蛋白A结合多肽、抗EPHA2抗体及其使用方法与流程

本申请要求2016年3月16日提交的美国临时申请no.62/309,365和2016年3月16日提交的美国临时申请no.62/309,383和2016年3月16日提交的美国临时申请no.62/309,374的优先权，各美国临时申请以引用的方式整体并入本文。引言癌细胞往往异常表达多种蛋白质，包括表达或过度表达某些细胞表面抗原，例如细胞表面受体。可以采用此类异常表达的蛋白质作为治疗抗体的标靶，而且已经利用对许多癌症上表达的细胞表面受体具有特异性的抗体来开发靶向性免疫治疗剂。许多此类治疗剂(包括抗体-药物缀合物，包括免疫脂质体和免疫毒素)和抗体靶向性核酸递送媒剂需要不仅能结合细胞表面抗原而且在结合后内在化至细胞中的抗体。举例来说，目前使用已经与化学治疗剂缀合的能识别由癌细胞表达的细胞表面受体的抗体来治疗霍奇金氏淋巴瘤(本妥昔单抗(brentuximabvedotin))和转移性乳腺癌(腺苷-曲妥珠单抗美坦辛(ado-trastuzumabemtansine))。因为已知异常表达于若干种癌症中而正被考虑用于治疗靶向的一种细胞表面受体是epha2。如us9,220,772中所描述，使用多步骤筛选方法来分离抗epha2scfv抗体，所述多步骤筛选方法包括首先进行一般噬菌体选择以便使用人乳腺癌细胞使抗体内在化，然后针对与表达epha2细胞外域的酵母的结合进行选择。抗体d2-1a7被鉴定为由表达epha2的细胞强力内在化的配体阻断性scfv。抗体稳定性是一种允许稳固而且可规模化的抗体制造方法的有用性质。另外，为了促进制造用于治疗用途的抗体，需要抗体能够用亲和力树脂进行提纯。对于大部分治疗抗体，金黄色葡萄球菌蛋白a亲和力色谱是早期重要步骤，因为它可以选择性地而且有效地从复杂溶液如所收集的细胞培养液中结合抗体，从而在单个步骤中便去除>99.5％的产物杂质并且提供显著的病毒清除率。持续需要结合至细胞表面受体且表现出适用于工业生产和医学使用的稳定性以及其他可制造性质的新抗体。本文所公开的新颖工程改造抗体解决了这一需要并且提供了额外的优点。概要本公开提供了诸多抗体(例如scfv)，所述抗体包括赋予所述抗体以有用性质的cdr和人构架区。在某些实施方案中，此类性质包括热稳定性(例如解链温度增高)、与金黄色葡萄球菌蛋白a有效结合或二者。在某些方面，所述抗体是特异性地结合至肿瘤相关抗原epha2的内在化抗体。本公开提供了热稳定(表现出≥67℃或≥70℃的解链温度)的内在化抗epha2抗体(ab)(例如scfv)。还提供了对金黄色葡萄球菌蛋白a表现出实质性结合(例如，达到使负载至金黄色葡萄球菌蛋白a(在下文中，“蛋白a”)树脂上的ig中有至少50％、60％或70％结合至并且被保留在所述树脂上的程度，例如，使用实施例1的测定法)的ab(例如scfv)。提供了赋予所期望的蛋白a结合性质的多肽以及含有此类蛋白a结合多肽的抗体(例如scfv)；赋予所期望的蛋白a结合性质的vhcdr2多肽以及含有其的抗体(例如scfv)；提供所期望的热稳定性质的vh和vl构架多肽(包括共有框架区序列)以及具有此类构架序列的抗体(例如scfv)；以及具有此类蛋白a结合多肽、vhcdr2多肽和热稳定性增强构架的组合的ab(例如scfv)。另外，所公开的ab表现出对于工业规模脂质体缀合和其他制造方法以及对于治疗用途来说理想的其他性质。因此，公开了针对工业制造和针对医学使用而设计并调整的抗epha2抗体以及相关缀合物、组合物和使用方法。使用方法涵盖用作脂质体治疗剂的靶向组分以及用作诊断剂和用于筛选方法中。因此，本公开提供了一种抗a型ephrin受体2(epha2)抗体，所述抗体包含：vh，所述vh包含：vhcdr1，所述vhcdr1包含氨基酸序列syamh(seqidno:17)；vhcdr2，所述vhcdr2包含以下具有17个氨基酸的序列：x17ispx18gx19nx20yyadsvkg(seqidno:18)，其中：x17是a或v；x18是a、d、h、n、p、s或t；x19是a、r、h、n或p；且x20是k或t；和vhcdr3，所述vhcdr3包含氨基酸序列asvgatgpfdi(seqidno:19)；以及vl，所述vl包含：vlcdr1，所述vlcdr1包含氨基酸序列qgdslrsyyas(seqidno:20)；vlcdr2，所述vlcdr2包含氨基酸序列gennrps(seqidno:21)；和vlcdr3，所述vlcdr3包含氨基酸序列nsrdssgthltv(seqidno:22)；其中所述抗体免疫特异性地结合epha2的细胞外域。本公开还提供了结合蛋白a的多肽，其中所述多肽包含具有下式的氨基酸序列：a)xax17isxbx18gx19nx20(seqidno:198)，其中xa是s、t或a；x17是a或v；xb是p、r、n或h；x18和x19是任何氨基酸，并且在一些实施方案中，x18是a、d、h、n、p、s或t；和/或其中x19是a、r、h、n或p；并且x20是k或t；b)xavisxbx18gx19nx20(seqidno:199)，其中xa是s或t；xb是p、r或n；x18是任何氨基酸，并且在一些实施方案中是a、d、h、n、p、s或t；x19是h、n、r、t、a、d、p或s；并且x20是k或t；c)xavisxbx18gx19nx20(seqidno:200)，其中xa是s或t；xb是p、r或n；x18是任何氨基酸，并且在一些实施方案中是a、d、h、n、p、s或t；x19是h、n、r或t；并且x20是t或k；或d)xax17isxbx18gx19nx20(seqidno:201)，其中xa是s或t；x17是v；xb是p；x18是任何氨基酸，并且在一些实施方案中是a、d、h、n、p、s或t；x19是h、n、r或t，并且在一些实施方案中是a、r、h、n或p；并且x20是t或k。在相关实施方案中，所述蛋白a结合多肽包含氨基酸序列seqidno:177-197之一。在一些实施方案中，所述蛋白a结合多肽包含：vhcdr1，所述vhcdr1包含氨基酸序列syamh(seqidno:17)；蛋白a结合序列，所述蛋白a结合序列包含氨基酸序列seqidno:177至201之一；和vhcdr3，所述vhcdr3包含氨基酸序列asvgatgpfdi(seqidno:19)。本公开还提供了包含vh和vl的抗体，其中所述vh包含如上文所描述的蛋白a结合多肽。在某些实施方案中，所述抗体包含以下至少一个构架区：(a)人vh构架区1(vhfr1)，所述人vhfr1包含氨基酸序列qvqlvx1sggglvqpggslrlscaasgftfs(seqidno:1)，其中x1是除e以外的氨基酸，和/或(b)人vh构架区2(vhfr2)，所述人vhfr2包含氨基酸序列wvrqapgkglewvx2(seqidno:2)，其中x2是除s以外的氨基酸；或其中所述抗体包含：蛋白a结合多肽，所述蛋白a结合多肽包含氨基酸序列seqidno:177-201之一；人vh构架区2(vhfr2)，所述人vhfr2包含氨基酸序列wvrqapgkglewv(seqidno:202)，和/或(c)人vl构架区1(vlfr1)，所述人vlfr1包含氨基酸序列x3sx4ltqppsvsx5apgqx6vtix7c(seqidno:3)，其中：x3是除q以外的氨基酸，x4是除v以外的氨基酸，x5是除g以外的氨基酸，x6是除r以外的氨基酸，并且x7是除s以外的氨基酸，和/或(d)人vl构架区1(vlfr1)，所述人vlfr1包含氨基酸序列x8svltqppsvsgapgqrvtix9c(seqidno:4)，其中：x8是除q以外的氨基酸，或x9是除s以外的氨基酸，和/或(e)人vl构架区2(vlfr2)，所述人vlfr2包含氨基酸序列wyqqx10pgtapklliy(seqidno:5)，其中x10是除l以外的氨基酸，和/或(f)人vl构架区3(vlfr3)，所述人vlfr3包含氨基酸序列gvpdrfsgx11x12sgtsaslx13itgx14qaedeadyyc(seqidno:6)，其中：x11是除f以外的氨基酸，x12是除k以外的氨基酸，x13是除a以外的氨基酸，或x14是除l以外的氨基酸，和/或(g)人vl构架区3(vlfr3)，所述人vlfr3包含氨基酸序列gvpdrfsgx15x16sgtsaslaitglqaedeadyyc(seqidno:7)，其中：x15是除f以外的氨基酸，或x16是除k以外的氨基酸。在某些实施方案中，所述抗体包含vhfr1，所述vhfr1包含氨基酸序列qvqlvqsggglvqpggslrlscaasgftfs(seqidno:8)。在某些实施方案中，所述抗体包含vhfr2，所述vhfr2包含氨基酸序列wvrqapgkglewva(seqidno:9)或wvrqapgkglewvt(seqidno:10)。在某些实施方案中，所述抗体包含vlfr1，其中所述vlfr1包含氨基酸序列x3sx4ltqppsvsx5apgqx6vtix7c(seqidno:3)，并且其中x3是除q以外的氨基酸，x4是除v以外的氨基酸，x5是除g以外的氨基酸，x6是除r以外的氨基酸，并且x7是除s以外的氨基酸。在某些实施方案中，所述抗体包含vlfr1，所述vlfr1包含氨基酸序列x3sx4ltqppsvsx5apgqx6vtix7c(seqidno:3)，并且其中x3是s，x4是e，x5是v，x6是t，并且x7是t。在某些实施方案中，所述抗体包含vlfr1，所述vlfr1包含氨基酸序列x8svltqppsvsgapgqrvtix9c(seqidno:4)，并且其中x8是除q以外的氨基酸，且x9是除s以外的氨基酸。在某些实施方案中，所述抗体包含vlfr1，所述vlfr1包含氨基酸序列x8svltqppsvsgapgqrvtix9c(seqidno:4)，并且其中x8是s或x9是t。在某些实施方案中，所述抗体包含vlfr1，所述vlfr1包含氨基酸序列x8svltqppsvsgapgqrvtix9c(seqidno:4)，并且其中x8是s且x9是t。在某些实施方案中，所述抗体包含vlfr2，所述vlfr2包含氨基酸序列wyqqx10pgtapklliy(seqidno:5)，并且其中x10是除l以外的氨基酸。在某些实施方案中，所述抗体包含vlfr2，所述vlfr2包含氨基酸序列wyqqx10pgtapklliy(seqidno:5)，并且其中x10是k。在某些实施方案中，所述抗体包含vlfr3，所述vlfr3包含氨基酸序列gvpdrfsgx11x12sgtsaslx13itgx14qaedeadyyc(seqidno:6)，并且其中x11是除f以外的氨基酸，x12是除k以外的氨基酸，x13是除a以外的氨基酸，且x14是除l以外的氨基酸。在某些实施方案中，所述抗体包含vlfr3，所述vlfr3包含氨基酸序列gvpdrfsgx11x12sgtsaslx13itgx14qaedeadyyc(seqidno:6)，并且其中x11是s，x12是s，x13是t，或x14是a。在某些实施方案中，所述抗体包含vl构架区3(vlfr3)，所述vlfr3包含氨基酸序列gvpdrfsgx15x16sgtsaslaitglqaedeadyyc(seqidno:7)，其中：x15是除f以外的氨基酸，并且x16是除k以外的氨基酸。在某些实施方案中，所述抗体包含vlfr3，所述vlfr3包含氨基酸序列gvpdrfsgx15x16sgtsaslaitglqaedeadyyc(seqidno:7)，其中：x15是s或x16是g。在某些实施方案中，所述抗体包含vl构架区3(vlfr3)，所述vlfr3包含氨基酸序列gvpdrfsgx15x16sgtsaslaitglqaedeadyyc(seqidno:7)，其中：x15是s且x16是g。在某些实施方案中，所述抗体包含：vh构架区1(vhfr1)，所述人vhfr1包含氨基酸序列qvqlvx1sggglvqpggslrlscaasgftfs(seqidno:1)，其中x1是除e以外的氨基酸；vh构架区2(vhfr2)，所述人vhfr2包含氨基酸序列wvrqapgkglewvx2(seqidno:2)，其中x2是除s以外的氨基酸；vl构架区1(vlfr1)，所述人vlfr1包含氨基酸序列x3sx4ltqppsvsx5apgqx6vtix7c(seqidno:3)，其中x3是除q以外的氨基酸，x4是除v以外的氨基酸，x5是除g以外的氨基酸，x6是除r以外的氨基酸，并且x7是除s以外的氨基酸；vl构架区2(vlfr2)，所述人vlfr2包含氨基酸序列wyqqx10pgtapklliy(seqidno:5)，其中x10是除l以外的氨基酸；和vl构架区3(vlfr3)，所述人vlfr3包含氨基酸序列gvpdrfsgx11x12sgtsaslx13itgx14qaedeadyyc(seqidno:6)，其中x11是除f以外的氨基酸，x12是除k以外的氨基酸，x13是除a以外的氨基酸，并且x14是除l以外的氨基酸。在某些实施方案中，所述抗体包含：vh构架区1(vhfr1)，所述人vhfr1包含氨基酸序列qvqlvx1sggglvqpggslrlscaasgftfs(seqidno:1)，其中x1是除e以外的氨基酸；vh构架区2(vhfr2)，所述人vhfr2包含氨基酸序列wvrqapgkglewvx2(seqidno:2)，其中x2是除s以外的氨基酸；vl构架区1(vlfr1)，所述人vlfr1包含氨基酸序列x8svltqppsvsgapgqrvtix9c(seqidno:4)，其中：x8是除q以外的氨基酸，或x9是除s以外的氨基酸；和vl构架区3(vlfr3)，所述人vlfr3包含氨基酸序列gvpdrfsgx15x16sgtsaslaitglqaedeadyyc(seqidno:7)，其中：x15是除f以外的氨基酸，并且x16是除k以外的氨基酸。在某些实施方案中，如使用差示扫描荧光测定法所测量，所述抗体具有67℃或更高的解链温度(tm)。在某些实施方案中，所述抗体是单链fv(scfv)、igg、fab、(fab)2或(scfv')2。在某些实施方案中，所述抗体是scfv。在某些实施方案中，所述抗体包含人抗体序列。在某些实施方案中，所述抗体是scfv，所述scfv包含vh、vl和构架，其中：所述vh包含：vhcdr1，所述vhcdr1具有氨基酸序列syamh(seqidno:17)；vhcdr2，所述vhcdr2具有以下18个氨基酸序列之一：(i)vispagnntyyadsvk(seqidno:23)；(ii)vispagrnkyyadsvk(seqidno:24)；(iii)vispdghntyyadsvk(seqidno:25)；(iv)visphgrnkyyadsvk(seqidno:26)；(v)visrrgdnkyyadsvk(seqidno:27)；(vi)visnnghnkyyadsvk(seqidno:28)；(vii)vispagpntyyadsvk(seqidno:29)；(viii)vispsghntyyadsvk(seqidno:30)；(ix)vispnghntyyadsvk(seqidno:31)；(x)aisppghntyyadsvk(seqidno:32)；(xi)visptgantyyadsvk(seqidno:33)；(xii)visphgsnkyyadsvk(seqidno:34)；(xiii)visnnghntyyadsvk(seqidno:35)；(xiv)vispagtntyyadsvk(seqidno:36)；(xv)visppghntyyadsvk(seqidno:37)；(xvi)vishdgtntyyadsvk(seqidno:38)；(xvii)visrhgnnkyyadsvk(seqidno:39)；或(xviii)visydgsnkyyadsvk(seqidno:40)；和vhcdr3，所述vhcdr3具有氨基酸序列asvgatgpfdi(seqidno:19)；其中所述vhcdr按以下氨基末端至羧基末端顺序存在：vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3；并且，所述vl包含：vlcdr1，所述vlcdr1具有氨基酸序列qgdslrsyyas(seqidno:20)；vlcdr2，所述vlcdr2具有氨基酸序列gennrps(seqidno:21)；和vlcdr3，所述vlcdr3具有氨基酸序列nsrdssgthltv(seqidno:22)；并且其中所述vlcdr按以下氨基末端至羧基末端顺序存在：vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3；所述scfv构架包含：vhfr1qvqlvqsggglvqpggslrlscaasgftfs(seqidno:8)vhfr2wvrqapgkglewva(seqidno:9)vhfr3rftisrdnskntlylqmnslraedtavyycar(seqidno:11)vhfr4wgqgtlvtvss(seqidno:12)vlfr1sseltqppsvsvapgqtvtitc(seqidno:13)vlfr2wyqqkpgtapklliy(seqidno:14)vlfr3gvpdrfsgsssgtsasltitgaqaedeadyyc(seqidno:15)和vlfr4fgggtkltvlg(seqidno:16)并且其中所述抗体免疫特异性地结合a型ephrin受体2(epha2)的细胞外域。在某些实施方案中，所述scfvvh相对于所述vl处于氨基末端。在某些实施方案中，所述scfv表现出至少约67℃的tm。在某些实施方案中，所述scfv表现出至少约70℃的tm。在某些实施方案中，所述scfv包含接合vh与vl的接头，其中所述接头包含选自以下的氨基酸序列：astggggsggggsggggsggggs(seqidno:41)；ggggsggggsggggsggggs(seqidno:42)；ggggsggggsggggs(seqidno:43)；astggggaggggaggggagggga(seqidno:44)；ggggaggggaggggagggga(seqidno:45)；tpshnshqvpsaggptansgtsgs(seqidno:46)；和ggssrssssggggsgggg(seqidno:47)。在某些实施方案中，所述scfv接头包含氨基酸序列astggggsggggsggggsggggs(seqidno:41)。在某些实施方案中，所述抗体包含vh和vl，其中所述vh包含与vh和vl的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述vh包含与seqidno:133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173或175的氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在相关实施方案中，这些抗体的vl可以包含与seqidno:134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174或176的氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体在c末端包含glyglyserglyglycys(seqidno:54)。在某些实施方案中，本公开提供了一种抗体缀合物，所述抗体缀合物包含如本文所公开的抗体和与所述抗体缀合的部分。在某些实施方案中，所述部分是脂质纳米粒子。在某些实施方案中，所述脂质纳米粒子是脂质体。在某些实施方案中，所述部分包含聚乙二醇(peg)。在某些实施方案中，所述部分包含治疗剂。在某些实施方案中，所述治疗剂是细胞毒性剂。在某些实施方案中，所述部分包含可检测标记。在某些实施方案中，所述可检测标记是体内成像剂。在某些实施方案中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含本公开的抗体或缀合物和医药学上可接受的载体。在某些实施方案中，所述组合物经配制以供肠胃外施用。在某些实施方案中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含处于容器中的本公开的组合物。在某些实施方案中，本公开提供了编码本公开的scfv的分离的核酸。在某些实施方案中，本公开提供了编码本公开的抗体的可变轻链多肽、可变重链多肽或二者的分离的核酸。在某些实施方案中，本公开提供了一种表达载体，所述表达载体包含本公开的核酸和与所述核酸可操作地连接的真核生物启动子。在某些实施方案中，本公开提供了一种非人宿主细胞，所述非人宿主细胞包含本公开的表达载体。在某些实施方案中，所述细胞表达可变轻链多肽、可变重链多肽或二者。在某些实施方案中，本公开提供了一种治疗患有表达epha2的癌症的受试者的方法，所述方法包括向患有表达epha2的癌症的受试者施用本公开的抗体、抗体缀合物或者包含抗体和/或抗体缀合物的组合物。在某些实施方案中，本公开提供了一种组合物，所述组合物用于治疗表达epha2的癌症，其中所述组合物包含本公开的抗体和/或抗体缀合物。本公开提供了一种组合物用于治疗表达epha2的癌症的用途，其中所述组合物包含本公开的抗体和/或抗体缀合物。附图简单描述图3和图4中以数字1至22标示的scfv包含序列表中标示为scfv1至scfv22的相应氨基酸序列，并且将同一标示方案用于编码scfv1至scfv22的氨基酸序列的核酸序列。所述核酸序列还编码被表达所编码的scfv的哺乳动物(例如人或嚙齿动物)细胞切割掉的n末端前导序列。在用于图1、图3和图4中时，“f5”表示scfvf5。“ts1”表示scfvts1。“ts1*”表示scfvts1*(注意，ts1*的vl与ts1的vl同一且在图1中如此表示)，并且“a7”表示scfvd2-1a7。图1示出了蛋白a结合测定(参见实施例1)的结果。通过将scfvf5、scfvts1、scfvts1*和d2-1a7的vh区与vl区连接在一起来产生scfv。如该图中所表示，使用蛋白a结合测定来筛选这些混杂scfv以及scfvf5、scfvts1、scfvts1*和d2-1a7。使用表现出理想的蛋白a结合性质的f5scfv作为阳性对照。使用scfvd1-2a7作为阴性对照。图2(图a至图d)示出了经设计而含有scfvts1的cdr-h2变体的超过50,000个独特克隆的一组scfv的facs分选结果。使用靶向诱变来产生cdr-h2变体。图a示出了在一轮facs之后未染色的酵母。图b示出了在一轮facs之后经荧光标记蛋白a(x轴)和针对epha2的ab(y轴)标记的染色的酵母。然后再次分选分离的克隆。图c示出了未染色的酵母，而图d示出了经针对flagtm表位的标记ab(x轴)和针对epha2的标记ab(y轴)染色的酵母。图3示出了epha2的蛋白a结合测定的结果。在哺乳动物瞬时系统中将cdr-h2变体scfv表达为可溶性蛋白质，并且使用蛋白a结合测定来测量蛋白a结合。使用f5scfv作为阳性对照，并且使用ts1作为阴性对照。图4(图a至图c)示出了与表达epha2的细胞系上的ab的结合和内在化有关的数据。使用clia测定(实施例5)在三种细胞系中评估抗体结合并内在化的能力。使用结合至erbb2(而不结合至epha2)的f5scfv作为阴性对照，并且将所有数据针对scfvts1的结合和内在化进行正规化。图5提供了如本文所描述的scfv、scfv接头、n末端肽、c末端标签、具有标签的c末端接头、含c末端半胱氨酸的序列和epha2的实例的序列。在scfv1至scfv22的氨基酸序列中加下划线表示接头的氨基酸序列(astggggsggggsggggsggggs(seqidno:41))，其中相对于加下划线的序列处于n末端的氨基酸序列是vh氨基酸序列，并且相对于加下划线的序列处于c末端的氨基酸序列是vhl.氨基酸序列。详细描述提供了诸多新的有用的抗体(例如，单链抗体，例如scfv)。还提供了包括所述抗体的缀合物、组合物和试剂盒。还提供了使用所述ab，例如，用于制造免疫脂质体的方法。定义如本文所使用，“抗体”(“ab”)是表现出免疫特异性抗原结合，即，由cdr介导的抗原结合的免疫球蛋白(“ig”)或抗原结合ig片段或者包含获自或来源于免疫球蛋白(例如单链抗体，例如单链可变片段(“scfv”))的互补决定区(“cdr”)的其他抗原结合多肽。天然存在的ab通常包含至少四个多肽链，包含至少两个重链与至少两个轻链，但已知某些哺乳动物ab含有单个(轻)链(例如本斯·琼斯氏蛋白)或含有一个轻链与一个重链。重链可以分类为γ、μ、α、δ或ε，这又定义了天然存在的人ig类别，分别是igg、igm、iga、igd和ige。典型igg、igd或ige类ab的实例是具有由两对多肽链构成的四聚体结构单元的ab，每一对具有一个“轻”链和一个“重”链。如本文所使用的“人抗体”(“人ab”)并不要求通过任何特定的方法来产生所述抗体或者要求所述抗体是天然存在的。相反，如本文所使用的的“人抗体”是指抗体、其抗原结合片段或包含人抗体的氨基酸序列(例如cdr、构架)，其中所述cdr和/或构架并不共同存在于自然界中(即，并非天然存在的)。“抗epha2ab”是指免疫特异性地结合epha2，例如epha2的ecd的ab。epha2特异性ab不会免疫特异性地结合epha2蛋白中不存在的抗原。“cdr”表示互补性决定区。“clia”表示螯合配体诱导的内在化测定。“dii5”表示染料1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰菁-5,5'-二磺酸。“dod-tri-nta”表示如以下文献中所描述的二(十八烷基)氨基-三-nta化合物(化合物12)：huang等,“facilesynthesisofmultivalentnitrilotriaceticacid(nta)andntaconjugatesforanalyticalanddrugdeliveryapplications”,bioconjugatechemistry,2006,第17卷,第1692-1600页。nta表示次氮基三乙酸。“dsf”表示差示扫描荧光测定法。“dspe”表示1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。“ecd”是指跨膜蛋白质的细胞外域。“epha2”是指a型ephrin受体2，也称为“上皮细胞激酶(eck)”，它是可结合ephrin-a配体并且被其激活的呈受体酪氨酸激酶形式的跨膜蛋白质。术语“epha2”可以指epha2的任何天然存在的同功异型体。人epha2的氨基酸序列记录为genbank登记号np_004422.2。“表位”是抗原上与ab免疫特异性地结合的位点，例如epha2ecd上的位点。表位可以由连续氨基酸或者通过形成蛋白质的多肽链的折叠(例如三级折叠)而毗邻的非连续氨基酸形成。“fab”表示ig的抗原结合片段(不考虑如何制备)，包括可变域和第一恒定域。“facs”表示荧光激活型细胞分选。“his6”表示六组氨酸肽。“hspc”表示氢化大豆磷脂酰胆碱。“ig”表示免疫球蛋白。ig轻链或重链可变区由多个“构架”区(fr)与三个高变区(也称为“互补性决定区”或“cdr”)交替构成。可以基于与公开数据库中所发现的序列的同源性来定义构架区和cdr的程度。参见例如“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest”,e.kabat等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第4版.u.s.dept.healthandhumanservices,publichealthservices,bethesda,md(1987)。本文所使用的所有ab序列编号都如kabat等所定义。“igg”表示g同型免疫球蛋白。“分离的”是相关实体(例如蛋白质，例如ab)处于与所述实体可能天然存在或者制造或合成其的环境不同的环境中。“分离的”实体与制造其的细胞或反应容器中伴随其存在的所有或一些组分分离。标的ab可以是基本上纯的。“基本上纯”可能是指总组成的至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或超过99％是相关实体(例如，本文所公开的抗epha2ab)的组合物。“mal-peg-dspe”表示马来酰亚胺基-peg(2000)-dspe(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-n-[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000]。“mfi”表示中值荧光强度。“nta(ni)”表示次氮基三乙酸镍。“pbs”表示磷酸盐缓冲生理盐水。“peg”表示聚乙二醇。“peg-dspe”表示甲氧基-peg(2000)-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。“scfv”表示单链fv，它是由单个多肽链构成的蛋白质，其中vh和vl典型地经由接头肽彼此共价连接，从而允许形成由vh和vlcdr构成的功能抗原结合位点。“sec”表示体积排阻色谱。“sm”表示鞘磷脂。“tm”表示解链温度。“ts1”表示如以下所公开的scfv-ts1。“ts1*”表示如以下所公开的scfv-ts1*。“vh”表示ig重链可变区，它还可以称为vh多肽。“vl”表示ig轻链可变区，它还可以称为vl多肽。抗体本公开提供了诸多抗epha2ab，所述抗epha2ab包括赋予所述ab以有用性质的构架序列和cdr序列。尽管实施例中所阐述的ab是scfv，但本文所公开的cdr和人构架序列可以容易地而且有利地并入iga、igd、ige、igg和igmab中。在某些实施方案中，此类性质包括稳定性(例如热稳定性，例如高于65℃、高于或等于67℃或者至少约70℃的解链温度)；≥30％、≥40％或≥50％蛋白a结合；或二者。构架区在某些实施方案中，本文所公开的scfv包括vhfr1、vhfr2、vhfr3、vlfr1、vlfr2和vlfr3之一或任何组合，其中：所述vhfr1是人vhfr1，所述人vhfr1包含氨基酸序列qvqlvx1sggglvqpggslrlscaasgftfs(seqidno:1)，其中x1是除e以外的氨基酸，并且在某些实施方案中x1是q；所述vhfr2是人vhfr2，所述人vhfr2包含氨基酸序列wvrqapgkglewvx2(seqidno:2)，其中x2是除s以外的氨基酸，并且在某些实施方案中x2是a；所述vlfr1是人vlfr1，所述人vlfr1包含氨基酸序列x3sx4ltqppsvsx5apgqx6vtix7c(seqidno:3)，其中：x3是除q以外的氨基酸，x4是除v以外的氨基酸，x5是除g以外的氨基酸，x6是除r以外的氨基酸，并且x7是除s以外的氨基酸；并且在某些实施方案中，x4是v，x5是g，并且x6是r；在某些实施方案中，所述vlfr1是人vlfr1，所述人vlfr1包含氨基酸序列x8svltqppsvsgapgqrvtix9c(seqidno:4)，其中x8是除q以外的氨基酸，并且其中x9是除s以外的氨基酸，并且在某些实施方案中，x8是s和/或x9是t；所述vlfr2是人vlfr2，所述人vlfr2包含氨基酸序列wyqqx10pgtapklliy(seqidno:5)，其中x10是除l以外的氨基酸，和/或在某些实施方案中x10是k；并且，所述vlfr3是人vlfr3，所述人vlfr3包含氨基酸序列gvpdrfsgx11x12sgtsaslx13itgx14qaedeadyyc(seqidno:6)，其中：x11是除f以外的氨基酸，x12是除k以外的氨基酸，x13是除a以外的氨基酸，或x14是除l以外的氨基酸，并且在某些实施方案中，x11是s，x12是s，x13是t和/或x14是a；在某些实施方案中，所述vlfr3是人vlfr3，所述人vlfr3包含氨基酸序列gvpdrfsgx15x16sgtsaslaitglqaedeadyyc(seqidno:7)，其中：x15是除f以外的氨基酸，或x16是除k以外的氨基酸，并且在某些实施方案中，x15是s和/或x16是g。在某些实施方案中，本文所公开的ab包括表1中所阐述的vhfr1、vhfr2、vhfr3、vlfr1、vlfr2和vlfr3之一或任何组合。在一个实施方案中，所述ab是scfv并且含有表1的所有构架。表1：构架序列的实例vhfr1(seqidno:8)qvqlvqsggglvqpggslrlscaasgftfsvhfr2(seqidno:9)wvrqapgkglewvavhfr2(seqidno:10)wvrqapgkglewvtvhfr3(seqidno:11)rftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarvhfr4(seqidno:12)wgqgtlvtvssvlfr1(seqidno:13)sseltqppsvsvapgqtvtitcvlfr2(seqidno:14)wyqqkpgtapklliyvlfr3(seqidno:15)gvpdrfsgsssgtsasltitgaqaedeadyycvlfr4(seqidno:16)fgggtkltvlg在某些方面，本文所公开的ab(例如scfv)是热稳定的，例如，使得所述ab非常适用于进行稳固且可规模化的制造。如本文所使用，“热稳定”ab是具有70℃或更高解链温度(tm)的ab，例如，如使用差示扫描荧光测定法(dsf)所测量。具有合适的解链温度的实例ab描述于以下实验部分中。在某些实施方案中，本文所公开的ab表现出30％、40％或有利地50％或更大程度的蛋白a结合，例如，如使用实施例1中所描述的测定法所测定。epha2结合特别感兴趣的抗体包括结合至epha2多肽的细胞外域(即，至少跨越genbank登记号np_004422.2或uniprot登记号p29317中所阐述的序列的氨基酸残基25至534的epha2蛋白部分)的抗epha2ab。在某些实施方案中，本文所公开的抗epha2抗体(例如scfv)包括各自具有如表2a中所阐述的序列的vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。在其他实施方案中，所述vhcdr2序列(也称为cdrh2)将是选自表2b中所阐述的18个不同的vhcdr2序列中的任一个。表2a：互补决定区(cdr)vhcdr1(seqidno:17)syamhvhcdr2(seqidno:18)x17ispx18gx19nx20yyadsvkgvhcdr3(seqidno:19)asvgatgpfdivlcdr1(seqidno:20)qgdslrsyyasvlcdr2(seqidno:21)gennrpsvlcdr3(seqidno:22)nsrdssgthltv对于表2a和表3中的vhcdr2：x17是a或v；x18是a、d、h、n、p、s或t；x19是a、r、h或p；并且x20是k或t。在某些实施方案中：x17是a；x18是h或p；或者x19是r或p。在某些实施方案中：x17是v；x18是h或p；x19是r或n；并且x20是k或t。在某些实施方案中：x17是v；x18是h或d；x19是h或n；并且x20是t。合适的vhcdr2序列的十八个具体实例阐述于表2b中：表2b：cdrh2序列本公开所提供的scfv的实例提供于图5中。图5提供了scfv1至scfv22的氨基酸序列以及对应的编码核酸序列。在scfv2至scfv22中的每一者的氨基酸序列中，下划线指示接头的氨基酸序列(astggggsggggsggggsggggs(seqidno:41))。相对于scfv1至scfv22的加下划线氨基酸序列处于n末端的氨基酸序列是scfv的vh多肽的氨基酸序列。相对于scfv1至scfv22的加下划线氨基酸序列处于c末端的氨基酸序列是scfv的vl多肽的氨基酸序列。因此，本公开提供了诸多抗体(包括scfv)，所述抗体具有vh和vl，其中所述vh具有与如图5中所阐述的scfv1至scfv22中的任一者的vh具有至少95％同一性的氨基酸序列。本公开还提供了诸多抗体(包括scfv)，所述抗体包含vh和vl，其中所述vh包含与如图5中所阐述的scfv1至scfv22中的任一者的vh和vl的vh和vl具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。本公开还提供了诸多抗体(诸如scfv)，所述抗体包含vh和vl，其中所述vh和所述vl各自包含图5的scfv的vh和vl的vh和vl的氨基酸序列。图5的scfv1至scfv22的vh和vl的氨基酸序列如下：scfv1的vh和vl(分别是seqidno:133和134)；scfv2的vh和vl(分别是seqidno:135和136)；scfv3的vh和vl(分别是seqidno:137和138)；scfv4的vh和vl(分别是seqidno:139和140)；scfv5的vh和vl(分别是seqidno:141和142)；scfv6的vh和vl(分别是seqidno:143和144)；scfv7的vh和vl(分别是seqidno:145和146)；scfv8的vh和vl(分别是seqidno:147和148)；scfv9的vh和vl(分别是seqidno:149和150)；scfv10的vh和vl(分别是seqidno:151和152)；scfv11的vh和vl(分别是seqidno:153和154)；scfv12的vh和vl(分别是seqidno:155和156)；scfv13的vh和vl(分别是seqidno:157和158)；scfv14的vh和vl(分别是seqidno:159和160)；scfv15的vh和vl(分别是seqidno:161和162)；scfv16的vh和vl(分别是seqidno:163和164)；scfv17的vh和vl(分别是seqidno:165和166)；scfv18的vh和vl(分别是seqidno:167和168)；scfv19的vh和vl(分别是seqidno:169和170)；scfv20的vh和vl(分别是seqidno:171和172)；scfv21的vh和vl(分别是seqidno:173和174)；或scfv22的vh和vl(分别是seqidno:175和176)。本公开还提供了与以下氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性的scfv：seqidno:60[scfv1]、seqidno:62[scfv2]、seqidno:64[scfv3]seqidno:66[scfv4]、seqidno:68[scfv5]、seqidno:70[scfv6]、seqidno:72[scfv7]、seqidno:74[scfv8]、seqidno:76[scfv9]、seqidno:78[scfv10]、seqidno:80[scfv11]、seqidno:82[scfv12]、seqidno:84[scfv13]、seqidno:86[scfv14]、seqidno:88[scfv15]、seqidno:90[scfv16]、seqidno:92[scfv17]、seqidno:94[scfv18]、seqidno:96[scfv19]、seqidno:98[scfv20]、seqidno:100[scfv21]或seqidno:102[scfv22]，以及编码其的核酸。本公开还提供了具有以下氨基酸序列的scfv：seqidno:60[scfv1]、seqidno:62[scfv2]、seqidno:64[scfv3]、seqidno:66[scfv4]、seqidno:68[scfv5]、seqidno:70[scfv6]、seqidno:72[scfv7]、seqidno:74[scfv8]、seqidno:76[scfv9]、seqidno:78[scfv10]、seqidno:80[scfv11]、seqidno:82[scfv12]、seqidno:84[scfv13]、seqidno:86[scfv14]、seqidno:88[scfv15]、seqidno:90[scfv16]、seqidno:92[scfv17]、seqidno:94[scfv18]、seqidno:96[scfv19]、seqidno:98[scfv20]、seqidno:100[scfv21]或seqidno:102[scfv22]，以及编码其的核酸。本公开还提供了可结合蛋白a的多肽，所述多肽可以呈抗体(例如scfv)形式存在并且包含以下氨基酸序列：xax17isxbx18gx19nx20(seqidno:198)，其中xa是s、t或a；x17是a或v；xb是p、r、n或h；x18和x19是任何氨基酸；并且x20是k或t。在一个实施方案中，所述多肽(可以呈抗体(例如scfv)形式存在)包含氨基酸序列seqidno:198，其中x18是a、d、h、n、p、s或t；并且x19是a、r、h、n或p。在一个实施方案中，此类多肽从n末端至c末端包含vhcdr1，所述vhcdr1包含氨基酸序列syamh(seqidno:17)；具有式seqidno:198的蛋白a结合序列，其中x18是任何氨基酸或者是a、d、h、n、p、s或t；并且其中x19是任何氨基酸或者是a、r、h、n或p；和vhcdr3，所述vhcdr3包含氨基酸序列asvgatgpfdi(seqidno:19)。在seqidno:198的多肽呈抗体(例如scfv)形式存在时，所述抗体可以包含：vlcdr1，所述vlcdr1包含氨基酸序列qgdslrsyyas(seqidno:20)；vlcdr2，所述vlcdr2包含氨基酸序列gennrps(seqidno:21)；和vlcdr3，所述vlcdr3包含氨基酸序列nsrdssgthltv(seqidno:22)。在多肽是抗体(例如scfv)的一个实施方案中，所述抗体(例如scfv)包括vhfr1和vhfr2之一或二者，其中所述vhfr1包含氨基酸序列qvqlvx1sggglvqpggslrlscaasgftfs(seqidno:1)，其中x1是除e以外的氨基酸并且在某些实施方案中x1是q；所述vhfr2包含氨基酸序列wvrqapgkglewv(seqidno:202)。此类抗体(例如scfv)还可以包括以下诸项中的一项或多项：vlfr1，所述vlfr1包含氨基酸序列seqidno:3；vlfr2，所述vlfr2包含氨基酸序列seqidno:4；和vlfr3，所述vlfr3包含氨基酸序列seqidno:5；和vlfr3，所述vlfr3包含氨基酸序列seqidno:6。在一个实施方案中，此类抗体(例如scfv)包含表1的vhfr1、vhfr2、vhfr3、vlfr1、vlfr2和vlfr3的任何组合中的一种或多种。本公开还提供了可结合蛋白a的多肽，所述多肽可以呈抗体(例如scfv)形式存在并且包含以下氨基酸序列：xavisxbx18gx19nx20(seqidno:199)，其中xa是s或t；xb是p、r或n；x18是任何氨基酸；x19是h、n、r、t、a、d、p或s；并且x20是k或t。在一个实施方案中，所述多肽(可以呈抗体(例如scfv)形式存在)包含氨基酸序列seqidno:199，其中x18是a、d、h、n、p、s或t。在一个实施方案中，所述多肽(可以呈抗体(例如scfv)形式存在)包含氨基酸序列seqidno:199，其中x18是a、d、h、n、p、s或t；并且x19是a、r、h、n或p。在一个实施方案中，此类多肽从n末端至c末端包含vhcdr1，所述vhcdr1包含氨基酸序列syamh(seqidno:17)；具有式seqidno:199的蛋白a结合序列，其中x18是任何氨基酸或者是a、d、h、n、p、s或t；并且其中x19是任何氨基酸或者是a、r、h、n或p；和vhcdr3，所述vhcdr3包含氨基酸序列asvgatgpfdi(seqidno:19)。在seqidno:199的多肽呈抗体(例如scfv)形式存在时，所述抗体可包含：vlcdr1，所述vlcdr1包含氨基酸序列qgdslrsyyas(seqidno:20)；vlcdr2，所述vlcdr2包含氨基酸序列gennrps(seqidno:21)；和vlcdr3，所述vlcdr3包含氨基酸序列nsrdssgthltv(seqidno:22)。在多肽是抗体(例如scfv)的一个实施方案中，所述抗体(例如scfv)包括vhfr1和vhfr2中之一或二者，其中所述vhfr1包含氨基酸序列qvqlvx1sggglvqpggslrlscaasgftfs(seqidno:1)，其中x1是除e以外的氨基酸并且在某些实施方案中x1是q；所述vhfr2包含氨基酸序列wvrqapgkglewv(seqidno:202)。此类抗体(例如scfv)还可以包括以下诸项中的一项或多项：vlfr1，所述vlfr1包含氨基酸序列seqidno:3；vlfr2，所述vlfr2包含氨基酸序列seqidno:4；和vlfr3，所述vlfr3包含氨基酸序列seqidno:5；和vlfr3，所述vlfr3包含氨基酸序列seqidno:6。在一个实施方案中，此类抗体(例如scfv)包含表1的vhfr1、vhfr2、vhfr3、vlfr1、vlfr2和vlfr3的任何组合中的一种或多种。本公开还提供了可结合蛋白a的多肽，所述多肽可以呈抗体(例如scfv)形式存在并且包含以下氨基酸序列：xavisxbx18gx19nx20(seqidno:200)，其中xa是s或t；xb是p、r或n；x18是任何氨基酸；x19是h、n、r或t；并且x20是t或k。在一个实施方案中，所述多肽(可以呈抗体(例如scfv)形式存在)包含氨基酸序列seqidno:200，其中x18是a、d、h、n、p、s或t。在一个实施方案中，所述多肽(可以呈抗体(例如scfv)形式存在)包含氨基酸序列seqidno:200，其中x18是a、d、h、n、p、s或t；并且x19是a、r、h、n或p。在一个实施方案中，此类多肽从n末端至c末端包含vhcdr1，所述vhcdr1包含氨基酸序列syamh(seqidno:17)；具有式seqidno:200的蛋白a结合序列，其中x18是任何氨基酸或者是a、d、h、n、p、s或t；并且其中x19是任何氨基酸或者是a、r、h、n或p；和vhcdr3，所述vhcdr3包含氨基酸序列asvgatgpfdi(seqidno:19)。在seqidno:200的多肽呈抗体(例如scfv)形式存在时，所述抗体可包含：vlcdr1，所述vlcdr1包含氨基酸序列qgdslrsyyas(seqidno:20)；vlcdr2，所述vlcdr2包含氨基酸序列gennrps(seqidno:21)；和vlcdr3，所述vlcdr3包含氨基酸序列nsrdssgthltv(seqidno:22)。在多肽是抗体(例如scfv)的一个实施方案中，所述抗体(例如scfv)包括vhfr1和vhfr2之一或二者，其中所述vhfr1包含氨基酸序列qvqlvx1sggglvqpggslrlscaasgftfs(seqidno:1)，其中x1是除e以外的氨基酸并且在某些实施方案中x1是q；所述vhfr2包含氨基酸序列wvrqapgkglewv(seqidno:202)。此类抗体(例如scfv)还可以包括以下诸项中的一项或多项：vlfr1，所述vlfr1包含氨基酸序列seqidno:3；vlfr2，所述vlfr2包含氨基酸序列seqidno:4；和vlfr3，所述vlfr3包含氨基酸序列seqidno:5；和vlfr3，所述vlfr3包含氨基酸序列seqidno:6。在一个实施方案中，此类抗体(例如scfv)包含表1的vhfr1、vhfr2、vhfr3、vlfr1、vlfr2和vlfr3的任何组合中的一种或多种。本公开还提供了可结合蛋白a的多肽，所述多肽可以呈抗体(例如scfv)形式存在并且包含以下氨基酸序列：xax17isxbx18gx19nx20(seqidno:201)，其中xa是s或t；x17是v；xb是p；x18是任何氨基酸；x19是h、n、r或t；且x20是t或k。在一个实施方案中，所述多肽(可以呈抗体(例如scfv)形式存在)包含氨基酸序列seqidno:201，其中x18是a、d、h、n、p、s或t。在一个实施方案中，所述多肽(可以呈抗体(例如scfv)形式存在)包含氨基酸序列seqidno:201，其中x18是a、d、h、n、p、s或t；并且x19是a、r、h、n或p。在一个实施方案中，此类多肽从n末端至c末端包含vhcdr1，所述vhcdr1包含氨基酸序列syamh(seqidno:17)；具有式seqidno:201的蛋白a结合序列，其中x18是任何氨基酸或者是a、d、h、n、p、s或t；并且其中x19是任何氨基酸或者是a、r、h、n或p；和vhcdr3，所述vhcdr3包含氨基酸序列asvgatgpfdi(seqidno:19)。在seqidno:201的多肽呈抗体(例如scfv)形式存在时，所述抗体可以包含：vlcdr1，所述vlcdr1包含氨基酸序列qgdslrsyyas(seqidno:20)；vlcdr2，所述vlcdr2包含氨基酸序列gennrps(seqidno:21)；和vlcdr3，所述vlcdr3包含氨基酸序列nsrdssgthltv(seqidno:22)。在多肽是抗体(例如scfv)的一个实施方案中，所述抗体(例如scfv)包括vhfr1和vhfr2之一或二者，其中所述vhfr1包含氨基酸序列qvqlvx1sggglvqpggslrlscaasgftfs(seqidno:1)，其中x1是除e以外的氨基酸且在某些实施方案中x1是q；所述vhfr2包含氨基酸序列wvrqapgkglewv(seqidno:202)。此类抗体(例如scfv)还可以包括以下诸项中的一项或多项：vlfr1，所述vlfr1包含氨基酸序列seqidno:3；vlfr2，所述vlfr2包含氨基酸序列seqidno:4；和vlfr3，所述vlfr3包含氨基酸序列seqidno:5；和vlfr3，所述vlfr3包含氨基酸序列seqidno:6。在一个实施方案中，此类抗体(例如scfv)包含表1的vhfr1、vhfr2、vhfr3、vlfr1、vlfr2和vlfr3的任何组合中的一种或多种。在其他实施方案中，本公开提供了可结合蛋白a的多肽，所述多肽可以呈抗体(例如scfv)形式存在且包含选自如图5中所阐述的seqidno:177-197的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽(所述多肽可以呈抗体(例如scfv)形式存在)包含氨基酸序列seqidno:177-197之一。在一个实施方案中，此类多肽从n末端至c末端包含vhcdr1，所述vhcdr1包含氨基酸序列syamh(seqidno:17)；蛋白a结合序列，所述蛋白a结合序列是seqidno:177-197之一；和vhcdr3，所述vhcdr3包含氨基酸序列asvgatgpfdi(seqidno:19)。在seqidno:177-197的多肽呈抗体(例如scfv)形式存在时，所述抗体可包含：vlcdr1，所述vlcdr1包含氨基酸序列qgdslrsyyas(seqidno:20)；vlcdr2，所述vlcdr2包含氨基酸序列gennrps(seqidno:21)；和vlcdr3，所述vlcdr3包含氨基酸序列nsrdssgthltv(seqidno:22)。在多肽是抗体(例如scfv)的一个实施方案中，所述抗体(例如scfv)包括vhfr1和vhfr2之一或二者，其中所述vhfr1包含氨基酸序列qvqlvx1sggglvqpggslrlscaasgftfs(seqidno:1)，其中x1是除e以外的氨基酸并且在某些实施方案中x1是q；所述vhfr2包含氨基酸序列wvrqapgkglewv(seqidno:202)。此类抗体(例如scfv)还可以包括以下诸项中的一项或多项：vlfr1，所述vlfr1包含氨基酸序列seqidno:3；vlfr2，所述vlfr2包含氨基酸序列seqidno:4；和vlfr3，所述vlfr3包含氨基酸序列seqidno:5；和vlfr3，所述vlfr3包含氨基酸序列seqidno:6。在一个实施方案中，此类抗体(例如scfv)包含表1的vhfr1、vhfr2、vhfr3、vlfr1、vlfr2和vlfr3的任何组合中的一种或多种。在某些实施方案中，本文所公开的ab是内在化抗epha2ab。此类ab在适当的条件下与活细胞外表面上所存在的epha2分子的ecd结合导致所述ab内在化，其特征在于ab转运至所述细胞的细胞膜结合的内部。内在化ab得以例如作为媒剂用于药物、毒素、酶、纳米粒子(例如脂质体)、dna等的靶向递送，例如用于治疗应用。本文所描述的某些ab是单链fvab，例如scfv或(scfv')2。在此类ab中，vh和vl多肽以两种取向(即，以vhn末端至vl，或以vln末端至vh)中的任一种直接或经由氨基酸接头与彼此接合。此类接头的长度可以是例如1至50、5至40、10至30或15至25个氨基酸。在某些实施方案中，氨基酸接头的残基的80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多或者100％是丝氨酸(s)和/或甘氨酸(g)。合适的scfv接头的实例可以是或包括以下序列：astggggsggggsggggsggggs(seqidno:41)；ggggsggggsggggsggggs(seqidno:42)；ggggsggggsggggs(seqidno:43)；astggggaggggaggggagggga(seqidno:44)；ggggaggggaggggagggga(seqidno:45)；tpshnshqvpsaggptansgtsgs(seqidno:46)；或ggssrssssggggsgggg(seqidno:47)。内在化抗epha2ab的实例包括scfvts1：qvqlvqsggglvqpggslrlscaasgftfssyamhwvrqapgkglewvavisydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarasvgatgpfdiwgqgtlvtvssastggggsggggsggggsggggssseltqppsvsvapgqtvtitcqgdslrsyyaswyqqkpgtapklliygennrpsgvpdrfsgsssgtsasltitgaqaedeadyycnsrdssgthltvfgggtkltvlg(seqidno:48)。在以上ts1中，cdr有下划线且按以下顺序存在：vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。因此，在scfvts1中且在本文所公开的某些其他scfv中，scfv的vh处于scfv的氨基末端并且由接头(此处以斜体表示)连接至vl。还提供了scfvts1变体，其中ts1的所有构架区和cdr都没有改变，除了用选自以上表2b中所阐述的18个不同的cdrh2序列中的任一个的cdr替换vhcdr2。ab产生方法使用本文所提供的信息，可以使用标准技术来制备本文所公开的ab。举例来说，本文所提供的氨基酸序列可以用于确定编码所述ab的适当核酸序列，然后将所述核酸序列用于表达所述ab中的一种或多种。可以根据标准方法对核酸序列进行优化以反映对各种表达系统的具体密码子“偏好”。使用本文所提供的序列信息，可以根据许多标准方法来合成所述核酸。寡核苷酸合成可以在市售固相寡核苷酸合成机上便利地进行，或使用例如固相亚磷酰胺三酯法人工合成。一旦合成编码本文所公开的ab的核酸后，便可以根据标准方法对其进行扩增和/或克隆。编码本文所公开的ab的天然或合成核酸的表达可以通过将编码ab的核酸可操作地连接至启动子(其可以是组成型或诱导型)并且将所述构建体并入表达载体中以产生重组表达载体来实现。所述载体可能适合在原核生物、真核生物或二者中复制并整合。典型克隆载体含有可用于调控编码ab的核酸的表达的适当功能取向的转录和翻译终止子、引发序列和启动子。所述载体任选地含有通用表达盒，所述通用表达盒含有至少一个独立终止子序列、允许在真核生物与原核生物二者中复制该盒的序列(例如，如在穿梭载体中所发现)和用于原核生物系统与真核生物系统二者的选择标记物。为了获得所克隆的核酸的高水平表达，通常构建含有用于指导转录的强启动子、用于翻译引发的核糖体结合位点和转录/翻译终止子的表达质体，所述用于指导转录的强启动子、用于翻译引发的核糖体结合位点和转录/翻译终止子中的每一者相对于彼此且相对于蛋白质编码序列呈功能取向。还可以将ab基因亚克隆至表达载体中，从而允许在所述ab(例如scfv)的c末端或n末端添加标签序列，例如flagtm或his6，以有助于鉴别、提纯和控制。一旦分离出编码所述ab的核酸并且加以克隆后，便可以在多种经重组工程改造的细胞中表达所述核酸。此类细胞的实例包括细菌、酵母、丝状真菌、昆虫和哺乳动物细胞。本文所公开的ab的分离和提纯可以通过从分泌ab的细胞的培养物上清液中分离，然后使用亲和力色谱进行提纯来实现，或者可以利用提纯，例如通过亲和力色谱(例如使用蛋白a或蛋白g)从经基因修饰以组成性和/或在诱导后表达所述蛋白质的细胞的溶解产物中或者从合成反应混合物中分离。可以通过渗析和蛋白质提纯中正常采用的其他方法进一步提纯分离的ab。本公开还提供了产生标的ab的细胞。举例来说，本公开提供了用一种或多种包含编码本文所公开的ab的核苷酸序列的核酸或其多肽链加以基因修饰的重组宿主细胞。将dna克隆至例如细菌(例如噬菌体)、酵母(例如酿酒酵母或毕赤氏酵母)、昆虫(例如杆状病毒)或哺乳动物表达系统中。一种合适的技术使用丝状噬菌体载体系统。参见例如us5,885,793、us5,969,108和us6,512,097。ab修饰本公开涵盖经修饰以提供所期望的特征，例如以促进递送至受试者中具体类型的组织和/或细胞(例如至肿瘤)、以增加血清半衰期、以增补抗癌活性等的ab(和编码ab的核酸)。本文所公开的ab可以在具有修饰或不具有修饰的情况下提供，并且例示为人ab，但是可以容易地加以修饰并且制备为人源化ab或嵌合ab。用于修饰ab(例如scfv)的一种方式是将一个或多个其他元件缀合(例如连接)在所述ab包含的多肽链的n末端和/或c末端或至所述ab的任何氨基酸(包括内部氨基酸)。此类其他元件包括例如脂质体、另一蛋白质、可检测标记(例如放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白质、发色蛋白质、染料、荧光发射金属、化学发光化合物等等)、药物和/或载体分子。任选地，此类缀合是经由连接所述ab与所述其他元件的接头部分来进行。本文所公开的经一个或多个其他元件修饰的ab保留其结合特异性，同时利用所述一个或多个其他元件的性质来赋予一种或多种其他特征。在某些实施方案中，本文所公开的ab通过附接至治疗部分，诸如至脂质纳米粒子(例如脂质体、固体脂质纳米粒子或胶束)的外部或至化学治疗剂如类美登素(例如腺苷-曲妥珠单抗美坦辛的化学治疗部分dm1)或奥里斯他汀(例如本妥昔单抗的化学治疗部分单甲基奥里斯他汀e)来进行配制。当附接至脂质微粒时，所述ab可以共价附接至与适合插入脂质膜中的脂质缀合的聚合物(例如至所述聚合物的末端)。ab缀合的脂质体在本文称为“免疫脂质体”。本文所公开的ab可以充当免疫脂质体靶向组分，使得所述免疫脂质体能够特异性地结合至癌细胞表面上的epha2。免疫脂质体可以经负载而含有一种或多种抗癌剂，如小分子(例如化学治疗剂)或核酸(例如sirna)。制造和负载脂质纳米粒子(如脂质体和免疫脂质体)的方法描述于例如us2010/0068255、us2010/0008978、us2009/0171077、us2009/0155272、us2007/0116753、us2007/0110798、us2007/0031484、us2006/0147513、us2005/0112065、us2004/0037874、us2004/0209366、us2003/0003143、us7,135,177、us7,022,336、us6,803,053、us6,528,087、us6,214,388、us6,210,707、us6,110,491、us5,980,935、us5,380,531、us7,507,407、us7,479,276和us7,462,603中。附接至ab的以上元件中的任一个都可以经由接头，例如柔性接头，例如肽接头或聚乙二醇接头而连接至所述ab。如果存在，那么所述接头分子一般具有足以容纳所述ab和所连接的部分的长度，以便在结合时允许所述ab进行一定程度的灵活运动，例如移动至脂质纳米粒子的表面。组合物本公开还提供了组合物，例如包括本文所描述的任何ab或缀合物或者编码本文所公开的任何ab的核酸的组合物。在某些方面，所述组合物得以用于治疗受试者(例如人)的癌症，并且可能适用于在所述疾病的任何阶段期间进行治疗。含有一种、两种或更多种不同的ab的组合物可以作为医药组合物提供并且施用至有需要的哺乳动物(例如人)。如以上所描述，所述脂质体可以含有一种或多种与本文所公开的ab不同的ab。所述脂质体可以是双特异性的、多特异性的等，因为所述脂质体附接有多个不同的ab，而且除本文所公开的ab所结合的epha2表位以外，还对至少一个其他表位或抗原具有特异性。组合可以提供在单一制剂中或者可以提供为单独的制剂，例如处于单独的容器中，所述容器又可以包括在更大的容器中作为试剂盒，其中所述单独的制剂可以含有例如单一ab或多种不同的ab。此类单独的制剂可以在施用之前组合或者通过单独注射来施用。本文所公开的ab或免疫脂质体可以在医药学上可接受的载体中进行配制，例如，经配制以供肠胃外施用，从而用于所描述的方法中。在某些实施方案中，例如，在ab作为可注射液体(例如适用于静脉内注射)施用时，ab制剂可以是包含盐(例如以调节张力)、缓冲剂、防腐剂、氨基酸和其他医药学上可接受的载体和赋形剂中的一种或多种或全部的无菌无热原水溶液，并且可以提供为例如即用型剂型或者可复原型储存稳定粉剂或液体。用于经由对流增强型递送施用的制剂可以如例如us20090208422中所描述。本公开的组合物可以包括治疗有效量的标的抗体，以及任何其他相容组分，视需要而定。“治疗有效量”意指以单次剂量、作为一系列相同或不同的抗体或组合物的一部分对受试者施用所述量可以有效地减少受试者的癌细胞增殖和/或转移或者提供任何其他可检测的治疗益处。抗体的此类治疗有效量和其对细胞生长的影响包括连同一种或多种其他疗法(例如免疫疗法、化学疗法、辐射疗法等)协作和/或协同抑制细胞生长。如以下所指出，治疗有效量可以结合给药方案和对受试者病状的诊断分析(例如，使用epha2特异性抗体监测存在或不存在细胞表面表位)和其类似因素加以调节。量和剂量本领域技术人员将能确定准确剂量。剂量可能取决于多种因素，包括所采用的特定化合物的强度、受试者的病状和受试者的体重，以及疾病严重程度和疾病阶段。剂量还将由可能伴随特定化合物的施用的任何不利副作用的存在、性质和程度来决定。如本领域中已知，可能必需基于年龄、体重、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病状严重程度加以调节，并且将可以由本领域技术人员利用常规实验来确定。治疗有效量还是治疗上有益的效应超过所述抗体的任何毒性或不利效应的量。在本公开的情形下，施用至受试者(例如人)的组合物的量应足以在合理时限内在动物中实现预防或治疗反应，并且取决于施用目标、欲治疗的受试者的健康和身体状况、年龄、所期望的消退程度、抗体组合物的配方、治疗临床医师对医学情形的评价和其他相关因素而变化。因此，预期所述量将属于相对较宽的范围内，但是仍然可以通过受试者的各种特征(诸如以上所指出)以常规方式确定。作为一个实例，标的抗体的治疗或预防有效量的非限制性范围是约0.1mg/kg至约20mg/kg，例如约1mg/kg至约10mg/kg。医药制剂中的抗体浓度可以从以重量计低于约0.1％、通常为或至少约2％变化至高达20％至50％或更高，并且将主要通过考虑体液体积、粘度等，根据所选择的特定施用模式和患者需要加以选择。还可以通过与已知会影响所期望的生长抑制或免疫抑制反应的抗癌剂或免疫抑制剂相比较来确定合适的剂量和剂量方案。此类剂量包括在无显著副作用的情况下对细胞生长产生低剂量抑制的剂量。在适当的剂量下且在适当施用某些化合物的情况下，本公开的化合物可以提供多种细胞内效应，例如从部分抑制至基本上完全抑制细胞生长。剂量治疗可以是单次剂量方案或多次剂量方案(例如，包括匀变剂量和维持剂量)。如以下所指出，标的组合物可以连同其他药剂一起施用，并且因此，剂量和方案在此类情形下还可以变化以适合受试者的需要。组合疗法多种癌症疗法中的任一种都可以组合在含本公开抗体的组合物中。举例来说，用于化学治疗性治疗或生物反应调节剂治疗的药剂可以存在于包含所述抗体的医药组合物(诸如免疫脂质体)中。化学治疗剂是减少癌细胞增殖的非蛋白质化合物，并且涵盖细胞毒性剂和细胞抑制剂。化学治疗剂的非限制性实例包括烷基化剂、亚硝基脲、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、植物(例如长春花)生物碱、核酸如抑制核酸(例如sirna)和类固醇激素。举例来说，抗代谢物药剂包括叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂。合适的天然产物和其衍生物(例如长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)可以用作抗癌剂。举例来说，紫杉烷如太平洋紫杉醇以及任何活性紫杉烷衍生物如多烯紫杉醇或紫杉烷前药如2'-(2-(n,n'-二乙基氨基)丙酰基)-太平洋紫杉醇、7-(2-(n,n'-二乙基氨基)丙酰基)-太平洋紫杉醇、2'-(2-(n,n'-二乙基氨基)丙酰基)-多烯紫杉醇或7-(2-(n,n'-二乙基氨基)丙酰基)-多烯紫杉醇是合适的。其他抗增殖性细胞毒性剂有纳维本(navelbene)、cpt-11(伊立替康(irinotecan))、阿那曲唑(anastrazole)、来曲唑(letrazole)、卡培他滨(capecitabine)、雷洛昔芬(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosamide)和屈洛昔芬(droloxafine)。具有抗增殖活性的微管影响剂也适合使用。激素调节剂和类固醇(包括合成类似物)适合使用。方法治疗方法本公开的抗体在多种癌症中得到治疗性使用。本文所描述的疗法和诊断法预期用于患有癌症、疑似患有癌症或处在发展癌症的风险下的受试者。“治疗”意指至少改善与宿主所罹患的病状相关的症状，其中改善在广义上用于指至少降低与所治疗的病状相关的参数(例如症状)的量值。因此，治疗还包括病理学病状或至少与其相关的症状受到完全抑制(例如防止发生，或中止，例如终止)，使得宿主不再受所述病状或至少表征所述病状的症状困扰的情形。因此，治疗包括：(i)预防，即，降低发展临床症状的风险，包括致使临床症状不发展，例如防止疾病发展至有害状态；(ii)抑制，即，使临床症状的发展或进一步发展停滞，例如缓解或完全抑制活性疾病，例如，以便减少肿瘤负载，所述减少可以包括消除可检测的癌细胞(例如转移性癌细胞)；和/或(iii)解除，即，使临床症状消退。根据所述方法，可以治疗多种受试者。一般来说，此类受试者是“哺乳动物”，其中这些术语广泛用于描述哺乳动物纲内的生物体，包括肉食动物目(例如狗和猫)、啮齿目(例如小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长目(例如人、黑猩猩和猴子)。在许多实施方案中，受试者将是人。在一个相关的实施方案中，所治疗的受试者患有表达(例如过度表达)肿瘤相关抗原和/或epha2的癌症。所述抗原表达于癌细胞表面上且往往以比相应的非癌细胞更高的水平存在。这方面在本公开方法的情形下可能是有益的，因为表达或呈现epha2的细胞可能顺从用本公开抗体进行的治疗。所述抗体可以例如在不可检测到抗原的存在时便开始治疗的情况下施用至受试者，并且因此不意在具有限制性。还可以在疾病症状的第一征象之前、在可能的疾病的第一征象时或者在疾病诊断之前或之后开始抗体疗法。癌症本公开的抗epha2抗体组合物和/或抗epha2抗体缀合物组合物可以用于抗癌疗法，特别是在癌细胞在细胞外可达的细胞表面上呈现epha2时。举例来说，本文所描述的抗体组合物和/或治疗抗体缀合物组合物可以施用至受试者(例如人患者)以减少癌细胞增殖，例如，以减小肿瘤大小、减少癌症负载、减少转移和/或改善患者的临床结果。与本文所预期的癌症有关的方法包括例如单独或与抗癌疫苗或疗法组合使用抗体疗法。特别顺从抗体疗法的癌症可以通过与本文所描述的诊断方法类似的方法和本领域中已知的其他方法加以鉴别。在抗癌疗法包括施用先前所描述的抗体组合物时，所述抗癌疗法可尤其针对表达标的抗体所结合的细胞表面可及和/或溶剂暴露表位的癌细胞，包括转移性癌症。顺从疗法的表达epha2的癌症的实例包括实体肿瘤、半实体肿瘤和液体肿瘤。顺从疗法的表达epha2的癌症的实例包括但未必局限于epha2阳性乳腺癌、脑癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、食道癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)和胃癌，并且可以包括结肠癌、外阴癌、皮肤癌(例如黑色素瘤)、肾癌和神经胶质瘤(例如多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤)、白血病和淋巴瘤。应当注意，尽管与非癌细胞相比，epha2可能以较高水平表达于癌细胞上，但这不限制本文所公开的疗法。可能顺从以本文所公开的方法进行的疗法的表达epha2的癌瘤包括但不限于食道癌、肝细胞癌、基底细胞癌(皮肤癌的一种形式)、鳞状细胞癌(不同的组织)、膀胱癌(包括移行细胞癌，一种恶性膀胱赘瘤)、支气管癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、肾细胞癌、原位导管癌或胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆氏肿瘤(wilm'stumor)、宫颈癌、子宫癌、睪丸癌、骨原性癌、上皮癌和鼻咽癌。可能顺从以本文所公开的方法进行的疗法的表达epha2的肉瘤包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨原性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肉瘤(ewing'ssarcoma)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和其他软组织肉瘤。可能顺从以本文所公开的方法进行的疗法的其他表达epha2的实体肿瘤包括但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、寡枝神经胶质瘤、脑脊髓膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。可能顺从以本文所公开的方法进行的疗法的表达epha2的白血病包括但不限于a)慢性骨髓增生性综合征(多潜能造血干细胞的赘生性病症)；b)急性骨髓性白血病(多潜能造血干细胞或具有有限谱系潜能的造血细胞的赘生性转型)；c)慢性淋巴细胞性白血病(cll；免疫不成熟且功能不胜任的小淋巴细胞的克隆增殖)，包括b细胞cll、t细胞cll、幼淋细胞白血病和毛细胞白血病；以及d)急性淋巴母细胞性白血病(以淋巴母细胞积聚为特征)。可以使用方法治疗的淋巴瘤包括但不限于b细胞淋巴瘤(例如伯特基氏淋巴瘤(burkitt'slymphoma))；霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin'slymphoma)；非霍奇金氏淋巴瘤；等等。可能顺从根据本文所公开的方法进行的治疗的其他癌症包括非典型脑膜瘤(脑)、胰岛癌(胰脏)、髓样癌(甲状腺)、间充质瘤(肠)、肝细胞癌(肝脏)、肝母细胞瘤(肝脏)、明细胞癌(肾脏)和纵隔神经纤维瘤。可能顺从使用本文所公开的方法进行的治疗的癌症的其他实例包括但不限于上皮和神经外胚层起源的表达epha2的癌症。上皮起源的表达epha2的癌症的实例包括但不限于小细胞肺癌、乳腺癌、眼晶状体癌、结肠癌、胰腺癌、肾脏癌、肝脏癌、卵巢癌和支气管上皮癌。本公开的方法可以用于治疗已知过度表达epha2的癌细胞。神经外胚层起源的表达epha2的癌症的实例包括但不限于尤因氏肉瘤、脊髓肿瘤、脑肿瘤、婴儿期幕上原始神经外胚层肿瘤、小管囊肿性癌瘤、粘液性管状和梭状细胞癌、肾肿瘤、纵隔肿瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤以及青壮年和青少年肉瘤。与其他癌症疗法的组合如以上所指出，所述方法的另一个特征在于抗体可以与一种或多种其他疗法组合施用至受试者。此类疗法可以组合于组合物中或与标的抗体缀合。除了与本文所公开的抗体进行物理组合(例如，呈缀合物形式或者呈脂质体或其他脂质纳米粒子形式)以外，还可以在施用本文所公开的抗体的同时或者之前或之后连同施用一种或多种抗癌剂，如以上表4中所列出的那些抗癌剂。除了施用抗体组合物以外的疗法或治疗可以在从施用标的抗体同时至之前或之后多达5小时以上，例如10小时、15小时、20小时以上的任一处施用。依次施用或施加标的抗体和其他治疗干预，例如，其中在另一种治疗性治疗之前或之后施用标的抗体。同时施用标的抗体和其他疗法，例如，其中同时施用标的抗体和第二疗法，例如，当第二疗法是药物时，它可以随标的抗体一起作为两种单独制剂或组合至施用给受试者的单一组合物中来施用。不论是依次施用还是同时施用，如以上所说明，出于本公开的目的，所述治疗都被视为共同或组合施用。可能或可能没有连同标的抗体一起施用的其他标准抗癌治疗剂包括但不限于免疫疗法、化学治疗剂和手术(例如，如以下进一步描述的那些)。另外，标的抗体的治疗性施用还可以是用抗癌疗法对受试者进行治疗后治疗，其中所述抗癌疗法可以是例如手术、辐射疗法、施用化学治疗剂等等。还可以使用除本文所公开的那些抗体以外的抗体，特别是可以提供靶细胞的补体介导的杀死和/或抗体依赖性细胞毒性介导的杀死的单株抗体。举例来说，标的抗体可与一种或多种化学治疗剂(例如环磷酰胺、阿霉素(doxorubicin)、长春新碱与强的松(chop))组合和/或与辐射治疗组合和/或与手术干预(例如在去除肿瘤的手术前后)、放射疗法、骨髓移植、生物反应调节剂治疗和上述诸项的某些组合组合施用。辐射疗法包括但不限于从外部施加的来源如射束或通过植入小辐射源递送的x射线或γ射线。施用途径在实践所述方法时，施用途径(使标的抗体进入受试者的途径)可以变化，其中以下更详细描述标的抗体的代表性施用途径。单独或处于以上所描述的组合中的标的抗体可以全身(例如通过肠胃外、静脉内、肌肉内、鞘内、心室内或皮下施用)或局部(例如在局部肿瘤部位，例如通过肿瘤内施用(例如至实体肿瘤中、至淋巴瘤或白血病中所涉及的淋巴结中，或通过对流增强型递送，例如至脑中，例如，如us20090209937中所公开)、施用至实体肿瘤供应血管中等)而施用至体腔或内腔中或至器官中。这些不同的施用途径可以通过注射或输注来进行。适用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性等张无菌注射溶液，它们可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑细菌剂和致使制剂与预定受体的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，它们可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器如安瓿和小瓶中，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，从而仅需要在临使用前添加无菌液体赋形剂，例如注射用水即可。注射溶液和悬浮液可以由先前所描述的种类的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。制备肠胃外可施用组合物的方法对于本领域技术人员将是已知或显而易知的。可以在所期望的时段内重复施用疗法，例如在约1天至约5天的时段内重复或在约1个月、约2个月等内每若干天(例如约五天)重复一次。它还可以在其他治疗性干预(诸如旨在去除癌细胞的手术干预)之前、同时或之后施用。抗体还可以作为组合疗法的一部分施用，其中将免疫疗法、癌症化学疗法或辐射疗法中的至少一种施用至受试者(如以上更详细描述)。检测方法本公开提供了一种在受试者内的生物样品中或从受试者分离的样品中检测例如表达epha2的细胞上的epha2的方法。所述方法可用于诊断目的和预后目的二者。标的方法一般包括使含有细胞的样品与本公开的抗体或抗体缀合物接触；和检测所述抗体或抗体缀合物与所述样品中的细胞的结合。所述细胞可能在体外，其中所述细胞在获自疑似存在癌细胞的受试者、进行癌症治疗的受试者或正测试对治疗的敏感性的受试者的生物样品中。所述细胞可能在体内，例如，所述细胞在疑似存在癌细胞的受试者、进行治疗的受试者或正测试对治疗的敏感性的受试者中。本文所描述的检测测定可以用于确定受试者是否患有或多或少顺从使用基于抗体的疗法进行治疗的癌症，以及在受试者中监测治疗的进度。它还可以用于评价其他组合疗法的过程。因此，诊断测定可以告知临床医师对疗法和治疗方案的选择。抗体可以用于经由免疫诊断技术在存在或疑似存在表达epha2的癌细胞的受试者的生物样品中检测表达epha2的细胞。此类诊断可用于鉴别顺从稍后于下文公开的疗法的患者和/或监测对疗法的反应。合适的免疫诊断技术包括但未必限于体外和体内(成像)方法。举例来说，可对抗epha2抗体进行可检测地标记，施用至疑似患有以epha2的细胞表面表达为特征的癌症的受试者，并且使用本领域中可利用的成像方法检测已结合的经可检测标记的抗体。如本文所使用的短语“体内成像”是指在整个活哺乳动物中检测抗体(例如经可检测标记的2d6)的存在的方法。可以通过体内成像来检测光学上可检测的蛋白质，如荧光抗体和荧光素酶缀合的抗体。体内成像可以用于提供哺乳动物的2-d以及3-d图像。举例来说，可以将经放射性标记的抗体施用至受试者并且用γ摄影机对受试者进行成像。可以使用电荷耦合装置摄影机、cmos或3d断层摄影机进行体内成像。使用计算机化断层摄影术、磁共振成像、超声波扫描术、质子发射断层摄影术、单光子发射计算机化断层摄影术(spect)等等进行体内成像的方法在本领域中是众所周知的。得自许多体内成像方法如以上所描述的那些的信息可以提供关于受试者中的癌细胞的信息。在方法是体外方法时，生物样品可以是可能存在癌细胞的任何样品，包括但不限于血液样品(包括全血、血清等)、组织、整细胞(例如完整细胞)和组织或细胞提取物。举例来说，所述测定可以包括检测活细胞或组织学组织样品中的细胞上的epha2。具体来说，检测可以评价活细胞的细胞外表面。举例来说，可以固定(例如通过甲醛处理)组织样品，并且可以提供嵌埋在载体中(例如在石蜡中)或经冷冻的未固定组织。测定可以呈现多种形式，如竞争、直接反应或夹层型测定。实例包括免疫印迹；凝集测试；酶标记和介导的免疫测定，如酶联免疫吸附测定(elisa)；生物素/亲和素型测定；放射免疫测定；免疫电泳；免疫沉淀；等等。所述反应一般包括与抗体缀合的可检测标记。标记包括荧光标记、化学发光标记、放射性标记、酶标记和/或染料分子那些，或用于检测样品中的抗原与跟其反应的抗体之间的复合物形成的其他方法。在使用固体载体时，固体载体通常首先在合适的结合条件下与固相组分反应，使得抗体充分固定至载体。可以使用如蛋白质(例如血清白蛋白(例如牛血清白蛋白(bsa))、钥孔虫戚血蓝素、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白)、聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物等偶合剂来促进固定至固体载体。测定可以在溶液中进行，以使得抗体与抗原在沉淀条件下形成复合物。可以使抗体涂布的粒子在合适的结合条件下与疑似含有靶抗原的生物样品接触，以形成粒子-抗体-抗原复合物聚集物，可以使其沉淀并且使用洗涤和/或离心将其与样品分离。可以使用许多标准方法中的任一种，如以上所描述的那些免疫诊断方法来分析反应混合物，以确定存在或不存在抗体-抗原复合物。本公开的测定法可以包括检测活细胞对本公开抗体和/或抗体缀合物的细胞吸收的测定法，例如，作为检测表达epha2的癌细胞的方法。在某些实施方案中，其中本公开的抗体和/或抗体缀合物被表达epha2的细胞内在化，可以使疑似含有表达epha2的细胞的样品与此类抗体接触并且孵育足以允许抗体和/或抗体缀合物内在化的时间。然后洗涤。可以经由细胞所含有的其标记来检测内在化抗体(例如facs、光谱仪、放射性同位素计数器等)。还可以如us7,045,283中所描述来选择内在化抗体。以上所描述的测定试剂(包括本公开的抗体)可以与合适的说明书和其他必需试剂一起提供于试剂盒中，以便如以上所描述来进行免疫测定。取决于所使用的特定免疫测定法，试剂盒还可以含有合适的标记以及其他包装试剂和材料(即，洗涤缓冲液等等)。可以使用这些试剂盒来进行标准免疫测定，如以上所描述的那些免疫测定。提供以下实例作为说明而不是限制。实施例实施例1–d2-1a7热稳定性和蛋白a结合分析d2-1a7scfv的热稳定性和与蛋白a树脂的结合。通过差示扫描荧光(dsf)来进行热稳定性测定，如下执行：将25μl含10μmscfv和1xorange(sigma)的1xpbs以1℃/min的速率从20℃加热至90℃，并且收集所产生的荧光数据。使用iq5实时检测系统进行加热和荧光数据产生。使用prism软件分析数据。所报告的tm是一阶导数的最大值处的温度。如下测定多个样品的蛋白a结合：通过在4000g下离心15分钟以去除细胞而从培养物中获得由哺乳动物细胞表达的scfv。使用fortebio来测定上清液中的scfv效价。使用96孔蛋白a板(蛋白a96孔蛋白质提纯板(gehealthcare：lifesciences，proteinahp)来测定蛋白a结合，所述板含有处于具有多孔底部的孔中的蛋白a缀合的树脂，从而允许经由离心或吸力从下方收集孔中的液体。用1xpbs洗涤所述板的各孔，并且将含有250μg蛋白质的上清液负载至各孔中。然后使用真空歧管在10毫巴压力下分离上清液与蛋白a树脂，并且将来自各孔的流经液分别收集至标准96孔板的空孔中。然后用600μl1xpbs(ph7.6)洗涤蛋白a板的诸孔。为了洗脱树脂结合的ab，将200μl0.1m乙酸添加至各孔并且在室温下孵育3至10分钟。将所述板放在第二板上以俘获洗脱液且在100×g下离心2分钟，并且添加20μl1mtrisph8.0以中和洗脱液中的ab。为了测定蛋白a结合百分比，将流经液中剩余的scfv的浓度与最初负载的蛋白质的量(250ug)相比较。结论：65℃的测量tm对于有效的和工业生产的脂质体缀合来说低到不可接受，并且低于10％的测量蛋白a结合对于工业生产来说低到不可接受。实施例2–进行构架工程改造以提高tm作为增加稳定性特征(包括tm)的初步方法，将d2-1a7的cdr移植至不同的ig构架。d2-1a7的重链可变区的构架是ighv3-30。vh3一般非常稳定而且典型地具有结合蛋白a的能力，并且是治疗性ab的常用构架。因此，决定将重链保留在vh3家族内，但将d2-1a7的重链移植至ighv3-23骨干上，这是最常见的同型。另外，在ighv3-23构架内进行两个稳定突变：e6q和s49a。d2-1a7的轻链可变区的构架是igvλ3-19，它并不常见于天然人ab谱系中，所以决定将d2-1a7轻链cdr移植至更常见的构架igvλ1-40，发现它还往往与igvh3-23配对。设计两个热稳定变体，ts1和ts2。基于同源性建模，认为位置1和位置22与抗原相互作用，并且因此使两个变体回复突变而具有d2-1a7中的这些位置上所存在的残基(q1s、s22t)。在ts1中，保留认为对稳定性非常重要的疏水性袋状结构(g13v、l78a)，同时调节表面上的电荷(v3e、r18t)。将氨基酸序列与天然序列谱系相比较，并且引入一致氨基酸，包括l39k(ts1)f65s(二者)、k66g(ts2)或k66s(ts1)和a74t(ts1)。表3：热稳定ab的设计和解链温度结论：ts1在热稳定性方面表现出了显著改善，其中tm增加了六度。这一克隆适用于或用于进行额外工程改造以改善蛋白a结合。实施例3–妨碍蛋白a结合的区域的鉴定在scfv的热稳定性提高至71度的情况下，接下来将蛋白a亲和力工程改造至ab中以促进制造。文献中广泛报告了vh3构架能够结合蛋白a。将ts1工程改造在vh3-23构架上，但出乎意料地，它不能充分结合至蛋白a。在重链可变区内，fr1、cdr2和fr3内的残基已经表现出涉及蛋白a结合。ts1的结构分析显示已证明对结合重要的位置上的氨基酸不脱离生殖系：h15、h17、h19、h57、h59、h64、h65、h66、h68、h70、h81、h82a、h82b。在得到生殖系序列的情况下，仍不清楚哪些氨基酸对蛋白a与ab之间的相互作用造成消极影响，故开发了蛋白a结合测定。设计并制备了包含d2-1a7、ts1、ts1*和f5的异源配对重链和轻链的一组变异scfv。为了直接测试cdr-h2序列的效应，还制造了ts1的cdr-h2被替换为f5(ts1*)的cdr-h2的scfv。将所述变体瞬时表达于哺乳动物细胞中，使用生物膜层干涉术对所表达的scfv效价进行定量。如实施例1中所描述在96孔板中进行蛋白a结合分析。使用生物膜层干涉术来测定流经液中剩余的scfv的量，并且计算与蛋白a树脂结合的scfv的百分比，并且对结果进行绘图(图1)。结论：f5表现出75％蛋白a结合。ts1表现出29％蛋白a结合，远低于工业制造视为可接受的50％界限。将f5cdr-h2移植至ts1中(产生scfvts1*)同时废除epha2结合显示蛋白a结合显著改善(65％)，从而表明ts1的cdr-h2对蛋白a结合赋予消极影响。实施例4–cdr-h2设计和使用酵母呈现的scfv选择如xu等,(2013)mab,5:2,237-254中所描述来制备ts1cdrh2的一组变体以用于酵母呈现，以便筛选出保留epha2结合且表现出改善的蛋白a结合的克隆。将该组设计为包括超过50,000个独特的cdrh2序列。该组中的各scfv具有并入在其c末端的flagtm表位标签(dykddddk–seqidno:49)。该组在疑似对蛋白a结合重要的cdr-h2位置上以及在疑似有助于epha2结合的cdr-h2位置上并入了多样性。然后将所述设计与从ncbi下载的人ab谱系数据库以及对非免疫患者谱系的ngs测序相比较，并且加以调节，以保留高度保守残基。最终，鉴别出cdrh2残基vh49、vh50、vh52a、vh53、vh55和vh57以供诱变。再次通过人谱系指导，对大部分位置仅选择氨基酸的子集(参见表4)。由此产生并测试经设计以包括53,460个独特序列的一组scfv。表4：scfv设计：cdr-h2突变在becton(bd)系统上使用酵母的facs分选对个别地表达于酵母细胞表面上的该组scfv进行快速选择以分离出具有理想性质者。将诱导的酵母细胞与200nm具有his6标签的epha2和10μg/ml经荧光标记的蛋白a一起孵育。用facs缓冲液(1xpbs、0.5％bsa，ph7.4)将细胞洗涤两次以去除未结合的抗原。然后将抗原结合的细胞和蛋白a结合的细胞与2μg/ml经alexa647标记的m2抗flagtmab和2μg/ml经alexa488标记的抗his6ab一起孵育30分钟。2次洗涤之后，将细胞再悬浮于facs缓冲液中且使用bd机器来测量荧光信号。使用软件来确定中值荧光强度(mfi)。将epha2mfi(抗his6-alexa488)相对于表达mfi(抗flag-alexa647)进行正规化。对于第一轮选择，对epha2结合和蛋白a结合进行选择(图2，图b)，由此产生小百分比群体。为了确保已经鉴别出与重组epha2结合的群体，针对epha2结合对分离的克隆进行再选择(图2，图d)。结论：获得了表现出所期望的特征的克隆。实施例5–对scfv的热稳定性、epha2结合/内在化和蛋白a结合的表征对当呈现于酵母上时对蛋白a结合和epha2结合呈阳性的scfv进行测序，并且在expi293ftm细胞中瞬时表达为可溶性蛋白质。然后如实施例1中所描述来测量其蛋白a结合。对如实施例4中所描述而获得的22个独特变体进行测试，并且它们表现出了介于20％至80％范围内的蛋白a结合(图3)。这22个scfv(scfv1至scfv22)的氨基酸和编码核酸序列提供于图5中。在所测试的22个scfv中，有15个导致至少50％蛋白质与蛋白a结合，并且因此选择这些用于进一步表征。使用dsf测量所有变体的tm。除了四个scfv外，所有scfv都具有理想的tm，比65℃高出2℃以上(即，至少67℃)。十一个具有≥70℃的更有利tm。表5：由酵母呈现筛选鉴别的scfv(和2个对照)结合和内在化测定：为了测试这些变异scfv的抗epha2活性，在表达epha2的细胞系上测定外部装饰有这些ab的脂质体的结合和内在化。使用快速高通量螯合配体诱导的内在化测定(clia)(nielsen等,bmcimmunology,2006,7:24)来筛选抗epha2-scfv靶向性脂质体以进行结合和内在化评价。测试表达高水平epha2受体的两个细胞系ovcar-3和u-251以及表达鼠类epha2的小鼠细胞系ct-26(以测试所述经工程改造的scfv是否保留与鼠类epha2的交叉反应性)。经由各scfv的c末端his6标签的镍结合，使scfv与包含nta(ni)缀合的脂质的经荧光标记的脂质体(dii5-nta脂质体)结合。测试脂质体的制备和内在化测定如下制备dii5-nta脂质体。如huang等,bioconjugatechemistry,2006,第17卷,第1592-1600页中所描述来合成nta缀合的脂质dod-tri-nta。将氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、胆固醇、甲氧基-peg(2000)-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(peg-dspe)、dod-tri-nta和荧光脂质染料dil5(molecularprobestm，目录号d12370)分别以100:66.7:5:0.5:0.3的摩尔比组合在三氯甲烷溶液中，并且在真空下将溶液蒸发至干燥，从而形成脂质膜。在68℃下，在hepes缓冲生理盐水(“hbs-6.5”-5mmhepes、144mmnaclph6.5)中对所述膜进行水合，对所得脂质悬浮液进行若干个冷冻(干冰-丙酮)与解冻(68℃)循环，并且使用lipextm热桶挤压机(northernlipids，canada)，经由具有200nm(6次)和100nm(10次)孔径的两个堆叠聚碳酸酯膜(whatmannuclepore，usa)挤出。这个方案典型地产生具有100-110nm的z平均大小和小于0.1的多分散指数的单层囊泡。将挤出的脂质体冷却至室温，在g-75(gehealthcare)柱上通过凝胶色谱加以提纯，用hbs-6.5洗脱，然后通过0.2-μm过滤器进行灭菌。然后在酸消化之后使用磷钼酸盐分光光度法来测定脂质体磷脂的浓度。在与细胞一起孵育之前，在汉克氏平衡盐溶液(hank'sbalancedsaltsolution，hbss)中将脂质体稀释至0.4mm磷脂，并且加入niso4至0.1mm。将六组氨酸scfv稀释至细胞培养基(参见下文)中，达到25μg/mlscfv的浓度，并且与相等体积的脂质体溶液混合(“荧光nta-脂质体/scfv混合物”)。通过在孵育/用可破坏his6/ni复合物且从而释放并去除外部(而非内在化)组氨酸标签化scfv的咪唑进行洗涤之前和之后测量细胞的荧光，对内在化ab的百分比进行定量。使测试细胞(人癌细胞系ovcar-3和u-251以及鼠癌细胞系ct-26)以附着状态在补充有10％fbs、1x青霉素/链霉素和l-麸酰氨酸的rpmi-640细胞培养基中生长至90％汇合，并且使用0.25％胰蛋白酶-edta加以收集。将细胞悬浮液以100,000个细胞/孔分配至96孔“v”形底聚丙烯细胞培养板中，用1xpbs洗涤细胞，然后再悬浮于100μl荧光nta-脂质体/scfv混合物中。用板密封胶带覆盖所述板，避光，并且在振荡器上在5％co2氛围中在37℃下孵育4小时。通过离心使细胞球粒化，吸出上清液，并且通过再悬浮于200μl/孔pbs中将细胞洗涤两次以去除任何未结合的细胞外脂质体，或用200μl/孔含有0.25m咪唑(ph7.5)的pbs将细胞洗涤两次以去除未结合的细胞外脂质体和表面结合的脂质体而非内在化脂质体。通过facs(cy5荧光通道)评估细胞缔合的脂质体的相对量。“结合”量包括细胞表面结合脂质体和内在化脂质体，并且与未进行咪唑洗涤时的细胞荧光成比例。其在图4中示出为相对于装饰有scfvts1的匹配脂质体的脂质体结合的百分比。内在化数据表明内在化脂质体的量随总细胞缔合脂质体的百分比而变化。大多数克隆保留与ts1类似的人和鼠epha2结合和内在化(图4)。仅有一个测试克隆scfv-12(和f5阴性对照)不结合epha2。结论：所测试的22个新克隆中有21个(除scfv-12以外的全部)被鉴别为具有可接受的结合和内在化性质。22个中有18个(scfv1-4、6-13、15-16和18-21)表现出理想的热稳定性，tm≥67℃，而这些中有十个(scfv1-3、8-11、13、15和18)还满足工业上更有利的热稳定性准则，各自表现出≥70℃的tm。实施例6–测试抗epha2scfv的缀合稳定性对所选scfv在其c末端进行重组修饰以去除his6标签并添加适于脂质体附接的c末端肽glyglyserglyglycys(seqidno:54)。以对应于其所来源的scfv名称然后是字母c的名称来标识这些经修饰的scfv。接下来测试ab与peg-dspe(脂质聚合物)的缀合(使用us6,210,707中所描述的方法)，其中所得脂质聚合物缀合的scfv保留结合抗原的能力(测量为抗原结合亲和力)以及脂质聚合物缀合物有效地插入(经由脂质聚合物的dspe部分)脂质体外膜中(peg拴系的scfv暴露在外)而不损失结合性质的能力(测量为脂质体经由多个已结合scfv与抗原结合的总亲和力且以下称为亲合力)。scfv与脂质聚合物接头的缀合：在30℃下将提纯的scfv溶液用调节至ph6.0-6.2的15mml-半胱氨酸、5mmedta处理1小时，以还原/激活各scfv的羧基末端半胱氨酸残基的硫醇基。通过在柱上进行凝胶色谱来去除过量半胱氨酸，用缀合缓冲液(5mm柠檬酸盐、1mmedta、140mmnacl，ph6.0)洗脱。接下来，如下使ab与脂质聚合物接头马来酰亚胺基-peg(2000)-dspe(mal-peg-dspe，avantipolarlipids，目录号880126)缀合。将呈水性胶束储备溶液形式的mal-peg-dspe(avanti)添加至经处理的scfv，以实现4:1的脂质/蛋白质摩尔比。在室温下随搅拌将混合物孵育2至4小时，并且通过用半胱氨酸(最终浓度0.5mm)将未反应的马来酰亚胺淬灭五分钟来终止反应。在ultrogelaca34重力柱上对已淬灭的反应混合物进行色谱且用s10c-6.5缓冲液(100g/l低内毒素蔗糖、10mm柠檬酸usp，用naoh调节至ph6.5)洗脱，在280nm下读取洗脱液蛋白质浓度。收集含有经提纯的scfv-peg-dspe缀合物的第一(空隙体积)蛋白质峰。通过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)来评价scfv-peg-dspe缀合物的纯度。制备测试脂质体且将scfv脂质聚合物缀合物插入脂质体膜中：在70℃下将卵鞘磷脂(esm，nof，japan，nm-10)、胆固醇(avantpolarlipids，编号770100)、甲氧基-peg(2000)-二硬脂酰基甘油(peg-dsg，nof，japan，sunbrightgs-020)和dii5(参见实施例5)分别以摩尔比100:66.7:8:0.3溶解于无水乙醇中且在70℃下随搅拌稀释至10倍体积的cs-250缓冲液(250mmnacl水溶液、5mm柠檬酸盐，ph5.5)中达到100mm磷脂的最终浓度。如以上实施例5中所描述在70℃下将脂质悬浮液经由200nm和100nm聚碳酸酯膜式过滤器挤出，并且将挤出的材料冷却降至室温，通过切向流渗滤、使用中空纤维滤筒(spectrumlaboratories，mwco500kd)、经由cs-250缓冲液的10倍体积交换来提纯脂质体，并且通过0.2-μm灭菌过滤器。这个方案典型地产生具有100-110nm的z平均大小和小于0.1的多分散指数的单层囊泡(“dii5sm脂质体”)。在scfv-peg-dspe缀合物的膜插入之前，在g-25柱(pd-10，gehealthcare)上使用体积排阻色谱(sec)将脂质体交换至葡萄糖-柠檬酸盐缓冲液(17％葡萄糖水溶液、20mm柠檬酸盐，ph5.7)中。然后将scfv-peg-dspe缀合物与dii5-sm脂质体混合在葡萄糖-柠檬酸盐缓冲液中以实现10-12g/mol的蛋白质/磷脂比。将混合物快速加热至60℃且在搅拌的情况下在该温度下维持30分钟。然后在冰上冷却混合物且在sepharosetmcl-4b柱(gehealthcare)上通过凝胶色谱法分离具有膜插入scfv-peg-dspe缀合物的脂质体与任何剩余的未插入缀合物，用柠檬酸盐生理盐水缓冲液洗脱。在柱的空隙体积中收集scfv连接的脂质体，并且使用分析体外抗原结合亲合力且使用流式细胞术分析细胞吸收，各自如以下所描述。证实脂质体上存在scfv且通过sds-page加以定量。经由进行epha2结合分析将附加有c末端his6的编码人epha2的核酸克隆至表达载体pcep4(编号v044-50)中，并且在聚乙烯亚胺转染后瞬时表达于freestyletm293细胞(编号k900001)中。使用ni-ntasepharosetm树脂(usa)从细胞培养基中提纯出his6标签化重组人epha2蛋白。用his标签化重组人epha2以10μg/ml蛋白质的浓度涂布octetred96系统的抗his传感器(编号18-5116)，历经300秒，并且在pbs中进行背景运作，历经60秒。对于scfv-peg-dspe缀合物，随后将传感器与2.5μg/ml(研究1)或4.0μg/ml(研究2)缀合物一起在pbsph7.4中孵育，并且确定孵育3秒至13秒之间的缔合曲线的斜率，针对仅存在缓冲液的背景进行修正，并且在变体间进行比较。将scfv连接的脂质体与传感器一起在pbs中在0.025mm脂质体磷脂下孵育，确定孵育3秒至20秒之间的缔合曲线的斜率，针对仅存在缓冲液的背景进行修正，并且在变体间进行比较。结果示于以下表6中，其中第a列提供scfv标识符；第b列表示scfv/脂质聚合物接头缀合物的产率百分比；第c列提供scfv-缀合物(未与脂质体结合)epha2结合速率百分比；第d列提供scfv缀合的脂质体epha2结合速率百分比；且第e列(研究1)和第f列(研究2)提供热应力后scfv缀合物(未与脂质体结合)中剩余的抗原结合速率百分比。表6：所选scfv变体与脂质聚合物接头的缀合和所得缀合物/scfv连接的脂质体的epha2结合亲和力/亲合力。结论：所有测试克隆都充分缀合，但scfv4c、7c、11c、16c和19c在缀合热应力之后表现出小于10％抗原结合。实施例7–对所选变体的可制造性的分析与实施例6的实验平行，测试了九个克隆(和亲本克隆ts1，作为对照)以确定对工业制造的合适性。设计筛选策略以消除具有低表达、低蛋白a结合能力或高聚集物含量的分子。在freestyletm293细胞(编号k900001)中以1l规模瞬时表达scfv，进行蛋白a提纯，并且中和至ph6.0。结果汇总于表7中。表7：对1l规模下的可开发性的表征使用生物膜层干涉术来计算所有ab效价。使用sec如下测量聚集物的百分比。使用50mm磷酸钠(+0.4m过氯酸钠)ph7.0作为运作缓冲液将50μg样品注射于supersw3000柱(bioscience)上。使用配备有自动取样器、二元泵和二极管阵列检测器的1100hplc进行所有测量。使用chemstationtm软件来分析数据。如实施例1中所描述来测量蛋白a结合能力的提高倍数(与ts1c相比)。所评估的第一准则是scfv的表达水平。典型地在经稳定转染的细胞系中(例如在中国仓鼠卵巢“cho”细胞中)制造抗体。然而，经由瞬时表达获得的效价预示着在经稳定转染的细胞中的表达特性。如以上表7中所示，许多新ab具有更佳效价(与ts1c相比提高约2倍以上)。对于一些变体，中和损失稍高，但与ts1c相比，所有最终提纯产率都相当或更高。最后，对于成功的下游方法开发来说，需要具有低聚集物含量。所有变体的中和后聚集物含量都相当而且可接受。除了scfv-2c和scfv-4c以外，这些新ab具有更加提高的表达、聚集和蛋白a结合能力。进一步表征全部ab在缀合过程期间的稳定性。结论：就所测试的参数来说，所有测试克隆(克隆2、3、4、7、8、9、10、11和13)都表现出了可接受的商业开发性质。等效方案本领域技术人员仅使用常规实验便将认识到或能够确定并且实施本文所描述的特定实施方案的许多等效方案。希望上述公开内容和以下权利要求书涵盖此类等效方案。预期具体实施方案(和所附权利要求书)中所公开的实施方案的任何组合都在本公开的范围内。以引用的方式并入本文所提到的每一个美国和外国专利和申请中专利申请和公布的公开内容都明确以引用的方式整体并入本文。序列表<110>j·d·马克斯d·德拉蒙德m·格迪d·柯波廷n·克里a·卢格维斯凯<120>蛋白a结合多肽、抗epha2抗体及其使用方法<130>ucsf-535wo<150>us62/309,374<151>2016-03-16<150>us62/309,365<151>2016-03-16<150>us62/309,383<151>2016-03-16<160>202<170>patentin版本3.5<210>1<211>30<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽。<220><221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>xaa可以是除glu以外的任何氨基酸。<400>1glnvalglnleuvalxaaserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheser202530<210>2<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽。<220><221>misc_feature<222>(14)..(14)<223>xaa可以是除ser以外的任何氨基酸。<400>2trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalxaa1510<210>3<211>22<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽。<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>xaa可以是除gln以外的任何氨基酸。<220><221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>xaa可以是除val以外的任何氨基酸。<220><221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>xaa可以是除gly以外的任何氨基酸。<220><221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>xaa可以是除arg以外的任何氨基酸。<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>xaa可以是除ser以外的任何氨基酸。<400>3xaaserxaaleuthrglnproproservalserxaaalaproglygln151015xaavalthrilexaacys20<210>4<211>22<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽。<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>xaa可以是除gln以外的任何氨基酸。<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>xaa可以是除ser以外的任何氨基酸。<400>4xaaservalleuthrglnproproservalserglyalaproglygln151015argvalthrilexaacys20<210>5<211>15<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽。<220><221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>xaa可以是除leu以外的任何氨基酸。<400>5trptyrglnglnxaaproglythralaprolysleuleuiletyr151015<210>6<211>32<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽。<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>xaa可以是除phe以外的任何氨基酸。<220><221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>xaa可以是除lys以外的任何氨基酸。<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>xaa可以是除ala以外的任何氨基酸。<220><221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>xaa可以是除leu以外的任何氨基酸。<400>6glyvalproaspargpheserglyxaaxaaserglythrseralaser151015leuxaailethrglyxaaglnalagluaspglualaasptyrtyrcys202530<210>7<211>32<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽。<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>xaa可以是除phe以外的任何氨基酸。<220><221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>xaa可以是除lys以外的任何氨基酸。<400>7glyvalproaspargpheserglyxaaxaaserglythrseralaser151015leualailethrglyleuglnalagluaspglualaasptyrtyrcys202530<210>8<211>30<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽。<400>8glnvalglnleuvalglnserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheser202530<210>9<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽。<400>9trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalala1510<210>10<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽。<400>10trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalthr1510<210>11<211>32<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽。<400>11argphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyrleugln151015metasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysalaarg202530<210>12<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽。<400>12trpglyglnglythrleuvalthrvalserser1510<210>13<211>22<212>prt<213>人工序列<220><223>合成多肽。<400>13sersergluleuthrglnproproservalser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