本公开涉及提高生物组织，例如与人工心脏瓣膜一起使用的生物组织，的质量的方法。更具体地说，涉及制备具有高压缩性的干燥交联组织的方法。
背景技术：
生物学假体或“生物假体”是至少部分来源于经处理的生物组织以用于植入人类的装置。目前正在使用或正在开发的生物假体的例子包括心脏瓣膜、血管移植物、韧带替代物、心包片等。
尽管目前对生物组织、生物假体及其加工、组装和性能知道很多，但仍然存在需要克服的缺陷，以提供保持天然组织特性的生物假体，同时优化组织生物力学，最小化钙化和/或使处理过的组织血液相容。
例如，通常情况下，在收获之后，生物组织必须在合适的条件下在适当的溶液中存储，以在随后进行的组织处理步骤之前和期间保存该组织的天然特性。另外，收获的生物组织应以减轻甚至减少收获组织的生物负载的方式进行储存。
此外，用于制造许多生物假体的生物组织的主要成分是胶原蛋白，胶原蛋白是在此使用具有一般的术语，指的是相关胞外蛋白家族。胶原蛋白分子聚集形成微原纤维，然后组装成原纤维，产生胶原纤维。
组成胶原蛋白分子的氨基酸含有侧基，所述侧基代表这些分子上潜在化学反应的位点。由于胶原组织在植入宿主接受者后迅速降解，如果将其用于长期临床应用，则需要使该组织稳定。通过使该组织内的胶原蛋白分子交联来化学稳定(也称为组织固定)是众所周知的，并且戊二醛通常用于交联组织。
技术实现要素：
本公开的一些方面涉及制备干燥的交联生物组织的方法。制备了包含交联剂和有机水溶性液体的处理溶液。将生物组织浸入处理溶液中一段有效时间以基本上从生物组织中排出水并使生物组织基本交联，以形成干燥的交联生物组织。
本公开的其他方面涉及增强经导管心脏瓣膜(transcatheterheartvalve)中所用生物组织的压缩性的方法。生物组织经去细胞化(decellularize)。制备了包含交联剂和有机水溶性液体的处理溶液。将去细胞化的生物组织浸入处理溶液中一段有效时间以基本上从生物组织中排出水并使生物组织基本交联，以形成去细胞化的干燥交联生物组织。
附图说明
包括附图以提供对实施方式的进一步理解，其并入并构成本说明书的一部分。附图示出了实施方式并且与说明书一起用于解释实施方式的原理。通过参考下面的详细描述，可以更好地理解其他实施方式和实施方式的许多预期优点。附图的要素不一定相对于彼此成比例。相同的附图标记表示相应的类似部分。
图1是包括根据本公开原理制备并随后再水合的含生物组织的人工心脏瓣膜的照片。
图2是包括根据本公开原理制备并随后再水合的含生物组织的人工心脏瓣膜的照片。
图3是根据常规方法制备的含生物组织的人工心脏瓣膜的照片。
图4是比较以下实施例中描述的生物组织实施例和比较例的压缩性的图。
具体实施方式
本公开的一些方面涉及制备用于植入的生物组织的方法，其增强生物组织(例如与人工心脏瓣膜一起使用的生物组织)的质量。本公开增强了处理人工生物组织的能力，因为干燥且交联的生物组织可以在干燥条件下存储，这与通常用于在植入之前存储生物组织的水性溶液不同。本公开内容可以产生经制备的生物组织，该生物组织在柔软且具有高拉伸强度的同时，基本感觉和定性表现类似于完全水合的固定组织。
可用于或与本公开一起使用的生物组织类型的示例包括猪、牛、马、绵羊或其他主动脉瓣或肺动脉瓣和血管组织；人类供体同种异体移植物；结缔组织基质的其他来源，包括猪、马、绵羊和其他异种或同种异体心包组织；硬膜、网膜或消化道的其他组织；皮肤、sis(小肠粘膜下层)、胎盘、子宫或来自这些组织的细胞体外重建的组织；和眼组织，包括角膜和巩膜。
可以由如本文所述加工的生物组织形成的其他生物假体或装置的示例包括心脏瓣膜和瓣膜小叶；用于外周、冠状动脉和透析通路的血管移植物；用来增强或修复软组织、硬组织、软骨、肌腱、角膜等的贴片、条带或带扣，其用于有效重建过程(包括原生瓣膜重建、瓣膜瓣环成形术和修复)的增强和器官修复。
该方法也可用于制造用于组织扩大过程(包括用于充血性心力衰竭、血管动脉瘤修复和加强包括大脑、主动脉和腹部装置的心脏包扎、条带或增强物)的结构或装置，以及作为辅助物或支持物用于合成材料(如
生物组织的干燥和交联通过将生物组织浸入处理溶液中持续有效时间段来实现。在生物组织浸入处理溶液中有效的时间段之后，生物组织基本干燥且基本交联。
在某些实施方式中，处理溶液包含交联剂与一种或多种有机水溶性液体的混合物。增加处理溶液中有机水溶性液体的浓度减少了使生物组织中水浓度的达到特定降低程度所需的时间。
在某些实施方式中，交联剂可以是能够交联生物组织中蛋白质的胺基团的醛。合适的醛的示例包括戊二醛和甲醛。
处理溶液中的交联剂浓度小于约10体积％。在某些实施方式中，处理溶液中的交联剂浓度为约0.10体积％至约1.00体积％。
有机水溶性液体可以是单一的有机水溶性液体或是两种或更多种有机水溶性液体的组合。在一些实施方式中，有机水溶性液体可以包括多元醇。可用于本公开处理溶液的示例性有机水溶性液体包括但不限于甘油、蔗糖、丙二醇、三乙二醇和四甘醇。处理溶液中的有机水溶性液体浓度大于约5体积％。在某些实施方式中，处理溶液中的有机水溶性液体浓度为约10体积％至约60体积％。
处理溶液可具有对生物组织有利的ph，例如约7.3至7.5。处理溶液还可以包括缓冲剂，其增强使处理溶液保持在对生物组织有利的ph下(例如约7.3至7.5)的能力。
在某些实施方式中，缓冲剂可以是等渗的。缓冲液可以包括氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠七水合物、盐酸和氢氧化钠中的至少一种。在其他实施方式中，缓冲剂包含磷酸盐缓冲溶液和螯合剂的混合物。
生物组织浸入处理溶液中的有效时间段可能受多种因素影响，例如处理溶液中的交联剂和有机水溶性液体的浓度以及将生物组织浸入时处理溶液的温度。
使生物组织在某一温度下与处理溶液接触一段时间，所述时间和温度足以允许处理溶液渗透到生物组织的间隙中，并实现处理溶液与生物组织间隙中的流体之间的基本平衡。
达到平衡所需的时间与某些因素(诸如生物组织厚度和处理溶液中组分浓度等因素)直接相关。另外，达到平衡所需的时间与处理溶液和生物组织的合并体积与处理溶液混合的速率之间的比率成反比。
具体地，有效时间段与处理溶液中交联剂和有机水溶性液体的浓度成反比。如此，随着处理溶液中这些组分的浓度增加，有效时间段减少。在许多实施方式中，有效时间段为约3小时至约24小时。
在生物组织浸入处理溶液的有效时间内，处理溶液可保持在不超过60℃的温度。在其他实施方式中，当生物组织浸入处理溶液中时，处理溶液可维持在约15℃至约40℃的温度。在其他实施方式中，当生物组织浸入处理溶液中时，处理溶液可维持在约17℃至约37℃的温度。
当生物组织浸入处理溶液中时，可以搅动生物组织和处理溶液中的至少一种。在某些实施方式中，当生物组织和处理溶液置于封闭容器中时，生物组织和处理溶液两者同时被搅动。
通过搅拌生物组织和处理溶液中的至少一种，可提高生物组织浸入处理溶液中时与生物组织接触的交联剂和有机水溶性液体的量。
本公开的方法可以通过将处理溶液置于封闭的容器中来进行。使用封闭的容器使干燥和交联过程中处理溶液中组分的蒸发最小化。
未被处理溶液和浸入的生物组织占据的封闭容器的部分可以充满惰性气体。惰性气体可以选自氮气、氦气、氖气、氩气及其组合。
除了干燥和交联生物组织之外，本公开的某些实施方式还使生物组织去细胞化。去细胞化是指从组织中去除和/或提取细胞和/或细胞组分。使用本公开内容的方法，通过去细胞化将细胞组分从组织中去除而不损伤组织的结构和/或功能。使用本公开的一些方法去细胞后，非细胞组分保留在组织中。
如本文所用，短语“细胞组分”是指构成细胞的一部分的物质，包括细胞膜和大分子(例如核酸、多肽、糖蛋白等)，其通常被封闭在细胞膜内，嵌入细胞膜内或附着于细胞膜。该术语不包括已被细胞分泌的分子，例如细胞外基质组分如胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖等，即使这些分子与细胞表面相关或连接。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，其由含有糖、磷酸盐/酯和嘌呤或嘧啶碱基的单体(核苷酸)组成。大多数生物体中的脱氧核糖核酸(dna)是遗传物质，而核糖核酸(rna)参与dna中所含信息向蛋白质的转移。术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸片段”、“核酸序列或区段”或“多核苷酸”也可与基因、由基因编码的rna、dna和cdna互换使用。
术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用。蛋白质生物化学领域众所周知，氨基酸(蛋白质的“构成要素”)具有特定的尺寸和特征，例如电荷、疏水性和亲水性。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性、中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
“片段”或“部分”是指编码多肽或蛋白质的核苷酸序列的全长或小于全长，或多肽或蛋白质的氨基酸序列的全长或小于全长。
“非细胞组分”是指存在于生物组织内的物质(天然组织或经组织工程化的构建体)，其来自细胞或存在于组织内但不包含在细胞的质膜内。此类组分的示例包括细胞外基质(ecm)组分(例如弹性蛋白、胶原蛋白(i型、iv型)、层粘连蛋白、纤连蛋白等)等。
“天然”是指自然产生的。因此，例如，“天然组织蛋白质”是指存在于自然产生的组织(即来自哺乳动物的组织)中的蛋白质，其保持基本完整并基本上保留在哺乳动物体内自然存在的结构。
术语“抗原”和“免疫原”在本文中可互换使用，并且是指当施用于哺乳动物时引发免疫应答的任何物质。
可以使用各种去污剂、乳化剂、蛋白酶和/或高或低离子强度溶液来实现去细胞化。在本公开的某些实施方式中，去细胞化在某些条件下进行并持续足够的时间以使得组织样品中存在的抗原(例如免疫原性细胞组分，包括脂质膜、膜相关抗原和可溶性蛋白)基本上被去除，而ecm蛋白(例如胶原蛋白和弹性蛋白)的结构和机械完整性保持不变。
具体地，去细胞化溶液通过破坏细胞膜的磷脂双层促进组织样品中的细胞结构的分解来去除细胞以及来自ecm的细胞碎片和细胞器以及蛋白质。所述去细胞化溶液含有至少一种去细胞剂，其能够与大分子关联从而形成复合物，所述关联例如通过共价键、离子键、氢键或范德华力永久或暂时结合，所述大分子为例如存在于细胞膜和/或细胞内或其上的蛋白质(包括免疫原性或抗原性蛋白)和/或核酸。
本公开的去细胞化溶液可不导致组织样品的结构、组织样品的ecm的结构或组织样品的生物机械性质的显著改变。可以通过已知技术来评估去细胞化对结构的影响，所述已知技术包括光学显微镜、超微结构检查、组织学、电子显微镜、量热法等。另外，可用本领域众所周知的生物机械测试评估各种去细胞化方案对组织性质的影响。一般而言，这些测试的选择和解释将取决于构造的性质和其目的。
用于使组织去细胞化的去细胞剂浓度根据期望的要求而变化。在某些实施方式中，加入溶液中的去细胞剂的总浓度可以为约0.01重量％至约10重量％。在一些实施方式中，加入到去细胞化溶液中的所有去细胞剂的总浓度可以为约2重量％或更少。例如，在一些方法中，去细胞剂的总浓度为约0.25％至约2％(重量比体积或体积比体积)，约0.5％至约1％。
在某些实施方式中，去细胞化溶液还可含有约0.1重量％至1重量％的盐水和约0.025重量％至0.1重量％的叠氮化钠。
组织可以放置在去细胞化溶液中多达约7天。在其他实施方式中，将组织放置在去细胞化溶液中约70小时、约60小时、约50小时或约40小时或更短，这取决于实施方式并取决于组织厚度和/或组织密度。
组织接触时间可以足够长以允许组织中存在的非结构蛋白质和/或抗原与去污剂关联，例如形成蛋白质-去污剂复合物。在一种方法中，将组织放置成与去细胞化溶液接触至少约40小时。在另一种方法中，将约2mm厚的组织放置成与去细胞化溶液接触约50小时。
根据构造，来自组织培养物的组织构建体可能仅需要约2天或更少。更密集的组织可能需要更长的接触时间。例如，股动脉组织可能需要比股静脉组织更长的接触时间。
可以通过任意多种方法在去细胞化期间对组织进行机械加工。例如，可以采用滚瓶装置或提供滚动式搅动的装置来保持处理期间处理过的组织悬浮。
在去细胞化过程中，组织和去细胞化溶液可以保持在约20至40℃之间的温度。
随后可以使用标准方案或通过本文所述的方法冲洗去细胞化的组织以基本上从组织厚度中心移除去细胞剂。
一旦完成去细胞化，对生物组织进行上文更详细讨论的干燥和交联步骤(例如，在一个单一步骤中同时干燥和固定(和可选灭菌)组织)。由此，该过程产生待使用的生物组织，或在使用前适于在干燥条件下储存的生物组织(例如，由本公开的一些方法产生的生物组织可以组装成植入式(可植入)装置，例如人工心脏瓣膜，并且该植入装置可以在植入之前以干燥状态存储)。
与先前的植入式生物组织相比，生物组织表现出增强的性能特征，例如增强的压缩性和增强的恢复性。这些特性增强了在各种应用中使用生物组织的能力。
由本公开的一些方法产生的干燥去细胞化(或“去细胞”)组织的压缩性比通过产生干燥非去细胞组织的其他方法加工的相同生物组织的压缩性高至少约30％。在某些实施方式中，干燥去细胞组织的压缩性比干燥非去细胞组织的压缩性高约50％。
另外，与根据常规方法处理的生物组织(其用作植入式装置且期望被储存在水性溶液中(即非干燥)的人工生物组织，例如与许多当前可用的人工心脏瓣膜一起使用的人工生物组织)相比，由本公开的一些方法产生的干燥去细胞组织具有增强的压缩性。作为参考点，用于制备与人工心脏瓣膜一起使用的人工生物组织的一种常规方法包括接收来自屠宰场的心包组织，清洁该组织，然后将该组织在室温于约0.25％的戊二醛溶液中固定至少24小时(在本公开全文中被称为“常规非去细胞方法”或“常规制备的非去细胞生物学组织”)。在某些实施方式中，由本公开的一些方法产生的干燥去细胞组织的压缩性比与常规人工心脏瓣膜一起使用的常规制备并储存在水性溶液中的非去细胞人工生物组织的压缩性高至少约5％。在其他实施方式中，干燥去细胞组织的压缩性比与人工心脏瓣膜一起使用的常规制备并存储在水性溶液中的非去细胞生物组织的压缩性高至少约10％。
涉及由本公开的一些方法产生的生物组织的性质的另一方面是在生物组织已经被再水合之后(例如，植入后，所制备的人工生物组织，例如所制备的人工心脏瓣膜生物组织，在存在体液的情况下再水合)改善的压印可恢复性(imprintrecoverability)。图1所示是在安放(deployment)和再水合之后，纳入有根据本公开内容的方法制备的人工生物组织小叶(例如，干燥去细胞组织)的人工心脏瓣膜的图像。图1的照片反映出干燥去细胞组织(人工心脏瓣膜安放和再水合后)没有显示压印。图2所示是在安放和再水合之后，纳入有使用本公开的干燥技术而没有用本公开的可选去细胞化方法制备的人工生物组织小叶的人造心脏瓣膜的图像。图2的照片反映出干燥的非去细胞组织(人工心脏瓣膜安放和再水合后)显示出一些压印(在图2中标识为10)。图3所示为在安放之后，纳入有常规制备的非去细胞人工生物组织小叶(用常规方法制备，其中从屠宰场接收的心包组织经清洁然后在低浓度(约0.25％)戊二醛中室温固定至少24小时)的人工心脏瓣膜的图像，包括使用前在水性溶液中的储存(应当理解，由于图3的人工心脏瓣膜在使用之前被水合，不适用“再水合”)。图3的照片反映了常规制备的人工生物组织在安放后显示压印(在图3中标记为12)。图1-3图的比较表明，再水合的根据本公开的方法制备的去细胞组织在安放或再水合后没有压印。
在以下实施例中描述了本公开的产品和方法。提供这些实施例作为说明，并不意图限制本公开。
实施例
与常规制备的非去细胞生物组织的压缩性相比，评估根据本公开的一些方法制备的组织的压缩性。具体而言，通过将新鲜的猪心包组织在去污剂溶液中于室温下96小时以使该组织去细胞化来制备实施例组织样品；然后将去细胞化的组织置于0.2％戊二醛和25％甘油的缓冲的溶液中室温24小时以同时干燥和固定实施例组织样品。然后空气干燥该实施例组织样品。在将要进行下文所述的压缩测试之前，将实施例组织样品浸入生理盐水溶液中1小时以再水合该实施例组织样品。提供常规制备的非去细胞生物组织作为比较例组织样品，其由新鲜猪心包组织如下制备：清洁该组织，并在室温下固定在0.25％戊二醛溶液中至少24小时，然后储存在戊二醛溶液中。
为了评估压缩性，将负荷放置在相同大小的实施例和比较例组织样品上，并且记录不同负荷下的压缩。该评估的结果示于图4。在图4的曲线中，实施例组织样品的压缩结果记录为“再水合去细胞”，比较例组织样品的压缩结果记录为“对照”。
再水合去细胞样品的压缩优于比较例(或“对照”)样品。具体地说，与对照样品的压缩相比，实现再水合去细胞样品50％压缩的负荷降低了超过10％。
在前述详细说明中，参照构成说明书的一部分的附图，并且其中以说明性方式显示了可以实施本公开特征的具体实施方式。在这方面，参照所描述的图的方向使用例如“顶部”、“底部”、“前部”、“后部”、“头部”、“尾部”等的方向术语。因为实施方式的组件可以在多个不同的取向中定位，所以方向术语被用于说明的目的并且决不是限制性的。应该理解，可以利用其他实施方式并且可以进行结构或逻辑改变而不背离本公开的范围。因此，以上详细描述不应起限制作用，且本发明的范围由所附权利要求书进行限定。
预期本申请中公开的特征以及通过引用并入的上述申请中描述的特征可以混合并匹配以适应特定情况。对于普通技术人员来说，各种其他修改和改变将是显而易见的。