经修饰的白细胞介素-7融合蛋白的制剂的制作方法

本发明涉及一种包含经修饰的白细胞介素-7融合蛋白的药物组合物的制剂。

背景技术

白细胞介素-7(il-7)是一种刺激由t细胞和b细胞介导的免疫应答的细胞因子，具体地，它在适应性免疫系统中发挥重要作用。尽管il-7主要由骨髓和胸腺中的基质细胞分泌，它也产生在角质形成细胞，树突细胞，肝细胞，神经和上皮细胞中(heuflercetal.,1993,j.exp.med.178(3):1109-14；kronckeretal.,1996,eur.j.immunol.26(10):2541-4:sawayetal.,2009,immunity30(3):447-57；watanabemetal.,1995,j.clin.invest.95(6):2945-53)。

通过影响t细胞和b细胞的存活和分化，以及通过刺激nk细胞(自然杀伤细胞)的活性等等，il-7激活了免疫系统。并且具体地，它在b细胞的发育中发挥重要作用。通过刺激il-2(一种细胞因子)和干扰素-γ的分泌，il-7增强了在人体中的免疫应答。

换而言之，il-7是一种促进t细胞、b细胞和其它免疫细胞的存活和增殖的细胞因子，并且它是用于各种疾病(例如病毒感染、癌症和免疫系统损伤)的免疫治疗剂的优秀候选者。最近进行了一项临床研究，用来阐明il-7对各种恶性肿瘤和人体免疫缺陷病毒感染的作用，其结果报道了il-7对人类的免疫增强作用(frytjetal.,2002,blood99(11):3892-904；mueggeketal.,1993,science261(5117):93-5；rosenbergsaetal.,j.immunother.29(3):313-9)。另外，据报道，il-7有助于异基因干细胞移植后的免疫恢复(snyderkm,2006,leuklymphoma47(7).1222-8)，并且它还被用于治疗淋巴细胞减少症。相应地，il-7识别免疫细胞，增强t细胞功能，并且与引发免疫抑制的物质相竞争，因此，它可以被用于治疗癌症或者慢性感染。

然而，为了将诸如il-7的蛋白质用于药物用途，需要根据蛋白质的结构和其在周围环境中的物理化学稳定性制备合适的制剂。另外，蛋白质的物理和化学的稳定性受到诸如药物制剂的制造、蛋白质的纯化和储存的外部因素的影响。一般而言，蛋白质在结构和热力学方面不稳定，因此，它容易形成聚集或者出现物理化学的降解。另外，因为fc区的分子量大并且结构复杂，所以，当免疫球蛋白的fc区被用作融合对象时，整体的融合蛋白的物理化学性质(如动力学性质、zeta电位和压力稳定性等)会改变很大。具体地，对于经修饰的il-7融合蛋白的稳定的制剂还知之甚少。因此，有必要优化蛋白质的制剂，以增加该蛋白质在药物用途方面的稳定性。

技术实现要素：

技术问题

因此，本发明人建立了一种合适的制剂，用于增加经修饰的il-7融合蛋白在用于治疗各种疾病时的稳定性。

本发明的目的在于提供一种具有增加的稳定性的包含经修饰的il-7融合蛋白的药物制剂。

问题的解决方案

依据本发明的目的，提供了一种药物制剂，包括：(a)经修饰的il-7融合蛋白；(b)基础缓冲液，浓度为10～50mm；(c)糖，浓度为2.5～5w/v％；和(d)表面活性剂，浓度为0.05～6w/v％。发明的有益效果

根据本发明的经修饰的il-7融合蛋白的药物制剂不显示聚集体形成，并且在压力条件(如氧化或者搅拌)下保持经修饰的il-7融合蛋白的稳定性，而由此可以用于治疗病人。

附图说明

图1为根据本发明的经修饰的il-7融合蛋白的结构示意图。

图2为经修饰的il-7融合蛋白在各种基础缓冲液条件下的差式扫描量热法(dsc)的结果。

图3为经修饰的il-7融合蛋白在各种基础缓冲液条件下的动态光散射(dls)分析的结果。

图4为经修饰的il-7融合蛋白在各种赋形剂被加入组氨酸-醋酸盐缓冲液的条件下的dls分析的结果。

图5为经修饰的il-7融合蛋白在各种赋形剂被加入柠檬酸钠缓冲液的条件下的dls分析的结果。

本发明的优选实施方式

以下将对本发明进行详细地说明。

本发明提供了一种药物制剂，包括：(a)经修饰的il-7融合蛋白；(b)基础缓冲液，浓度为10～50mm；(c)糖，浓度为2.5～5w/v％；和(d)表面活性剂，浓度为0.05～6w/v％。

如本文所用，术语“白细胞介素-7(il-7)”是指在各种基质细胞、产生角蛋白的细胞、树突细胞、神经元、表皮细胞等中表达或者分泌的造血生长因子。il-7可以通过结合受体促进免疫应答，并且它可以激活各种免疫细胞，例如t细胞，b细胞，免疫系统中的单核细胞。

该il-7是白细胞介素-7(il-7)，或者是具有与il-7类似的活性的多肽。

本发明的il-7包括了含有由seqidno:1～6表示的氨基酸序列的多肽。另外，该il-7融合蛋白的氨基酸序列可以与seqidno:1～6的序列具有大致90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或者更多的序列同源性。il-7可以是il-7融合蛋白，或者是包括其片段的融合蛋白。另外，il-7可以源自人类、大鼠、小鼠、猴子、奶牛或者绵羊。

具体地，人源的il-7可以具有由seqidno:1(genbank登录号：p13232)表示的氨基酸序列；源自大鼠的il-7可以具有由seqidno:2(genbank登录号：p56478)表示的氨基酸序列；源自小鼠的il-7可以具有由seqidno:3(genbank登录号：p10168)表示的氨基酸序列；源自猴子的il-7可以具有由seqidno:4(genbank登录号：np_001279008)表示的氨基酸序列；牛il-7可以具有由seqidno:5(genbank登录号：p26895)表示的氨基酸序列；以及羊源性的il-7可以具有由seqidno:6(genbank登录号：q28540)表示的氨基酸序列。

如本文所用，术语“经修饰的il-7”是指一种分子，其中，在il-7的端部具有包括了1～10个氨基酸的寡肽，由此而具有与野生型il-7不同的序列。

优选地，根据本发明的经修饰的il-7具有如下的结构：

a–il-7；

其中，所述a可以与该il-7的n-端结合。编码所述a的核酸可以依次与il-7基因同在dna构建体上，它可以被表达为蛋白质。进一步地，所述a可以被单独地表达或者合成，并且随后通过化学键与il-7结合。

所述a包括1～10个氨基酸，具体地，包括2～8个氨基酸，更具体地，包括1～5个氨基酸，其中，所包括的氨基酸是选自包括蛋氨酸(m)、甘氨酸(g)、以及其组合的组。所述a的例子包括：m,g,mm,mg,gm,gg,mmm,gmm,mgm,mmg,ggm,gmg,mgg,ggg,mmmm(seqidno:9),gmmm(seqidno:10),mgmm(seqidno:11),mmgm(seqidno:12),mmmg(seqidno:13),ggmm(seqidno:14),mggm(seqidno:15),mmgg(seqidno:16),gmgm(seqidno:17),mgmg(seqidno:18),gmmg(seqidno:19),gggm(seqidno:20),mggg(seqidno:21),gmgg(seqidno:22),ggmg(seqidno:23),gggg(seqidno:24),mmmmm(seqidno:25),gmmmm(seqidno:26),ggmmm(seqidno:27),gggmm(seqidno:28),ggggm(seqidno:29),mgmmm(seqidno:30),mggmm(seqidno:31),mgggm(seqidno:32),mgggg(seqidno:33),mmgmm(seqidno:34),mmggm(seqidno:35),mmggg(seqidno:36),mmmgm(seqidno:37),mmmgg(seqidno:38),mmmmg(seqidno:39),mgggm(seqidno:40),mgmgm(seqidno:41),gmgmg(seqidno:42),gmmmg(seqidno:43),ggmgm(seqidno:44),ggmmg(seqidno:45),mggmg(seqidno:46),mgmgg(seqidno:47),gmmgm(seqidno:48),mgmmg(seqidno:49),gmggm(seqidno:50),mmgmg(seqidno:51),gmmgg(seqidno:52),gmggg(seqidno:53),ggmgg(seqidno:54),gggmg(seqidno:55)和ggggg(seqidno:56)等。根据本发明的一个实施例，所述a可以是m、mm、gm、mgm或者mmm。

进一步地，根据本发明的经修饰的il-7融合蛋白可以在其c-端包括经修饰的免疫球蛋白的fc区。

如本文所用，术语“经修饰的il-7融合蛋白”是指一种分子，其中，经修饰的免疫球蛋白fc区结合在经修饰的il-7的c-端。

所述经修饰的免疫球蛋白fc区可以是其对于fc受体或者补体的结合活性被修饰过，从而导致减弱的抗体依赖性细胞毒性(adcc)或者补体依赖的细胞毒性(cdc)。通过在fc区的fcγ受体(fcrr)、c1q和fc结合受体(fcrn)的结合位点的基因突变(如：序列的取代、缺失)，可以实现这种修饰。

另外，这种修饰可以通过混合不同类型的免疫球蛋白序列(即：通过制备杂合fc)来实现。

如本文所用，术语“fc区”、“fc片段”或者“fc”可以在从n-端至c-端的方向上包括铰链区、重链恒定区2(ch2)域、以及重链恒定区3(ch3)域。该区可以进一步地包括铰链区，在这种情况下，该铰链区可以用作接头，并且可以适当地被修饰，以改进该分子的性质。

如同“hfc”或者“hyfc”，该fc区或者其片段是指一类杂合fc，它是通过组合不同类型的fc区制备而成。这样的hyfc可以包括人类igd铰链区的一部分、人类igdch2域的氨基酸残基、人类igg4ch2域的氨基酸残基、和人类igg4ch3域的氨基酸残基。

可以修饰fc区变体以防止在铰链区的截断。具体地，可以修饰seqidno:7的第144位氨基酸和/或第145位氨基酸。为了形成变体，优选地，可以用g或者s取代seqidno:7的第144位氨基酸(k)；并且，可以用g或者s取代seqidno:7的第145位氨基酸(e)。

另外，两个融合蛋白可以形成二聚体。例如，当第三域是fc区时，这些fc区可以相互结合而形成二聚体。

根据本发明的一个实施例，经修饰的免疫球蛋白fc区可以是一个包括了由seqidno:7表示的氨基酸序列的多肽。根据本发明，经修饰的免疫球蛋白的该fc区可以是在美国7,867,491号专利中记载过的，并且可以参考美国7,867,491号专利中的记载进行生产。

根据本发明的一个实施例，该经修饰的il-7可以具有seqidno:8的氨基酸序列。另外，该经修饰的il-7可以与seqidno:8的氨基酸序列具有90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或者99％的序列同源性。

如本文所用，术语“基础缓冲液”是指通过其中所含的酸碱共轭物组分来耐受ph的变化的溶液。

根据本发明的基础缓冲液可以为组氨酸-醋酸盐或者柠檬酸钠溶液。基础缓冲液的使用浓度可以为10～50mm、15～40mm、或者20～30mm。根据本发明的一个实施例，它的使用浓度可以为20mm。

组氨酸-醋酸盐溶液是含有组氨酸离子的溶液。组氨酸-醋酸盐溶液是用液态乙酸滴定l-组氨酸制备而成。同时，柠檬酸钠溶液是通过根据溶液的最终浓度和ph用含水柠檬酸滴定柠檬酸钠溶液制备而成。

在本发明中，糖能稳定该融合蛋白。另外，由于糖易溶解于水，并且具有甜味，它被广泛地用为药物制剂的赋形剂。

在根据本发明的制剂中，所含的糖的浓度可以为2.5～5w/v％、3.5～5w/v％、或者4.5～5w/v％，并且具体地，在本发明的一个实施例中，可以为5w/v％。

在根据本发明的制剂中，糖可以为蔗糖、海藻糖、右旋糖、或其混合物。在本发明的一个实施例中，糖可以为蔗糖。蔗糖是通过1，2-结合的葡萄糖和果糖而形成的二糖，它在碱性环境下相对稳定，但是易于被酸水解。

在根据本发明的药物制剂中，糖具有保护融合蛋白针对氧化压力的作用，并且糖醇可以用作糖替代品或者辅料。糖醇可以为山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、甘露醇或其混合物。在本发明的一个实施例中，糖醇可以为山梨糖醇。

如本文所用，术语“表面活性剂”是表面活化剂，并且具体地，它是指非离子表面活性剂。在根据本发明的药物制剂中，表面活性剂抑制融合蛋白的聚集体形成，从而增加了该融合蛋白的稳定性。

在根据本发明的制剂中，表面活性剂的加入浓度可以为0.05～6w/v％、0.1～5.5w/v％、或者0.1～5.0w/v％。

表面活性剂可以为聚山梨酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯硬脂酸酯、烷基硫酸盐、聚乙烯基吡啶酮、伯洛沙姆或其混合物。具体地，表面活性剂可以为聚山梨酸酯或者伯洛沙姆。

根据本发明，聚山梨酸酯是通过组合脱水山梨糖醇脂肪酸酯和环氧乙烷而形成的聚氧乙烯高级脂肪醇，基于聚氧乙烯基团的数目和脂肪酸的种类，它可以为聚山梨酸酯20(单月桂酸酯)、40(单棕榈酸酯)、60(单硬脂酸酯)、65(三硬脂酸酯)或者80(单油酸酯)。另外，伯洛沙姆是一种聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，它可以根据聚合物的长度而变化。

在本发明的一个实施例中，表面活性剂可以为聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80或者伯洛沙姆188。

进一步地，根据本发明的药物制剂可以包括诸如精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸或其混合物等的氨基酸。所含的氨基酸被用作赋形剂，用于稳定蛋白质，并且根据蛋白质的类型，可以包含各种氨基酸。该氨基酸可以为精氨酸、谷氨酸、甘氨酸或者组氨酸，并且根据本发明的一个实施例，它可以是谷氨酸。该氨基酸的加入浓度可以为40～60mm，根据本发明的一个实施例，该加入浓度可以为50mm。

当将本发明的药物制剂用作注射剂时，它可以进一步地包括糖醇以调节渗透压。该糖醇是指一个长链醇，在该长链醇中，糖的羧基被还原成羟基(-oh)。加入该糖醇，使其浓度达到1～2w/v％，并且根据本发明的一个实施例，其浓度可以为1.5w/v％。

在本发明中所用的糖醇的例子包括山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、甘露醇或其混合物。根据本发明的一个实施例，糖醇可以为山梨糖醇。山梨糖醇是通过高压加入和还原葡萄糖而形成的具有6个羟基的糖醇，它还指d-山梨糖醇(d-sorbitol)或者d-山梨醇(d-glucitol)。

本发明的药物制剂的ph可以为5.0～6.0，具体地，ph为5.0。如果基础缓冲液的ph低于5.0，会降低融合蛋白的构象稳定性，而当ph超过6.0时，根据具体的组分，该融合蛋白可能显示出聚集体形成。

该制剂可以是液体制剂。

发明人制备了一种经修饰的il-7融合蛋白，并且选择了基础缓冲液和表面活性剂来制备该融合蛋白的药物制剂。其中，在该经修饰的il-7融合蛋白中，寡肽结合在il-7的n-端，并且免疫球蛋白的fc区结合在il-7的c-端。

首先，在各种ph条件下，根据基础缓冲液检测了该经修饰的il-7融合蛋白的稳定性。当使用柠檬酸钠作为基础缓冲液时，该融合蛋白的稳定性随着ph的升高而增加(表格2和图2)，但是，随着ph的升高，zeta电位降低，且形成该融合蛋白的聚集体。当使用组氨酸-醋酸盐作为基础缓冲液时，得到了类似的结果，由此，实验最先是在ph5.0的条件下进行的(表格3和图3)。

另外，为了检测该融合蛋白针对诸如搅拌和氧化的压力环境的保护作用，加入了糖或者糖醇、表面活性剂和氨基酸，作为赋形剂。结果是，蔗糖和山梨糖醇对该融合蛋白显示了针对氧化压力的保护作用，而如果不考虑表面活性剂的类型，诸如吐温20、吐温80和伯洛沙姆188的表面活性剂对该融合蛋白显示了针对搅拌压力的保护作用。在进一步地使用氨基酸的情况下，在加入精氨酸、谷氨酸、甘氨酸或者组氨酸时，观察到了对根据本发明融合蛋白的保护作用，其中，谷氨酸显示了优秀的保护作用(表格4和表格5)。

使用上述的方法，选择了吐温80和蔗糖，因为其显示了对该融合蛋白的保护作用，并且检测了这些选出的赋形剂的组合的保护作用。结果是，当在组氨酸-醋酸盐基础缓冲液中混合了吐温80和蔗糖时，对该融合蛋白显示了针对搅拌或者氧化压力的保护作用。同时，当在组氨酸-醋酸盐基础缓冲液中混合了蔗糖、山梨糖醇和吐温80时，在各种压力条件下观察到了大致1％的平均变化，这证明了，这种制剂是优秀的(表格7，表格8和表格10)。

本发明的实施方式

以下，将通过实施例解释本发明的细节。下面的实施例是用来进一步地展示本发明，而不限制其范围。

实施例1：制备经修饰的白细胞介素-7融合蛋白

制备il-7融合蛋白。在该il-7融合蛋白中，寡肽和免疫球蛋白fc区被分别结合在n-端和c-端。人类il-7的序列(seqidno:1)被用于il-7，并且蛋氨酸(m)和甘氨酸(g)的序列组合被用于寡肽。fc区是人类igd的fc区与人类igg4的fc区的杂合体，与免疫球蛋白的已知的经修饰的fc区相比，该fc区在结合生物活性的融合蛋白时可以有效地提高体内半衰期。

首先，编码如下氨基酸序列的基因序列被插入pad15表达载体中：m-il-7-hyfc,g-il-7-hyfc,mm-il-7-hyfc,mg-il-7-hyfc,gm-il-7-hyfc,gg-il-7-hyfc,mmm-il-7-hyfc,gmm-il-7-hyfc,mgm-il-7-hyfc,mmg-il-7-hyfc,ggm-il-7-hyfc,gmg-il-7-hyfc,mgg-il-7-hyfc,ggg-il-7-hyfc,mmmm-il-7-hyfc,gmmm-il-7-hyfc,mgmm-il-7-hyfc,mmgm-il-7-hyfc,mmmg-il-7-hyfc,ggmm-il-7-hyfc,mggm-il-7-hyfc,mmgg-il-7-hyfc,gmgm-il-7-hyfc,mgmg-il-7-hyfc,gmmg-il-7-hyfc,gggm-il-7-hyfc,mggg-il-7-hyfc,gmgg-il-7-hyfc,ggmg-il-7-hyfc,gggg-il-7-hyfc,mmmmm-il-7-hyfc,gmmmm-il-7-hyfc,ggmmm-il-7-hyfc,gggmm-il-7-hyfc,ggggm-il-7-hyfc,mgmmm-il-7-hyfc,mggmm-il-7-hyfc,mgggm-il-7-hyfc,mgggg-il-7-hyfc,mmgmm-il-7-hyfc,mmggm-il-7-hyfc,mmggg-il-7-hyfc,mmmgm-il-7-hyfc,mmmgg-il-7-hyfc,mmmmg-il-7-hyfc,mgmgm-il-7-hyfc,gmgmg-il-7-hyfc,gmmmg-il-7-hyfc,ggmgm-il-7-hyfc,ggmmg-il-7-hyfc,mggmg-il-7-hyfc,mgmgg-il-7-hyfc,gmmgm-il-7-hyfc,mgmmg-il-7-hyfc,gmggm-il-7-hyfc,mmgmg-il-7-hyfc,gmmgg-il-7-hyfc,gmggg-il-7-hyfc,ggmgg-il-7-hyfc,gggmg-il-7-hyfc或者ggggg-il-7-hyfc。为了在表达载体pac15中插入融合蛋白基因，在该融合蛋白基因序列的5’-端引入了ecori位点，并且在该hyfc基因序列的3’-端引入了xbai位点。表达载体pad15是从rccmv的骨架(可获自invitrogen，carlsbad)获得。该pad15包括巨细胞病毒(cmv)衍生的启动子、胎牛生长激素衍生的poly(a)序列、兔β珠蛋白衍生的givs(珠蛋白内含子)(molcellbiol.1988,8:4395)、以及其它因子。通过修饰rccmv载体(invitrogen)的各种部分来制备该pad15载体。首先，通过xhoi酶去除新霉素抗性位点，并且在cmv启动子区域的3’-端加入givs。另外，在该cmv启动子的5’-端加入小鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)基因(genbank登录号：nm010049)。为了在框架中的il-7的3’-端和hyfc的5’-端之间制备连接位点，在il-7编码序列的3’-端和在hyfc编码序列的5’-端引入nhei位点。最终的表达载体是通过使用每个限制酶位点的亚克隆过程制备而成。关于制备经修饰的fc区的更多信息可以参考美国专利7,867,491(被认定为“杂合(fc)蛋白”)。本实施例的hyfc蛋白包括igdch1域的c-端的9个氨基酸(90-98)、igd铰链区的30个氨基酸(133-162)、igdch2域的n-端的8个氨基酸(shtqplgv163-170)、igg4ch2域的100个氨基酸(121-220)、以及igg4ch3域的107个氨基酸(221-327)。

关于包含修饰的fc区的hyfc蛋白，本发明参考韩国专利公开号为10-0897938的实施例中描述的hfc-2、hfc-3、hfc-4、hfc-5和hfc-6的每一种制备方法。在本发明的实施例中使用的hyfc蛋白是与韩国专利公开号为10-0897938中描述的hfc-5相一致的杂合蛋白。

pcr的操作条件见表格1。变性，退火和延伸过程分别为98℃15秒，55℃30秒，以及72℃60秒。

[表格1]

制备的表达载体为：m-il-7-hyfc,g-il-7-hyfc,mm-il-7-hyfc,mg-il-7-hyfc,gm-il-7-hyfc,gg-il-7-hyfc,mmm-il-7-hyfc,gmm-il-7-hyfc,mgm-il-7-hyfc,mmg-il-7-hyfc,ggm-il-7-hyfc,gmg-il-7-hyfc,mgg-il-7-hyfc,ggg-il-7-hyfc,mmmm-il-7-hyfc,gmmm-il-7-hyfc,mgmm-il-7-hyfc,mmgm-il-7-hyfc,mmmg-il-7-hyfc,ggmm-il-7-hyfc,mggm-il-7-hyfc,mmgg-il-7-hyfc,gmgm-il-7-hyfc,mgmg-il-7-hyfc,gmmg-il-7-hyfc,gggm-il-7-hyfc,mggg-il-7-hyfc,gmgg-il-7-hyfc,ggmg-il-7-hyfc,gggg-il-7-hyfc,mmmmm-il-7-hyfc,gmmmm-il-7-hyfc,ggmmm-il-7-hyfc,gggmm-il-7-hyfc,ggggm-il-7-hyfc,mgmmm-il-7-hyfc,mggmm-il-7-hyfc,mgggm-il-7-hyfc,mgggg-il-7-hyfc,mmgmm-il-7-hyfc,mmggm-il-7-hyfc,mmggg-il-7-hyfc,mmmgm-il-7-hyfc,mmmgg-il-7-hyfc,mmmmg-il-7-hyfc,mgmgm-il-7-hyfc,gmgmg-il-7-hyfc,gmmmg-il-7-hyfc,ggmgm-il-7-hyfc,ggmmg-il-7-hyfc,mggmg-il-7-hyfc,mgmgg-il-7-hyfc,gmmgm-il-7-hyfc,mgmmg-il-7-hyfc,gmggm-il-7-hyfc,mmgmg-il-7-hyfc,gmmgg-il-7-hyfc,gmggg-il-7-hyfc,ggmgg-il-7-hyfc,gggmg-il-7-hyfc或者ggggg-il-7-hyfc。使用电穿孔法，该表达载体被转染入chodg44细胞(来自chasin博士，哥伦比亚大学，u.s.a.)中。在48小时后，使用不含ht的10％dfbs+menα培养基进行ht筛选，并且使用ht筛选出的克隆进行mtx扩增，以扩大产率。在检测了其长期稳定性后，获得的单细胞被用于制备经修饰的il-7融合蛋白。

实施例2：经修饰的il-7融合蛋白的纯化

在获得包含了根据实施例1的方法制备的经修饰的il-7融合蛋白的培养液之后，根据下面表格2中所示的条件，通过尺寸排阻(se)hplc检测了产率。se-hplc进行了40分钟，使用了tsk-gelg3000wxl柱。

首先，用缓冲液将经修饰的il-7融合蛋白的每个样本溶液稀释至浓度为1mg/ml。用1ml注射器和0.2μm过滤器过滤每个稀释剂，并随后将其放入插入物中。该插入物被插入玻璃瓶中，并且保持瓶盖关闭。随后，每个检测溶液被注射入se-hplc系统，注入量为20μl。根据峰值测定纯度和相对产率。

结果是，具有如图1所示的结构的经修饰的il-7融合蛋白被纯化(根据韩国专利公开号10-2015-0082793，制备和纯化了该经修饰的il-7融合蛋白)，该经修饰的il-7融合蛋白具有高产率和高纯度。

实验实施例1：基础缓冲液的选择

1.1.根据热力学性质进行选择

为了建立经过上述实施例2纯化的经修饰的il-7融合蛋白的制剂，使用差式扫描量热法(dsc)检测了该融合蛋白在3种缓冲液中的热力学性质。

首先，使用ph为5.0、5.5或者6.0的20mm组氨酸-醋酸盐缓冲液或者柠檬酸钠、或者ph为8.0的tris缓冲液，在4℃对已在实施例2中纯化过的经修饰的il-7融合蛋白进行透析。

同时，使用microcalvp-dsc仪(northampton，u.s.a.)进行dsc，该microcalvp-dsc仪具有双胞室，其样本和对照溶液的体积为0.5147cm³。在温度为15℃～110℃时，扫描的速度为1.25℃/min。在测量这些数值之前，在真空状态下搅拌每个溶液，以除去空气。随后，首先测定不含有该融合蛋白的溶液的标准值，经修饰的il-7融合蛋白的温度记录显示为从这些检测值中减去该标准值而确定的数值。

获得的图形通过使用microcalllc-dsc(northampton，u.s.a.)来显示，该microcalllc-dsc与随设备提供的origin7.0软件包连接。另外，从结果中，使用origin7.0软件获得了该融合蛋白的转变温度(tm)和焓值(δh)。

如图2所示，对于mgm-il-7-hyfc融合蛋白，在关于三种缓冲液的典型dsc温谱图中鉴定出了tm1和tm2(分别是il-7和hyfc的转变温度)，以及代表着因热而展开的融合蛋白结构的两个峰值。这些结果表明，由于热能吸收，il-7和hyfc各自处于展开状态，并且它们结构稳定。

一般而言，hyfc是制备长效蛋白质的设计平台，其中，igd(铰链-ch2)和igg4(ch2-ch3)杂合在长效蛋白质中，并且，根据多种环境因素，该hyfc具有源自igg4的单一或者双重转变。然而，本实验的结果明显地表明，hyfc具有单一转变峰值。

另外，如下面表格2所示，当组氨酸-醋酸盐缓冲液的ph从5.0升至6.0时，tm1和tm2分别从58.89℃增至62.92℃和从66.93℃增至69.91℃。另外，δh也随着tm而增加。这些结果表明，当ph升高时，更高的温度和更多的热能对于il-7和hyfc结构的展开是必要的。也就是说，随着ph升高，il-7和hyfc蛋白质的构象稳定性可能会增加。

即使将ph为5.0、5.5或者6.0的柠檬酸钠用作基础缓冲液时，tm1和tm2也随着ph的升高而增加，此结果与使用组氨酸-醋酸盐缓冲液得到的结果相一致。需要注意的是，当ph从5.0升至6.0时，tm1和tm2分别从57.23℃增至65.12℃和从66.74℃增至71.34℃。

关于将柠檬酸钠作为基础缓冲液时的δh值，当ph为5.0时，tm1和tm2的δh值最低。这个结果表明，用于稳定地维持蛋白质结构的基础缓冲液的适宜ph为5.5或者6.0。

当使用ph8.0的tris缓冲液时，tm1、tm2和tm1的δh值高于使用其他缓冲液而获得的相应数值。这个结果与前面提及的表明经修饰的il-7融合蛋白的构象稳定性随着ph的升高而增加的结果是一致的。在具有高ph的tris缓冲液的情况下，tm2值相较于其他ph为6.0的缓冲液有所增加，然而，tm2的δh值却降低，这表明，它可能对il-7的构象稳定性具有比对hyfc的稳定性更大的影响。

[表格2]

1.1.通过动态光散射(dls)分析进行选择

进行dls分析是为了评估蛋白质之间的静电作用，以及z-平均尺寸、多分散指数(pdi)和zeta电位，以及ph和缓冲液对聚集体形成的影响。蛋白质的粒径和zeta电位是通过zetasizernanozs90(malverninstruments，uk)测量而得。

z-平均尺寸是指诸如片段、单体和聚集体的元素的平均值，它甚至对于小的变化(例如存在小的聚集体)都非常敏感。如果测得的pdi值低于0.05，它显示的是单分散标准，如果该值高于0.7，它表明，该样本具有宽的尺寸分布。zeta电位是流体动力学表面周围的蛋白质的电排斥。如果zeta电位的绝对值很高，该蛋白质在溶液中不易发生聚集和不稳定。

首先，为了dls分析，在检测温度为10℃时平衡经修饰的il-7融合蛋白样本。使用1ml样本，在一次性尺寸比色皿中测量粒径5次，并且在角度固定为90°的一次性毛细管中测量zeta电位3次。通过随设备提供的7.11版的zetasizer软件(malverninstruments，uk)计算了峰值的强度、平均粒径、pdi和zeta电位。

图3示出了使用ph5.0的组氨酸-醋酸盐或者柠檬酸钠，或者使用ph8.0的tris作为基础缓冲液时的蛋白质尺寸分布，它表现为蛋白质峰的强度。表格3示出了在不同的ph条件下3种缓冲液的z-平均尺寸、pdi和zeta电位。

如图3所示，当将ph5.0的组氨酸-醋酸盐或者柠檬酸钠作为基础缓冲液时，在连续的5次检测中，获得的图均示出单个窄峰。同时，当使用ph8.0的tris缓冲液时，测得一个新的峰，它表明在100～1,000nm的聚集。

如表格3所示，当将组氨酸-醋酸盐作为基础缓冲液时，如果ph由5.0升至6.0，出现了新的聚集，并且，z平均尺寸和pdi分别从10.43nm增至10.64nm和从0.02增至0.07。另外，当ph升高，zeta电位的绝对值从4.42降至1.28。

在将柠檬酸钠用作基础缓冲液时，也观察到如上所述的由于ph改变而出现的聚集现象：也就是说，在柠檬酸钠基础缓冲液中，z-平均尺寸和pdi增加，zeta电位降低。

然而，与在其他缓冲液中相比，在tris基础缓冲液中的z-平均尺寸和pdi增加得更大，分别增加到12.38nm和0.34。另外，在tris基础缓冲液中发生了蛋白质聚集。另外，尽管发生了聚集，在tris缓冲液中的zeta电位的绝对值为20.27，它高于在其他缓冲液中的相应值。

因此，为了减低本专利的经修饰的il-7融合蛋白的聚集，可以将组氨酸-醋酸盐或者柠檬酸钠作为合适的基础缓冲液，优选地，在具有低zeta电位的ph条件下。在高ph的条件下，可以将缓冲液与蛋白质聚集抑制剂联合使用。

[表格3]

*d.nm:直径(纳米)

实验实施例2：赋形剂的选择

2.1.根据在压力条件下的保护作用进行选择

为了检测赋形剂针对诸如搅拌和氧化的压力环境的保护作用，使用尺寸排阻色谱法检测了各种赋形剂，包括：浓度为5w/v％的表面活性剂，浓度为5w/v％的糖以及浓度为50mm的氨基酸。在对照组中，只有经修饰的il-7融合蛋白被加入了基础缓冲液中。关于该基础缓冲液，使用的是ph5.0的组氨酸-醋酸盐或者柠檬酸钠基础缓冲液。

具体地，使用溶液在4℃透析该经修饰的il-7融合蛋白，该溶液是通过在ph5.0的组氨酸-醋酸盐或者柠檬酸钠基础缓冲液添加了各种类型的赋形剂制备而成。对于搅拌压力环境，将0.5ml经过透析的经修饰的il-7融合蛋白放入微管中，该微管随后被放入盒子中，并且在室温下使用vortex-genie2(scientificindustries，inc.，u.s.a.)在强度为7的条件下搅拌2小时。

同时，对于氧化压力环境，在0.5ml经过透析的mgm-il-7-hyfc融合蛋白中加入过氧化氢，使其最终浓度达到1.0％(v/v)，并且在室温下放置20小时。通过高效液相色谱(hplc)系统(waterse2695，u.s.a.)在uv波长为214nm的吸收光谱下进行尺寸排阻色谱法。

<hplc条件>

柱：tskgelg3000swxlsec柱(300×7.8mm)(tosohbioscience，u.s.a.)

流动相：含有100mmnacl和10％乙腈的50mm磷酸钠溶液(ph6.8)

流量:0.5ml/min

结果是，观察到了包括水溶性聚集、单体和片段的多个元素，并且通过数学方程1计算每个元素的量。

[方程1]

％特定元素的含量＝ct/cs×100

其中，ct是指每个元素(水溶性聚集、单体和片段)的面积，cs是指获得样本时各元素峰的总和。

如在表格4和5所示，结果是，在对照组中，在柠檬酸钠缓冲液中的单体含量为96.34％，它通过搅拌降至78.18％，通过氧化降至48.16％。

经发现，通过在组氨酸-醋酸盐或者柠檬酸钠缓冲液中加入广为人知的非离子表面活性剂(例如吐温或者伯洛沙姆)，保护了mgm-il-7-hyfc融合蛋白抵抗搅拌压力。这样的非离子表面活性剂具有优秀的保护蛋白质的作用，以防止蛋白质在疏水界面中的展开。当在缓冲液中加入吐温20、吐温80或者伯洛沙姆188，单体含量不会显著地降低。然而，这些表面活性剂的保护作用基本上相似，这表明，在由于搅拌而在持续地变化着的疏水环境下，这些表面活性剂保护了本发明的融合蛋白。

同时，这些表面活性剂对mgm-il-7-hyfc融合蛋白没有显示出任何针对氧化压力的保护作用，并且相比于对照组，它更倾向于使得单体含量减少得更多。另外，已知吐温20和吐温80会氧化蛋白质。如同吐温20和吐温80，伯洛沙姆188也使得本发明的融合蛋白在氧化条件下不稳定。

诸如蔗糖和山梨糖醇的糖或者糖醇经常被用作药物赋形剂，用来稳定mgm-il-7-hyfc融合蛋白。然而，蔗糖和山梨糖醇导致单体含量比对照组更低，这表明，它们对本发明的融合蛋白不具有针对搅拌压力的保护作用。

在柠檬酸钠缓冲液中进行搅拌之后，相比于没有受到压力的参考值，在对照组中的单体含量降低了18.16％，而如果分别加入了蔗糖和山梨糖醇，其单体含量减低了39.29％和53.51％。同时，在组氨酸-醋酸盐缓冲液中进行搅拌之后，相比于没有受到压力的参考值，在对照组中的单体含量降低了2.23％，而如果分别加入了蔗糖和山梨糖醇，其单体含量减低了11.53％和13.77％。

已知，在搅拌时，在药剂中加入糖和糖醇会引发igg的聚集体形成。当将蔗糖和山梨糖醇加入药剂中时，在搅拌中会增加聚集体形成，这导致mgm-il-7-hyfc融合蛋白的稳定性的降低，不管基础缓冲液的种类。

同时，蔗糖和山梨糖醇增加了融合蛋白在氧化压力下的稳定性。在柠檬酸钠缓冲液中，相比于没有受到压力的参考值，在对照组中的单体含量降低了48.18％，而如果分别加入了蔗糖和山梨糖醇，单体含量减低了2.55％和2.79％。类似地，在组氨酸-醋酸盐缓冲液中，相比于没有受到压力的参考值，在对照组中的单体含量降低了35.36％，而如果分别加入了蔗糖和山梨糖醇，单体含量减低了1.68％和1.47％。这个结果表明，蔗糖和山梨糖醇对蛋白质具有针对氧化的保护作用。据报道，这两种物质能够通过从蛋白质表面优先地排除来稳定蛋白质。

接下来，关于氨基酸在压力条件下对mgm-il-7-hyfc融合蛋白的稳定性的作用，当在柠檬酸钠缓冲液分别加入了50mm精氨酸、谷氨酸、甘氨酸和组氨酸这些氨基酸时，针对搅拌的保护作用非常小。相比于没有受到压力的参考值，在对照组中的单体含量降低了18.16％，而如果分别加入了精氨酸、谷氨酸、甘氨酸和组氨酸，单体含量减低了49.71％、64.75％、30.96％和46.75％。同时，当使用组氨酸-醋酸盐缓冲液时，精氨酸和谷氨酸被发现会使得本发明的融合蛋白不稳定。

同时，当将甘氨酸加入组氨酸-醋酸盐缓冲液中时，与没有受到压力的参考值相比，mgm-il-7-hyfc融合蛋白的单体含量没有降低。这个结果与柠檬酸钠的结果相矛盾，这表明，mgm-il-7-hyfc融合蛋白的稳定性能够随着包括缓冲液和赋形剂的环境因素而改变。

另外，当分别将精氨酸和甘氨酸加入柠檬酸钠缓冲液中时，观察到了针对氧化压力的保护作用，但是，当将它们加入组氨酸-醋酸盐缓冲液中时，没有观察到这样的作用。然而，关于氧化压力，当分别将精氨酸和甘氨酸加入柠檬酸钠缓冲液中时，相比于没有受到压力的参考值，样本中的单体含量分别降低了30.66％和3.21％，小于对照组(降低了48.18％)。同时，当将精氨酸和甘氨酸加入组氨酸-醋酸盐缓冲液中时，相比于没有受到压力的参考值，与对照组(降低了35.36％)相比，其单体含量分别显著地降低了39.34％和37.90％。具体地，在两种缓冲液中，根据缓冲液类型，甘氨酸的加入对本发明的融合蛋白显示针对搅拌和氧化压力的保护作用，并且，谷氨酸的加入对融合蛋白产生了优秀的针对氧化压力的保护作用。

[表格4]

*注：未受到压力

[表格5]

*注：未受到压力

2.2.通过dls分析进行选择

为了检测包括了表面活性剂、糖和氨基酸的各种赋形剂对经修饰的il-7融合蛋白的稳定性的作用，通过在实验实施例1.2中描述的方法进行了dls分析。粒径和zeta电位的检测分别进行了3次。

图4和表格6示出了mgm-il-7-hyfc融合蛋白在受到搅拌和氧化压力时在ph5.0的柠檬酸钠缓冲液中的z-平均尺寸。

[表格6]

*注：未受到压力

如图4a所示，在3次的粒径检测中，对照组只显示了单个窄峰。然而，在受到搅拌压力的搅拌对照组中，在尺寸为100nm时显示了另外一个峰。在这个对照组中，z-平均尺寸从11.29nm增至19.40nm，并且pdi也从0.07增至0.19，这表明发生了聚集形成。同时，当加入了吐温20、吐温80和伯洛沙姆188，z-平均尺寸分别增加了0.16、0.09、0.31nm，并且，pdi分别增加了0.04、0.04和0.06。z-平均尺寸和pdi的增加意味着搅拌引发了聚集。通过加入表面活性剂而观察到的较小的增加，表明了表面活性剂对蛋白质具有防止聚集形成的保护作用。如图4b所示，当加入了表面活性剂，没有观察到聚集峰。

在受到氧化压力的氧化对照组中，在尺寸为1000nm时显示了一个额外的峰，而z-平均尺寸和pdi分别从11.29nm增至177.10nm和从0.07增至0.85。这个结果表明，通过氧化形成了聚集体，并且该形成的聚集体大于通过搅拌所形成的聚集体。如图4c所示，当分别加入了蔗糖、山梨糖醇和甘氨酸，也观察到了聚集体峰，但是，当加入了谷氨酸，没有形成聚集体。在加入了谷氨酸的样本中，z-平均尺寸增加了0.17nm，pdi没有变化。这个结果表明，当在ph5.0的柠檬酸钠缓冲液中加入了谷氨酸，它对mgm-il-7-hyfc融合蛋白具有优秀的针对氧化压力的保护作用。同时，当加入了蔗糖、山梨糖醇和甘氨酸，z-平均尺寸分别增加了1.27nm、2.22nm和39.06nm，并且pdi分别增加了0.11、0.18和0.45，与加入了其他赋形剂的样本相比，它们被认为很小。这个结果表明，蔗糖、山梨糖醇和甘氨酸对本发明的融合蛋白具有针对氧化压力的保护作用，这与实验实施例2.1的结果相一致。

同时，图5和表格7示出了mgm-il-7-hyfc融合蛋白在受到搅拌和氧化压力时在ph5.0的组氨酸-醋酸盐缓冲液中的z-平均尺寸。

[表格7]

*注：未受到压力

如图5a所示，对照组和搅拌对照组显示了单个窄峰，这不同于在柠檬酸钠缓冲液中的搅拌对照组的结果。然而，如图5b所示，当加入了甘氨酸，观察到了聚集体峰，但是，当加入了诸如吐温20、吐温80和伯洛沙姆188的表面活性剂时，没有观察到聚集体峰，并且z-平均尺寸和pdi没有改变。这个结果表明，当在mgm-il-7-hyfc融合蛋白制剂中加入了甘氨酸，通过搅拌能够发生聚集体形成。

如图5c所示，当加入了蔗糖，通过氧化，z-平均尺寸和pdi分别从11.21nm增至12.47nm，和从0.17增至0.22。这两个变化均小于对照组，这表明，蔗糖对蛋白质具有针对氧化压力的保护作用，但是会导致聚集体形成的问题。同时，当加入了山梨糖醇，z-平均尺寸和pdi分别从12.02nm降至11.61nm，和从0.13降至0.09，而没有发现聚集体峰。z-平均尺寸和pdi的降低意味着片段的增加，既使不显著地。当加入了谷氨酸，z-平均尺寸和pdi小幅度地增加，而没有发现聚集体或者片段。

因此，经发现，诸如吐温20、吐温80和伯洛沙姆188的表面活性剂对本发明的融合蛋白具有针对氧化或者搅拌压力的保护作用；诸如蔗糖和山梨糖醇的糖或者糖醇显示了针对氧化压力的保护作用；并且，根据基础缓冲液，氨基酸具有不同的作用，但是总体而言，谷氨酸显示了较高的保护作用。

实验实施例3：赋形剂的组合

根据实验实施例2的结果，吐温80和蔗糖被选为赋形剂，它们对经修饰的il-7融合蛋白分别具有针对搅拌和氧化压力的保护作用。在组合这两种赋形剂的实验中，使用了软件designofexperiment(design-expert,stat-easeinc.,u.s.a.)。表格8示出了这两种赋形剂的组合，并且检测了它们对经修饰的il-7融合蛋白的稳定性的作用。本实验实施例中的压力条件与实验实施例2.1.中的相同，并且，在制剂中的经修饰的il-7融合蛋白的最终浓度被调节至3～100mg/ml。

[表格8]

为了检测针对压力条件的保护作用，[使用高效液相色谱(hplc)系统(waterse2695，u.s.a.)在吸收光谱的uv波长为214nm时]进行了尺寸排阻色谱法，其hplc条件与实验实施例2.1相同。

首先，对含有浓度为3mg/ml的经修饰的il-7融合蛋白的制剂进行了实验。如表格9所示，结果是，在柠檬酸钠缓冲液中的对照组的单体含量为95.65％，搅拌使它降至74.77％，并且氧化使它降至49.81％。加入了吐温80的样本显示了针对搅拌压力的保护作用，而那些加入了蔗糖的样本显示了针对氧化压力的保护作用。组合地加入了吐温80和蔗糖的样本显示了针对搅拌压力和氧化压力的保护作用。

[表格9]

*注：未受到压力

同时，如表格10所示，在组氨酸-醋酸盐缓冲液中的对照组的单体含量为95.46％，搅拌使它降至93.60％，并且氧化使它降至50.63％。与柠檬酸钠缓冲液相比，组氨酸-醋酸盐缓冲液显示了更优秀的针对搅拌压力的保护作用，并且这些加入的赋形剂的保护作用类似于它们在柠檬酸钠样本中的作用。

[表格10]

*注：未受到压力

根据这些结果选择了赋形剂的条件。为了获得注射的适当渗透强度，进一步地加入了山梨糖醇和甘露醇，并且进行了搅拌压力和氧化压力实验，并且还在加入了1.5w/v％山梨糖醇的条件下进行了附加实验。

分别针对柠檬酸钠缓冲液和组氨酸-醋酸盐缓冲液的候选制剂是，在mgm-il-7-hyfc融合蛋白的制剂中加入5w/v％蔗糖、1.5w/v％山梨糖醇和0.05w/v％吐温80。使用上述制剂，进行了冻结/解冻、温度压力和氧化压力实验。这些压力条件见表格11，其分析结果见表格12。

[表格11]

[表格12]

表格12示出了使用候选制剂的压力检测结果，在使用了柠檬酸钠缓冲液的情况下，对照组的单体含量为95.76％,并且观察到了由于压力而引起的3％的变化。

在使用了组氨酸-醋酸盐缓冲液的情况下，对照组的单体含量为95.59％,并且观察到了由于压力而引起的1％的变化，这表明了，它具有略好于柠檬酸钠缓冲液的保护作用。

检测了候选制剂对各种环境下的经修饰的il-7融合蛋白的作用。首先，制备了包含3～100mg/ml经修饰的il-7融合蛋白、20mm柠檬酸钠和5w/v％蔗糖的制剂。随后在其中加入了1～2w/v％山梨糖醇或者甘露醇(作为糖醇)和0.05w/v％吐温80或者伯洛沙姆(作为表面活性剂)，并且调节最终ph至5.0。结果表明，3～100mg/ml的经修饰的il-7融合蛋白在各种组合条件下都被很好地保护。

序列表

<110>格纳西尼有限公司

<120>经修饰的白细胞介素-7融合蛋白的制剂

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argasnthrglyargglyglygluglulyslyslysglulysglulys

151015

glugluglnglugluarggluthrlysthrproglucysproserhis

202530

thrglnproleuglyvalpheleupheproprolysprolysaspthr

354045

leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

505560

serglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspglyval

65707580

gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasnser

859095

thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu

100105110

asnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproser

115120125

serileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglupro

130135140

glnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthrlysasngln

145150155160

valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala

165170175

valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr

180185190

proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserargleu

195200205

thrvalasplysserargtrpglngluglyasnvalphesercysser

210215220

valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser

225230235240

leuserleuglylys

245

<210>8

<211>400

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>经修饰的il-7(mgm)融合的hyfc的氨基酸序列

<400>8

metglymetaspcysaspilegluglylysaspglylysglntyrglu

151015

servalleumetvalserileaspglnleuleuaspsermetlysglu

202530

ileglyserasncysleuasnasnglupheasnphephelysarghis

354045

ilecysaspalaasnlysgluglymetpheleupheargalaalaarg

505560

lysleuargglnpheleulysmetasnserthrglyasppheaspleu

65707580

hisleuleulysvalsergluglythrthrileleuleuasncysthr

859095

glyglnvallysglyarglysproalaalaleuglyglualaglnpro

100105110

thrlysserleuglugluasnlysserleulysgluglnlyslysleu

115120125

asnaspleucyspheleulysargleuleuglngluilelysthrcys

130135140

trpasnlysileleumetglythrlysgluhisargasnthrglyarg

145150155160

glyglygluglulyslyslysglulysglulysglugluglngluglu

165170175

arggluthrlysthrproglucysproserhisthrglnproleugly

180185190

valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg

195200205

thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserglngluasppro

210215220

gluvalglnpheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala

225230235240

lysthrlysproargglugluglnpheasnserthrtyrargvalval

245250255

servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr

260265270

lyscyslysvalserasnlysglyleuproserserileglulysthr

275280285

ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu

290295300

proproserglngluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcys

305310315320

leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser

325330335

asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp

340345350

seraspglyserphepheleutyrserargleuthrvalasplysser

355360365

argtrpglngluglyasnvalphesercysservalmethisgluala

370375380

leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserleuglylys

385390395400

<210>9

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>9

metmetmetmet

1

<210>10

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>10

glymetmetmet

1

<210>11

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>11

metglymetmet

1

<210>12

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>12

metmetglymet

1

<210>13

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>13

metmetmetgly

1

<210>14

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>14

glyglymetmet

1

<210>15

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>15

metglyglymet

1

<210>16

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>16

metmetglygly

1

<210>17

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>17

glymetglymet

1

<210>18

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>18

metglymetgly

1

<210>19

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>19

glymetmetgly

1

<210>20

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>20

glyglyglymet

1

<210>21

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>21

metglyglygly

1

<210>22

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>22

glymetglygly

1

<210>23

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>23

glyglymetgly

1

<210>24

<211>4

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>24

glyglyglygly

1

<210>25

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>25

metmetmetmetmet

15

<210>26

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>26

glymetmetmetmet

15

<210>27

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>27

glyglymetmetmet

15

<210>28

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>28

glyglyglymetmet

15

<210>29

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>29

glyglyglyglymet

15

<210>30

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>30

metglymetmetmet

15

<210>31

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>31

metglyglymetmet

15

<210>32

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>32

metglyglyglymet

15

<210>33

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>33

metglyglyglygly

15

<210>34

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>34

metmetglymetmet

15

<210>35

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>35

metmetglyglymet

15

<210>36

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>36

metmetglyglygly

15

<210>37

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>37

metmetmetglymet

15

<210>38

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>38

metmetmetglygly

15

<210>39

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>39

metmetmetmetgly

15

<210>40

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>40

metglyglyglymet

15

<210>41

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>41

metglymetglymet

15

<210>42

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>42

glymetglymetgly

15

<210>43

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>43

glymetmetmetgly

15

<210>44

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>44

glyglymetglymet

15

<210>45

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>45

glyglymetmetgly

15

<210>46

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>46

metglyglymetgly

15

<210>47

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>47

metglymetglygly

15

<210>48

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>48

glymetmetglymet

15

<210>49

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>49

metglymetmetgly

15

<210>50

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>50

glymetglyglymet

15

<210>51

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>51

metmetglymetgly

15

<210>52

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>52

glymetmetglygly

15

<210>53

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>53

glymetglyglygly

15

<210>54

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>54

glyglymetglygly

15

<210>55

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>55

glyglyglymetgly

15

<210>56

<211>5

<212>prt

<213>人工序列()

<220>

<223>与il-7结合的寡肽

<400>56

glyglyglyglygly

15