方法。
包含组合物的试剂盒
本发明还涉及如下试剂盒，其中该组合的单个化合物即阿坎酸或其药学上可接受的盐和利巴韦林或其药学上可接受的盐被布置于分开的容器中。
本发明还涉及如下试剂盒，其中除了该组合的化合物之外，还包括其他装置如注射装置和其他材料如药物载体。
本发明还涉及根据任何前述项的试剂盒，其进一步包括与内容物或试剂盒及其用途有关的信息，与其一体或作为一个或多个单独文件。
术语“包括/包含(comprising)”意为开放式的，包括指示的组成部分，但不排除其他要素。
给药可能包括单一每日剂量或可能适当时一些离散的分开剂量。如本文所述，给药方案还可包括给予一种或多种活性剂或包含其的组合物。给予期可能是可变的。它可能发生希望的那么长时间。
以下实例进一步说明本发明的特定实施例；然而，以下说明性实例不应理解为以任何方式限制本发明的范围。
实例
实例1
实验模型
计算机模拟、体内和体外研究了选择的包含阿坎酸钙和利巴韦林的药物组合c1对运动神经元变性的功效。
在计算机模拟中，我们进行了作用方式(moa)的研究。
根性撕脱和远端轴突切开术的表征。我们获得了与分子过程或动机相关的关键蛋白的初始列表，通过文献细查提取，这些蛋白可能参与神经元/轴突损伤后触发的应答。我们选择了与神经保护/再生或变性/疼痛有关的通路和蛋白质复合物含量高的那些。人类生物网络结合了来自从公共来源得到的定期更新的内部数据库的蛋白质之间的所有可用关系：kegg35、reactome36、intact(brooksbank等人，2003)、biogrid38、mint(pmid：22096227)。分析主要集中在人类生物网络的再生和变性周围的区域中，其中包括针对再生的3,296种蛋白质；针对变性的3,836种蛋白质，以及针对神经性疼痛的1,267种蛋白质。我们发现几种蛋白质在变性/疼痛之间重叠856，在变性/再生之间重叠2232，在再生/疼痛之间重叠858。
da(远端轴突切开术)和ra(根性撕脱)数学模型的构建。采样方法用于生成ra和da数学模型，该数学模型遵从可用的实验蛋白质组学数据和对应于关于构建的网络的可用生物学知识的限制集，连同源自drugbank，geo(pmcid：pmc3531084)的知识以及由ra和da大鼠模型产生的maldi-toff质谱数据。每个似乎合理的样品模型都是使用随机优化算法构建的。这些算法使用衍生自生物学证据的概率测量来调整网络交互类型和强度。模型比较分析用于鉴定触发变性进入再生的关键蛋白。
重定位分析。被鉴定为变性模型向再生模型逆转的关键的关键蛋白列表被用作重定位分析的起点。两个互补的策略用于生成生命系统的数学模型：人工神经网络(ann)和采样方法。ann是受监视的算法，用于鉴定药物靶标与该网络的临床要素之间的关系，其用于用drugbank中含有的有关药物和适应症的信息来训练分类器(pubmedid：18048412；pubmedid：16381955)，具有预测并对新型潜在药物评分的能力。针对具有人类生物网络中的全部靶标的那些药物，ann用以重现drugbank的适应症的准确度为98％。共筛选出产生大约1500万种二元组合的5440种药物。将组合根据其与ra的关系进行分选和选择，突出不导致神经性疼痛、高协同性且与cns/pns再生没有先前关系的安全性特征。采样方法也被用来以高能力描述以前用ann鉴定的蛋白质集合之间的所有似乎合理的关系。采样方法生成遵从上述给定限制集合的数学模型。由于限制的数目总是小于该算法所需参数的数目，因此任何由tpms建模的过程都具有不同解决方案的“群体”，它设置在106-109左右，因为估计这个区间忠实地描绘了性质。因此，模型导致占该群体大部分的“全局”预测moa和对于群体亚组更为准确的“集群”作用机制。针对参与该组合中两种药物之间的协同作用的蛋白质，基于ann预测值和从采样方法获得的moa的分析提供了归一化协同得分(se)。计算蛋白质的se，模拟不同药物剂量和药物组合混合物比例的蛋白质活化模式。这些模式用于将蛋白质行为分类为独立于药物、依赖于一种药物、加性或协同(次加性或超加性)影响。最后se说明了模型解决方案的百分比的加权平均值，该模型解决方案以加性、协同或拮抗的方式呈现受到两种药物影响的感兴趣的节点，以及两种药物对该节点的协同(而不是加性)效应。
以两步过程验证该moa。首先，我们检查了，参与moa的蛋白质彼此之间的每种关系都可以与文献进行对比。第二，我们检查了，moa总体上有意义，其特征在于与生命系统一致的通路、用于治疗的重定位药物的组合和ra的已知病理生理学。
对于体内研究，如先前描述的那样生成周围神经根性撕脱的临床前大鼠模型(ra模型)(参见penasccytoskeletalandactivity-relatedchangesinspinalmotoneuronsafterrootavulsion[根性撕脱后脊髓运动神经元的细胞骨架和活性相关变化].journalofneurotrauma[神经创伤杂志],2009)。简言之，在髂嵴级做出中线皮肤切口，鉴定右侧坐骨神经并分离出l4和l5脊神经。应用适度牵引来产生椎骨外神经根撕脱，导致一个月内约80％的受损伤mn发生逆行性变性。左侧的根保持完整，作为假手术对照。我们鞘内给予运载体(人造脑脊液(acsf)[nacl(124mm)、kcl(3mm)、nahco3(26mm)、cacl2/2h2o(2mm)、mgso4/7h2o(1mm)、kh2po4(1.25mm)和d-葡萄糖(10mm)]或用于神经保护的阳性对照药物(pre084，1-苯基环己烷羧酸酯盐酸盐，1.7μg/kg/天)、c1(阿坎酸钙96μg/kg/天(相当于86.9μg/kg/天阿坎酸游离酸)+利巴韦林0.48μg/kg/天)或单独的阿坎酸钙(96μg/kg/天)(相当于86.9μg/kg/天阿坎酸游离酸)和单独的利巴韦林(0.48μg/kg/天)。为了这个目的，我们使用可编程的微输注泵系统(iprecio，优品科技公司(primetech))以自ra后第二天起的20天内连续灌注药物到动物csf中。定义有ra的七个实验动物组：一个用c1治疗，另一个用pre084治疗(阳性对照)，另一个用单独的阿坎酸钙治疗(a)，另一个用单独的利巴韦林(b)治疗，另一个用单独的运载体治疗，另一个不治疗(对照)。pre084是已知促进神经保护的σ1亚型选择性σ受体(penasc,sigmareceptoragonist2-(4-morpholinethyl)1phenylcyclohexanecarboxylate(pre084)increasesgdnfandbipexpressionandpromotesneuroprotectionafterrootavulsioninjury[σ受体激动剂2-(4-吗啉乙基)1苯基环己烷羧酸(pre084)增加gdnf和bip表达且促进根性撕脱伤后的神经保护].j.neurotrauma[神经创伤杂志],2011)。3周后，将动物进行灌注并去除脊髓的l4-l5段，后固定并冷冻保存直至用crysotate切片。我们用荧光尼式(绿色)对脊髓切片染色，以揭示腹角的rexed层ix的αmn，由其定位、大尺寸和突出的核而识别。运动神经元(mn)计数是通过比较相同脊髓切片/动物的同侧和对侧腹角mn数目而进行。对于免疫组织化学研究，使用包括0.3％triton的标准tris缓冲盐水(tbs)中的10％不同物种血清基本上阻断含有这些脊髓切片的片，并且然后用几种标志物(包括抗gfap、抗iba1和抗gap43)的一级抗体孵育过夜。在几次洗涤并用足够的荧光二级抗体孵育后，将这些片用荧光封片剂(fluoromount)安装以进行制备用于显微镜分析。使用imagej软件的几个插件对来自显微镜的图像进行数字捕获和分析。
对于体外研究，我们用常规的基于mtt的测定评估了nsc-34运动神经元样细胞的细胞存活。nsc-34是由神经母细胞瘤与富含小鼠运动神经元的原代脊髓细胞融合产生的杂交细胞系，其表达mn的性能特点，包括动作电位的产生、特定神经丝的存在和乙酰胆碱信号传导。为了模拟er应激，发现促进在根性撕脱后发生神经变性的改变(参见penasc,autophagy,andbipleveldecreaseareearlykeyeventsinretrogradedegenerationofmotoneurons[自体吞噬和bip水平下降是运动神经元逆行性变性的早期关键事件],celldeathdiffer.[细胞死亡与分化]2011)，我们使用了不同的衣霉素浓度。衣霉素是细菌毒素，其抑制新合成蛋白质的n联糖基化，导致应激相关通路的活化，并因此被广泛用作经典er应激诱导剂。衣霉素是如下的动力，其溶解在dmso中至10mg/ml终浓度，并且然后在杜氏改良的伊格尔氏培养基(dmem)中以图例中所指示的最终工作溶液进行稀释。将其余药物，c1即阿坎酸钙和利巴韦林溶于水中，并且然后以最终工作溶液溶解于dmem培养基中：单独的或在c1中的0.11mm阿坎酸钙(aca)、4μm利巴韦林(rib)，最终体积100μl，用于mtt测定。
在体内c1对神经保护、抗炎和再生的作用的结果
如图1所示，与运载体组相比，根部撕脱的动物的c1治疗显著增加mn存活。此外，c1治疗与我们的阳性对照(pre084)的治疗没有显著不同，与运载体组也显著不同。
治疗后神经胶质免疫反应性的分析揭示c1显著降低ra产生的中枢神经系统处的炎性状态，减少星形胶质细胞增生(gfap阳性)和小胶质细胞增生(iba1阳性)(图2，分别为顶图和中间的图)。受损伤脊髓段的侧腹侧的轴突外分支中的促再生标志物gap43的分析揭示在用c1治疗后升高的水平(图2，底图)。
在体外c1对神经保护的超加性效应的结果
当同时添加到培养基中的衣霉素(tn)中时，我们评估了c1(100μl终体积中阿坎酸钙0.11mm+利巴韦林4μm)的神经保护作用。在添加毒素和治疗性药物进行mtt常规测试后24小时，我们评价细胞存活。如图3b所显示，针对这种应激，c1显著保护细胞(77.1％，p<0.05)。请注意，pre084没有像c1那样有效地对细胞进行神经保护。图3b中表现的值收集在表3中。
表3.mtt测定(％样品与对照)
为了分析药物之间可能的加性神经保护作用的存在，我们确定了与c1的当量剂量(在100μl终体积中阿坎酸钙0.11mm+利巴韦林4μm)相比，各单独药物的剂量效应关系(阿坎酸钙0.11mm或利巴韦林4μm，两者都在100μl终体积中)。结果显示在表4-6中。
表4：给予单独的阿坎酸钙。反应是衣霉素诱导的er应激后神经元细胞存活的％，并使用mtt测定进行测量。da是0.11mm阿坎磷酸钙(其对应于剂量da＝1，即1x)和对应的稀释液，即0到1x(为1x0.11mm阿坎酸钙)的剂量da。校正的反应是减去对照实验的针对每个剂量da的反应(da＝0，反应＝62.956％)。n是重复的数目。
表5：给予单独的利巴韦林。反应是衣霉素诱导的er应激后神经元细胞存活的％，并使用mtt测定进行测量。db是4μm利巴韦林(其对应于剂量db＝1，即1x)和对应的稀释液，0到1x(为1x4μm利巴韦林)的剂量db。校正的反应是减去对照实验的针对每个剂量的db的反应(db＝0，反应＝62.956％)。n是重复的数目。
表6：给予c1(包含阿坎酸钙+利巴韦林的组合)。反应是衣霉素诱导的er应激后神经元细胞存活的％，并使用mtt测定进行测量。da是0.11mm(其对应于剂量da＝1，即1x)，db是4μm(其对应于剂量db＝1，即1x)及它们的对应的稀释液。校正的反应是减去对照实验的针对每个剂量da的反应(da＝0或db＝0，反应＝62.956％)。n是重复的数目。
表7中总结了协同作用的分析，其中反应是使用mtt测定，衣霉素诱导的er应激后神经元细胞存活的％。da是阿坎酸钙0.11mm(1x)，db是利巴韦林4μm(1x)及其对应的稀释液。获得的da、db(单独给药)和c1(组合给药)的反应是来自表3-5中的校正值。预期反应da+db是单独给药时da获得的反应和单独给药时db获得的反应的总和。获得与预期相比的差异是预期反应和da+db获得反应之间的分站(substation)。预期前的反应比率是以百分比表示的获得与预期相比的差异相对c1预期反应的比率。
表7
在测定的剂量中，所有实验的协同作用的平均值是按预期前获得的反应的比例测量的协同作用的79％。
确定c1作用机制的结果
基于系统生物学方法的计算机模拟实验允许我们假设c1对神经保护的作用机制。在表8中我们列出了此机制的一些关键分子。请注意，它们中至少有三种(xiap、aifm1和parp1)被指出与细胞凋亡有关。为了验证这些相关分子中的一些(整联蛋白的b1亚基(itgb1)、动力蛋白激活蛋白(dynactin)(dctn1)和瑟土因1(sirt1))或相关分子驱动蛋白5c(kif5c)，我们进行了免疫组织化学分析。
表8.在c1协同作用中作用机制的关键候选蛋白
如图4中所示，正如预期的，用c1进行的治疗调节了这些蛋白质的表达水平。
考虑sirt1已被报道为神经保护和寿命的重要关键分子，我们专注于确定其在c1神经保护中的相关性。为了确定c1治疗是否促进sirt1活性，我们用c1治疗ra损伤的动物同时使用其活性的sirt1特异性抑制剂ex-527(6-氯-2,3,4,9-四氢-1h-咔唑-1-甲酰胺)，或用亚精胺治疗。亚精胺可降低乙酰化蛋白的水平，从而模拟sirt1增加活性的某些作用。如图5所示，与c1组合使用ex-527，消除了c1施加的神经保护作用，而亚精胺确实维持了它。
通过c1治疗的功能恢复
使用坐骨神经粉碎损伤模型验证c1的再生潜能。为了评估去除神经支配的肌肉的功能恢复，在腓肠肌和足底肌中记录了响应于坐骨神经刺激诱发的复合肌肉动作电位(cmap)。我们观察到在随访期间c1治疗导致两种肌肉中cmap振幅的显著增加(图6a)。在28天后，相比于未治疗的动物中的40％，所有治疗的动物都显示足底肌神经再支配的证据(图6b)。另外，通过坐骨神经功能指数(sfi)评估的运动功能恢复揭示c1治疗的动物的显著改进(图6c)。因此，通过nf-200与α-银环蛇毒素的共定位评估的神经再支配的神经肌肉接合处(nmj)的数目的定量显示c1治疗的动物与运载体治疗的动物相比数目增加(图6d)。正如预期的，我们验证了运动神经元(mn)数量在粉碎模型中保持不变(图6e)。
电生理学和功能检查
所有实验均以盲法进行。对于电生理学检查，将大鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪0.1ml/100g重量的混合物腹膜内麻醉。坐骨神经由置于坐骨切迹处的经皮电极刺激，并且通过将电极置于腓肠肌和足底肌上来记录复合肌肉电位(cmap)。在存储示波器(synergymedelec，viasyshealthcare)上以对于测量从基线到峰值和从潜伏期到发病的振幅适当的设置显示诱发的动作电位。为了对运动进行功能分析，我们在大鼠后爪的足底表面涂上丙烯酸涂料，并让大鼠沿着底部有白纸的走廊行走。通过用精密装置测量足印长度(pl)、第1和第5脚趾之间的距离(ts)或第2和第4脚趾之间的距离(it)，分析经手术的和完好爪子的足迹。将这三个参数组合起来，以获得坐骨神经功能指数(sfi)(demedinaceli,1988)，其量化了步行模式的变化(0为未受伤；-100为最大受损步态)。
神经肌肉接合处神经再支配分析
我们使用低温切片机将足底骨间肌切成连续的横切片(40μm厚)，并将其保存在-20℃直至使用。如上所述将载玻片与鸡抗neurofilament200(nf-200；1:1000，密理博公司(millipore))孵育，并在几次洗涤之后添加cy3缀合的二级抗体。最后，我们按照制造商的方案，用α-银环蛇毒素标记溶液(生命技术公司(lifetechnologie))孵育这些片以揭示运动终板机制。采集连续显微镜照片，以20倍覆盖所有足底肌。只有带有nf-200共同标记的运动终板在发生神经再支配时被计数。
结论
包含阿坎酸钙和利巴韦林的组合c1在基于衣霉素的er应激体外模型和周围神经根性撕脱的体内模型中都显示对运动神经元的意想不到的神经保护和神经再生作用。另外，对神经保护作用的分析证明c1在体内促进运动神经元的存活并在体外呈现出超加性效应。此外，c1减少轴突损伤后中枢神经系统的炎性相关状态并促进促再生神经元表型的出现。最后，计算机模拟预测的c1对病理状态施加的作用机制显现确定且增加一些细胞骨架和促再生分子，下调一些凋亡分子并增加sirt1活性。