本申请主张于2015年8月12日提交的韩国专利申请第10-2015-0113727号的优先权，所述说明书全部内容都是本申请的参考文献。本发明涉及血管平滑肌细胞增殖性疾病的治疗用组合物、诊断用组合物和诊断标志物的检测方法，具体而言涉及包含含有编码fgf12的多核苷酸的重组表达载体或fgf12蛋白或其片段作为活性成分的血管平滑肌细胞增殖性疾病的治疗用组合物，以及包含测量fgf12mrna或fgf12蛋白表达水平的制剂的血管平滑肌细胞增殖性疾病的诊断用组合物，以及利用所述组合物的血管平滑肌细胞增殖性疾病的标志物检测方法。
背景技术：
：：血管平滑肌细胞形成并支持血管结构，并通过自主神经系统和激素的调节反复松弛和收缩，对顺畅的血液循环非常重要。血管平滑肌细胞在健康状态下高度表达平滑肌特异性基因如sma、sm22α、sm-mhc、sm-钙调蛋白(calponin)、结蛋白(desmin)等，几乎不进行细胞增殖(proliferation)，但当由于血管伤口、动脉粥样硬化、炎症或其他血管疾病等引起血管损伤而需要恢复血管损伤时，作为重构(remodeling)的一部分，发生活跃的细胞增殖和迁移(migration)。当这些血管平滑肌细胞的增殖没有被正常调节，并由于异常信号的传递或重复的损伤而过度发生，平滑肌细胞会从原始位置即中膜(medialayer)移动到内膜(intimalayer)并继续增殖，从而形成血管新生内膜(neointimallayer)，若伴随炎症及血栓生成，导致血管壁增厚和血管腔变窄,即引起血管狭窄及肺动脉高压等疾病。目前血管狭窄的治疗主要通过支架手术或血管成形术等外科手术进行，而这些手术也涉及血管损伤因此复发的可能性很高。在临床上尝试使用抗血小板剂、抗凝剂、抗过敏剂或抑制组织再生的药物来治疗或预防血管狭窄，但治疗效果不充分。因此，需要开发能够抑制平滑肌细胞增殖来治疗血管狭窄的治疗制剂，以及能够诊断疾病并诊断治疗预后的诊断用试剂。伴有所述平滑肌细胞增殖的疾病中，肺动脉高压(pulmonaryarterialhypertension，pah)尤其没有明显区别于其他疾病的特征性症状或体征，因此早期诊断很困难，而且进展缓慢，从最初症状的发生到确诊的时间很长，死亡率高。肺动脉高压是向肺部供血的肺动脉的血压变高，使肺部的血液循环变差的疾病，被定义为平均肺动脉血压为25mmhg或更高的情况。疾病最初无症状，但随疾病进展，需要通过变窄的血管向肺部输入血液，这使心脏过载，心输出量减少。其结果是，发生运动时的呼吸困难、疲劳、全身无力、头晕等症状，或发生咯血、心绞痛、胸痛和下肢浮肿，在严重的情况下，甚至会导致昏厥或心脏麻痹。肺动脉高压是一种罕见的疾病，发生率为每百万人中2～10人，但考虑到诊断困难，实际患者人数预计相当可观，同时，当被确诊为肺动脉高压，一年内死亡率为15％，五年后死亡率高达50％以上，是一种难治性疾病。但与此相反，治疗策略依然停留在缓解症状的对症治疗中，而有效的药物和治疗方法却很少。因此，迫切需要开发能够实现对包括肺动脉高压在内的平滑肌细胞过度增殖引起的疾病的早期诊断有效的诊断试剂及其疗法。技术实现要素：本发明人在研究平滑肌细胞的增殖过程中，发现fgf12的表达水平与血管平滑肌细胞的增殖密切相关，并确认在平滑肌细胞的增殖活跃的受损血管中fgf12的表达减少，以及在受损血管中fgf12的过表达抑制了平滑肌细胞的增殖，从而完成本发明。因此，本发明的目的是提供包含含有编码fgf12的多核苷酸的重组表达载体作为活性成分的平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物。本发明的另一个目的是提供包含fgf12蛋白或其片段作为活性成分的平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物。本发明的另一个目的是提供包含测量fgf12mrna或fgf12蛋白表达水平的制剂的平滑肌细胞增殖性疾病的诊断用组合物。本发明的另一个目的是提供平滑肌细胞增殖性疾病的标志物检测方法，该方法为了提供诊断平滑肌细胞增殖性疾病所需的信息，包含(a)提供受试者的样本的步骤；及(b)测量所述样本中的fgf12表达水平的步骤；和(c)将所述fgf12的表达水平与正常人进行比较，把fgf12表达水平低于正常人的受试者判定为已患有或将可能患有平滑肌细胞增殖性疾病的步骤。本发明的另一个目的是提供用于制备平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物的，含有编码fgf12的多核苷酸的重组表达载体的用途。本发明的另一个目的是提供平滑肌细胞增殖性疾病的治疗方法，其特征在于，把包含含有编码fgf12的多核苷酸的重组表达载体作为活性成分的平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物按照有效量投入到需要的个体。本发明的另一个目的是提供用于制备平滑肌细胞增殖性疾病治疗用制剂的，fgf12蛋白或其片段的用途。本发明的另一个目的是提供平滑肌细胞增殖性疾病的治疗方法，包括把包含fgf12蛋白或其片段作为活性成分的平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物按照有效量投入到需要的个体。本发明的另一个目的是提供用于制备平滑肌细胞增殖性疾病诊断用制剂的，测量fgf12mrna或fgf12蛋白表达水平的制剂的用途。本发明的另一个目的是提供平滑肌细胞增殖性疾病的诊断方法，包括把含有测量fgf12mrna或fgf12蛋白表达水平的制剂的平滑肌细胞增殖性疾病诊断用组合物按照有效量投入到需要的个体。为了达到所述目的，本发明提供包含含有编码fgf12的多核苷酸的重组表达载体作为活性成分的平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物。为了达到本发明的另一个目的，本发明提供包含fgf12蛋白或其片段作为活性成分的平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物。为了达到本发明的另一个目的，本发明提供包含测量fgf12mrna或fgf12蛋白表达水平的制剂的平滑肌细胞增殖性疾病的诊断用组合物。为了达到本发明的另一个目的，本发明提供平滑肌细胞增殖性疾病的标志物检测方法，该方法为了提供诊断平滑肌细胞增殖性疾病所需的信息，包含(a)提供受试者的样本的步骤；及(b)测量所述样本中的fgf12表达水平的步骤；和(c)将所述fgf12的表达水平与正常人进行比较，把fgf12表达水平低于正常人的受试者判定为已患有或将可能患有平滑肌细胞增殖性疾病的步骤。为了达到本发明的另一个目的，本发明提供用于制备平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物的，含有编码fgf12的多核苷酸的重组表达载体的用途。为了达到本发明的另一个目的，本发明提供平滑肌细胞增殖性疾病的治疗方法，其特征在于，把包含含有编码fgf12的多核苷酸的重组表达载体作为活性成分的平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物按照有效量投入到需要的个体。为了达到本发明的另一个目的，本发明提供用于制备平滑肌细胞增殖性疾病治疗用制剂的，fgf12蛋白或其片段的用途。为了达到本发明的另一个目的，本发明提供平滑肌细胞增殖性疾病的治疗方法，包括把包含fgf12蛋白或其片段作为活性成分的平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物按照有效量投入到需要的个体。为了达到本发明的另一个目的，本发明提供用于制备平滑肌细胞增殖性疾病诊断用制剂的，测量fgf12mrna或fgf12蛋白表达水平的制剂的用途。为了达到本发明的另一个目的，本发明提供平滑肌细胞增殖性疾病的诊断方法，包含把含有测量fgf12mrna或fgf12蛋白表达水平的制剂的平滑肌细胞增殖性疾病诊断用组合物按照有效量投入到需要的个体。下面将对本发明进行详细说明。本发明提供包含含有编码fgf12的多核苷酸的重组表达载体作为活性成分的平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物。本发明人通过一系列实验，首次发现fgf12通过p53信号系统对抑制平滑肌细胞中的细胞增殖起到重要作用。尤其是，本发明人确认即使在促进平滑肌细胞增殖的条件(通过pdgf-bb或fbs等刺激)下，仍可通过过表达fgf12，抑制由于所述因素引起的平滑肌细胞的增殖。通过由本发明人发现的fgf12的功能，本发明的所述组合物可以用于治疗平滑肌细胞增殖性疾病的基因疗法。术语“基因疗法(genetherapy)”是指通过向治疗对象(或靶标，target)的细胞或组织递送具有治疗效果的基因，使其表达来治疗疾病。基因治疗可以局部应用于具有病理现象的细胞或组织，其优点为，可以预期因基因表达在相当长的时期内具有治疗效果。本发明的组合物，包含含有编码fgf12的多核苷酸的重组表达载体作为活性成分，并通过将fgf12基因递送至增殖中的平滑肌细胞并使fgf12基因过表达来抑制平滑肌细胞的增殖。如本文所用，术语“治疗”是指抑制疾病的发生或复发，缓解症状，减少疾病的直接或间接病理学后果，降低疾病进展速度，以及疾病状态的改善、好转、缓解或改善的预后。如本文所用，术语“预防”是指抑制疾病发作或延迟疾病进展的所有行为。术语“平滑肌细胞(smoothmusclecell，smc)”是指平滑肌的肌细胞。术语“平滑肌”是指没有水平纹的肌肉，也被称为无纹肌。在脊椎动物中，除心脏外的其他内脏的肌壁，即胃肠道、呼吸器官的呼吸道、血管、膀胱、子宫等的内部肌壁，其肌肉均为平滑肌。平滑肌不能有意识的移动，而平滑肌的收缩直接由自主神经系统控制并受激素的影响。本发明的平滑肌细胞可以优选血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell，vsmc)。“血管平滑肌细胞”为构成血管平滑肌的细胞，它形成和支持血管系统的结构，通过神经系统和激素的调节来收缩和舒张并调节血压和血流量。血管平滑肌细胞在健康状态下，高度表达平滑肌特异性基因(contractilegenes)如sma、sm22α、sm-mhc、sm-钙调蛋白(calponin)等，几乎不进行细胞增殖(proliferation)。另外，当由于血管伤口、动脉粥样硬化、炎症或其他血管疾病等情况下，作为恢复血管损伤的重构(remodeling)的一部分，发生活跃的细胞增殖和迁移(migration)，并发生基质(matrix)的合成和分泌增加等变化。如本文所用，术语“平滑肌细胞增殖性疾病”是指由平滑肌细胞过度增殖引起的疾病。本发明中的平滑肌细胞增殖性疾病可以优选为血管平滑肌细胞增殖性疾病。所述血管平滑肌细胞增殖性疾病不仅包括由血管平滑肌细胞增殖直接引起的疾病，例如血管狭窄(stenosis)、血管再狭窄(restenosis)、肺动脉高压、动脉硬化和动脉粥样硬化，还包括因所述疾病而二次诱发或症状加重的心血管疾病，例如心力衰竭、心肌梗塞、心绞痛、心律失常、先天性心脏病、中风和外周血管狭窄等。本发明中的血管平滑肌细胞增殖性疾病可以优选血管狭窄、血管再狭窄、肺动脉高压、动脉硬化、动脉粥样硬化。术语“血管狭窄(stenosis)”是指血管壁受损后因炎症、血栓发(thrombosis)、平滑肌细胞的过度增殖等导致血管的内部异常变窄，血流量减少的疾病。术语“血管再狭窄(restenosis)”是指血管狭窄的再发生，在大多数情况下，血管再狭窄发生在血管手术后，如扩张血管腔(lumen)或疏通堵塞的血管等手术。血管手术，如支架(stand)、球囊血管成形术(balloonangioplasty)等血管成形术、冠状动脉搭桥手术(coronaryarterybypasssurgery)等血管迂回术(血管搭桥术或血管移植术)，本身可能会损伤血管或引起炎症，导致血管狭窄。动脉硬化是在动脉内层发生脂肪沉积或纤维化的疾病，并且已知为了治疗动脉硬化和扩张血管插入支架后发生的血管再狭窄是由于血管平滑肌细胞的增殖、迁移和细胞外基质分泌引起的。由于所述手术或炎症、血管的损伤，血管内膜(intimalayer)的内皮细胞(endothelium)或平滑肌细胞存在的血管中膜(medialayer)受到损伤时，平滑肌细胞会迁移到内膜并具有细胞增殖和基质分泌状态的特征，从而形成血管新生内膜(neointimallayer)，并导致继续增殖即新生内膜过度增殖(neointimalhyperplasia)。结果导致血管壁增厚，血管腔(lumen)变窄。肺动脉高压(pulmonaryarterialhypertension，pah)是从心脏向肺部供血的肺动脉的血压变高，阻碍肺部血液循环的疾病。肺动脉血压在静息的状态下为25mmhg以上，及/或在运动状态下为30mmhg以上的情况被诊断为肺动脉高压，并可通过超声心动图、心电图、心导管检查、步行试验等确诊。肺动脉高压分为无疾病原因的特发性肺动脉高压和原发性疾病引起的继发性肺动脉高压。肺动脉高压的主要原因是构成肺动脉血管平滑肌细胞的异常增殖，结果伴随着血管重构(remodeling)，即血管壁增厚及肺血管内腔变窄的血管闭塞、血管收缩等，而血管内皮细胞的功能进一步降低。如果病情发展，血管内发生血栓，血液通过狭窄的肺动脉被释放，导致心脏的过载，发生呼吸困难、慢性疲劳、胸痛等症状，并在严重的情况下，发生昏厥或心脏麻痹。遗传性肺动脉高压(heritablepah)，约占肺动脉高血压的15～20％，已知与bmpr2和alk1等tgf-β超家族基因的常染色体显性突变相关联，而这些基因的突变还在许多非遗传肺动脉高压患者中也被发现。作为肺动脉高压的药物，目前已经开发出作用于血管内皮细胞促进血管扩张或抑制其收缩的内皮素受体拮抗剂(endothelinreceptorantagonist)如波生坦(bosentan)、安立生坦(ambrisentan)等，磷酸二酯酶-5抑制剂(phosphodiesterase(pde)-5inhibitors)如西地那非(sildenafil)、他达拉非(tadalafil)等，前列环素受体激动剂(prostacyclinreceptoragonist)如伊洛前列素(iloprost)、曲前列环素(treprostinil)、依前列醇(epoprostenol)等，但据报告80％以上的肺动脉高压患者对血管舒张剂治疗没有反应。(archersl等人circulation(2010),121:2045-2066)对于这些无反应的患者，通过血管扩张降低血压反而可能降低心输出量，存在症状恶化的风险。目前用于早期诊断肺动脉高压的有效诊断试剂和药物很少。本发明中术语“fgf12”是指成纤维细胞生长因子12(fibroblastgrowthfactor12)，并且也被称为fgf12、fgf12b、fhf1等。人fgf12已知具有两种亚型(isoform)，其mrna序列或氨基酸序列已通过nm_021032.4(fgf12亚型1，mrna)、np_066360.1(fgf12亚型1，蛋白质)、nm_004113.5(fgf12亚型2，mrna)、np_004104.3(fgf12亚型2，蛋白质)等基因银行收录号(genbankaccessionnumbers)公开。fgf12的序列和结构类似于其他成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，fgf)，但其生物化学可区分的特征有，由于缺少n-末端分泌信号序列(n-terminalsecretionsignalsequence)，不会分泌到细胞外，主要存在于细胞核或细胞质中，不激活细胞表面上的fgf受体等。因此，fgf12常被归类为fgf成纤维细胞生长因子同源因子(fgfhomologousfactor，fhf)。fgf12所属的fhf的生物学功能目前尚不清楚。据报告，发育中的或成熟的人、鼠、鸡等的神经系统中fhf表达水平高，若fhf功能受损会引起神经系统和行为异常(pablojl等人，神经科学家pii:1073858414562217)，但除神经系统以外，对fhf功能或相关信号传递系统的研究非常不足。在此，本发明人首次公开了fgf12在抑制平滑肌细胞增殖中起到重要作用。所述fgf12引起的平滑肌细胞增殖抑制作用与其他已知fgf促进各种细胞的分裂和增殖完全相反。非fhf的其他fgf家族的fgf，如fgf1和被称为bfgf(碱性fgf)的fgf2，已知通过各种信号系统促进血管平滑肌细胞的增殖(nabeleg等，nature362：844-6，reidyma等，circulation86：iii43-6)。本发明人发现的fgf12的具体功能如下。在本发明的一个实施例中，促进平滑肌细胞增殖的因子降低了fgf12的表达。用血小板源性生长因子同源二聚体(platelet-derivedgrowthfactorsubunitbhomodimer，pdgf-bb；50ng/ml)bb或血清(fbs；10％)刺激平滑肌细胞时，平滑肌细胞的分裂增加并且fgf12的表达明显减少。作为信号系统抑制试验的结果，pdgf-bb对fgf12表达的降低被证明是由pi3激酶(kinase)信号传导系统介导的。本发明的另一个实施例中，确认fgf12抑制平滑肌细胞的分裂。fgf12抑制平滑肌细胞的分裂与已知的其他fgf家族成员如fgf1或fgf2在各种细胞中促进平滑肌细胞增殖相反，这是完全没有预料到的效果。具体而言，fgf12抑制与细胞周期进程相关的cdk1、cdk2、ccna2、cdc6、cdc20等基因的表达。此外，用包含可操作地连接的fgf12的pcmv6重组表达载体转染的、过表达fgf12的平滑肌细胞中，细胞周期没有取得进展，并且在g1期的细胞的比例明显高于对照组。据证实，即使在通过平滑肌细胞增殖促进因子pdgf-bb或fbs刺激的平滑肌细胞中，若fgf12过表达，由所述增殖促进因子诱导的平滑肌细胞增殖也会被抑制。通过使用fgf12sirna的fgf12活性抑制试验也确认了fgf12对平滑肌细胞增殖的抑制作用。另外，在另一个实例中，本发明人发现所述fgf12对平滑肌细胞的作用由p53信号传导系统介导。作为分析fgf12过表达的平滑肌细胞中的差异表达基因(deg)的结果，观察到其中包含多数转录受p53调节的基因，并且在过表达fgf12的受损的动脉组织中，发现磷酸化的p53以与fgf12非常相似的模式表达。另外，在用fgf12过表达腺病毒(ad-fgf12)转染的平滑肌细胞中，通过sirna或抑制剂化合物(皮斐松(pifithrin)；10μm)抑制p53功能时，fgf12的平滑肌细胞抑制效果被抵消。本发明通过另外一个实施例，已经在体内证实fgf12的过表达对血管平滑肌细胞的增殖具有治疗作用。使用球囊取栓导管造成大鼠颈总动脉的血管损伤，并且用腺病毒感染大鼠以使fgf12过表达。结果，观察到血管新生内膜面积(neointimalarea)、内膜与中膜的面积比例(theintimaltomedialarearatio，i/m)、血管腔狭窄(luminalstenosis，％)等血管狭窄的指标大幅度降低。本发明人还表明，fgf12的细胞分裂和增殖抑制作用对平滑肌细胞是特异性的，而fgf12不影响内皮细胞(endothelialcell)。当用ad-fgf12转染人血管平滑肌细胞或血管内皮细胞(huvec)以过度表达fgf12时，表达细胞增殖标志物ki67的血管平滑肌细胞显著减少，但表达ki67的huvec的数目没有改变。通过本发明人查明的fgf12的细胞增殖抑制效果和作用机理，可预料利用包含编码fgf12的多核苷酸的重组表达载体，诱导平滑肌细胞中fgf12的过表达，可以此来预防或治疗平滑肌细胞的增殖。尤其fgf12的细胞增殖抑制作用对平滑肌细胞是特异性的，它不影响血管中的与平滑肌细胞紧密接触的内皮细胞。因此，可以预料，使用本发明可以减少对邻近细胞的副作用，因此可以开发与现有的其他同时抑制血管内皮细胞增殖活性的平滑肌细胞增殖抑制剂不同的、平滑肌细胞增殖性疾病的治疗剂。本发明中的平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物包含含有编码fgf12的多核苷酸的重组表达载体作为活性成分。如本文所用，术语“多核苷酸(polynucleotide)”或“核酸”是指单链或双链脱氧核糖核苷酸(dna)或核糖核苷酸(rna)。除非另有限制，包括以天然生成的核苷酸类似的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。编码本发明的fgf12的多核苷酸可以源自哺乳动物，优选人类。编码fgf12的多核苷酸可以包括人fgf12mrna的序列，并且最优选地,包含由seqidno：1或seqidno：3所示的核苷酸序列。此外，所述编码fgf12的多核苷酸还包括与人fgf12mrna的序列或优选与由seqidno：1或seqidno：3示的核苷酸序列具有实质同一性的序列。术语“实质同一性”是指，把人fgf12mrna序列与作为比较对象的任意其他序列进行整理使其最大程度相对应，使用本
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：中通常使用的分析方法和算法对序列进行比较分析时，显示出最少70％以上相同性的序列。通过与所述fgf12mrna核苷酸序列实质相同的核苷酸序列编码的蛋白质可以是fgf12蛋白，优选包含由seqidno：2或seqidno：4所示的氨基酸序列的蛋白质，或者fgf12蛋白的功能等同物。术语“功能等同物”是指，与本发明的fgf12的氨基酸序列的序列同源性(即同一性)至少为70％，优选至少为80％，更优选至少为90％的多肽，实质上显示与fgf12同质的生理活性的多肽。术语“实质上同质的生理活性”是指，通过在平滑肌细胞中表达并抑制增殖和移动的机制，诱导并维持平滑肌细胞的正常性质的活性。本说明书中，术语“表达(expression)”是指细胞中蛋白质或核酸的产生，术语“重组表达载体”是指在合适的宿主细胞中可表达靶蛋白或靶核酸(rna)的载体，是指一种基因构建物，其中包含必需的调节要素，该调节要素可操作地连接在一起，以表达多核苷酸(基因)插入物。术语“可操作地连接(operativelylinked)”是指为了执行一般功能，核酸表达调控序列与编码靶蛋白或rna的核酸序列的功能性连接(functionallinkage)，以通过表达调控序列来表达基因。术语“表达调控序列(expressioncontrolsequence)”是指，在特定宿主细胞中，控制可操作地连接的多核苷酸序列表达的dna序列。这些控制序列包括用于进行转录的启动子、用于调节转录的任何操纵序列、用于编码合适的mrna核糖体结合位点的序列、终止转录和翻译的序列、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号和增强子等。本发明的重组表达载体可以是克隆领域尤其是基因治疗领域中常用的载体，只要本领域技术人员可以选择的载体即可，对其种类没有特别限制，可包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体等，但不限于此。重组载体可以通过使用本领域已知的重组技术来制备，位点特异性dna切割和连接可使用本领域通常已知的酶等进行。因此，根据本发明的重组表达载体，含有编码fgf12的多核苷酸和在平滑肌细胞中表达fgf12而必需的表达调控序列，是将其可操作地连接的基因构建物。本发明的重组表达载体在制备时可包含选择标记和/或复制原点(replicationorigin)，用于选择宿主细胞，此外，所述表达载体可根据需要包含表达调控序列、膜定位或分泌信号序列、前导序列等，可包含报告(reporter)或标记(marker)基因序列来显示和确认平滑肌细胞的特异性收缩，可以根据不同用途多样化制备。另外，本发明中的重组表达载体可以是重组病毒载体。本发明的重组病毒载体，无特别限制，只要使用通常在基因治疗领域中递送基因的病毒载体即可。重组病毒载体可选自腺病毒载体、腺伴随病毒(aav)载体、逆转录酶病毒载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体、牛痘病毒载体和痘病毒载体组合的群。本发明中的重组病毒载体优选腺病毒载体。腺病毒因其中等大小的基因组(genome)、基因操作和制造的便利性、因高效价而易于生产和分离、靶(target)细胞范围广、转染效率高等优点，被广泛用作基因治疗领域中递送治疗用基因的载体。缺乏病毒的自动复制和生产能力的腺病毒，被广泛用在基因治疗中。本发明中包含含有编码fgf12的多核苷酸的重组表达载体作为活性成分的平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物，可通过基因治疗领域已知的各种递送方法施用到活体上。递送方法可包括裸dna注射(nakeddnainjection)、电穿孔(electroporation)、基因枪(genegun)、利用超声波的基因递送(声孔效应，sonoporation)、使用电磁场的基因递送(磁转染，magnetofection)、利用脂质体(liposome)或纳米颗粒(nanoparticle)等构造体的基因递送、利用病毒的基因递送等，本发明的组合物可以优选使用病毒，最优选使用腺病毒递送至平滑肌细胞。本发明组合物的合适剂量可综合考虑各种因素如配制方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、疾病严重程度、饮食、给药时间、给药途径、疗程、排泄速度和易感性等来确定并调整。本领域的技术人员可以根据上述因素确定有效的治疗剂量。在本发明的组合物用于平滑肌细胞增殖性疾病的基因治疗时，举例来说，本发明的组合物可以以1×105到的浓度包含含有编码fgf12的多核苷酸的腺病毒，并可以施用一次或多次。在本发明中，对用球囊损伤引起血管损伤的大鼠样本，以的浓度在损伤血管部位注射一次包含含有编码fgf12的多核苷酸的腺病毒，2周后确认了fgf12表达的治疗效果。根据本发明的组合物可以是口服或非口服给药，但优选非口服给药方式。非口服给药方式包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、经皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、肠道、局部、舌下或直肠内给药，优选血管内给药。本发明的组合物可根据给药途径，根据本发明所属领域已知的方法，与药学上可接受的载体一起不同地配制。“药学上可接受”指的是一种无毒组合物，生理上可接受，施用于人类时，不会抑制活性成分的作用，并且通常不会引起过敏反应或类似反应如胃肠道问题和头晕等。所述载体可包括所有种类的溶剂、分散介质、水包油或油包水型乳液、水性组合物、脂质体、微珠和微粒体。本发明的组合物采用非口服给药时，本发明的组合物可以与适合的非口服用载体，通过本发明所属领域已知的方法，配制成注射剂、经皮给药制剂、鼻腔吸入剂等制剂。所述注射剂必须灭菌，以防止微生物如细菌和真菌的污染。用于注射剂的合适载体可包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其混合物和/或含有植物油的溶剂或分散介质。更优选地，可以使用汉克斯溶液、林格氏溶液、含有三乙醇胺的磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，pbs)或注射用灭菌水、等渗溶液如10％的乙醇、40％的丙二醇及5％的葡萄糖等作为一个合适的载体。为了防止所述注射剂被微生物污染，注射剂可以进一步含有多种抗菌剂和抗真菌剂如对羟基本甲酸酯、异丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在大多数情况下，注射剂可以进一步包含等渗剂如糖或氯化钠等。经皮给药制剂的形式包括软膏剂、乳液剂、霜剂、凝胶剂、外用溶液剂、膏药、擦剂和气雾剂。所述“经皮给药”是指将本发明的组合物施用到局部皮肤以将组合物中含有的有效量的活性成分递送到皮肤上。例如，本发明的组合物可以制备为注射剂型并使用30号针轻微刺入(prick)皮肤，也可以直接涂抹在皮肤上。这些剂型已在制药化学领域已知的处方文献(雷明顿药物科学，remington'spharmaceuticalscience，第15版，1975，mack出版公司，easton，宾夕法尼亚)中所记载。在吸入剂的情况下，根据本发明使用的化合物可以使用合适的推进剂，例如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳等，或其他合适的气体，从加压包装或喷雾器中以气溶胶喷雾形式方便地递送。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供阀递送已测量的量来确定施用单位。例如，用于吸入器或吹入器的明胶胶囊和药筒可以配制成含有化合物和适当粉末材料如乳糖或淀粉的粉末混合物。其他药学上可接受的载体可参考以下文献的记载。(雷明顿药物科学，remington'spharmaceuticalsciences,19thed.,mack出版公司,easton,pa,1995)根据本发明的组合物可以进一步包含至少一种缓冲剂(例如盐溶液或pbs)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(例如edta或谷胱甘肽)、佐剂(例如氢氧化铝)、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。另外，本发明的组合物可以通过本领域已知的方法不同地配制，便于将组合物施用到哺乳动物后活性成分可以快速、持续或延迟释放。另外，本发明的组合物可以与已知的具有治疗平滑肌细胞增殖性疾病的效果的化合物组合给药。另外，本发明的组合物可以与通常的血管手术一起施用。另外，本发明提供包含fgf12蛋白或其片段作为活性成分的平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物。如本文所用，术语“蛋白质”与术语“多肽(polypeptide)”或“肽(peptide)”可互换使用，指例如通常在天然蛋白质中发现的氨基酸残基的聚合物。术语fgf12蛋白的“片段(fragment)”是指fgf12蛋白的一部分的肽。在此，本发明的所述fgf12蛋白可以来源于哺乳动物，优选来源于人。本发明的fgf12蛋白最优选为可以包含人fgf12蛋白的氨基酸序列，即由seqidno：2或seqidno：4所示的氨基酸序列。包含在所述本发明组合物中的fgf12蛋白是指具有与fgf12蛋白基本上等同的生理活性的蛋白质。具有基本等同生理活性的蛋白质包括fgf12蛋白的功能等同物(functionalequivalent)和功能衍生物(functionalderivative)。如本文所用，“功能等同物”是指展现出与fgf12蛋白相同的生理活性的多肽，也包括fgf12蛋白的片段。基本上等同的生理活性是指当被传递到平滑肌细胞中时抑制平滑肌细胞分裂和增殖的活性。所述功能等同物可以是与由seqidno：2或seqidno：4所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，并且更优选至少90％的序列同源性(homology)的多肽。所述功能等同物可以是fgf12的多态性(polymorphism)蛋白质，例如具有与fgf12蛋白基本上相同的生理活性的小核苷酸多态性(smallnucleotidepolymorphism，snp)蛋白质。所述功能等同物可以由添加、取代或缺失本发明中fgf12蛋白的氨基酸序列的一部分引起。在此，氨基酸的取代优选为保守性取代。天然存在的氨基酸的保守性取代的实例为脂肪族氨基酸(gly，ala，pro)、疏水性氨基酸(ile，leu，val)、芳香族氨基酸(phe，tyr，trp)、酸性氨基酸(asp，glu)，碱性氨基酸(his，lys，arg，gln，asn)和含硫氨基酸(cys，met)。另外，功能等同物包括从本发明的fgf12蛋白的氨基酸序列中缺失了一些氨基酸的变体。所述氨基酸的缺失或取代，优选位于与本发明的蛋白质的生理学活性不直接相关的区域。另外，氨基酸的缺失优选位于不直接参与本发明的fgf12蛋白的生理学活性的区域。功能等同物还包括一些氨基酸被添加到所述fgf12蛋白的氨基酸序列的两个末端或氨基酸序列中的变体。此外，本发明的功能等同物还包括维持fgf12蛋白的基本骨架和其生理活性并对蛋白质的化学结构具有一些修饰的多肽衍生物。例如，修饰包括用于改变本发明的fgf12蛋白的稳定性、储存性、挥发性或溶解性的结构修饰。另外，本发明的fgf12蛋白可以进一步包含化学官能团或细胞穿透肽(cell-penetratingpeptide，cpp)，用于将fgf12蛋白有效递送到平滑肌细胞中同时保持基本骨架和生理活性。所述细胞穿透肽本身可穿过细胞膜的磷脂双层结构，或是具有能够促进胞吞(endocytosis)作用的氨基酸序列的多肽，其实例包括但不限于hiv病毒-tat衍生的肽、vp22或运输蛋白(transportan)或穿膜肽(penetratin)的衍生的肽、大量含有细胞膜穿透信号序列或精氨酸/赖氨酸等带正电的氨基酸的肽、两亲性肽载体(amphipathicpeptidecarrier)等。本发明的fgf12蛋白可以通过基因工程方法构建。首先，通过常规方法构建编码fgf12蛋白的dna序列。dna序列可以使用合适的引物通过pcr扩增来构建。将构建的dna序列插入载体中，所述载体含有与该dna序列可操作地连接(operativelylinked)并控制该dna序列表达的一个或多个表达调控序列(例如启动子、增强子等)，并且通过由此构建的重组表达载体转化宿主细胞。将生成的性质转化体在适合表达所述dna序列的条件下及培养基中培养，从培养产物中回收由所述dna序列编码的基本上纯的多肽。所述回收可以使用本领域已知的方法(例如色谱法)进行。在此，术语“基本上纯的多肽”是指根据本发明的多肽基本上不含有来自宿主细胞的任何其他蛋白质。本发明的用于合成多肽的基因工程方法可参考下列文献：maniatisetal.,molecularcloning；alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,1982；sambrooketal.,supra；geneexpressiontechnology,methodinenzymology,geneticsandmolecularbiology,methodinenzymology,guthrie&fink(eds.),academicpress,sandiego,calif,1991；andhitzemanetal.,j.biol.chem.,255:12073-12080,1990.另外，本发明的fgf12蛋白可以根据本领域已知的技术化学合成(creighton，proteins：structuresandmolecularprinciples，w.h.freemanandco.，ny(1983))。也就是说，本发明的fgf12蛋白可以通过常规的逐步液相或固相合成、片段缩合、f-moc或t-boc化学方法制备(chemicalapproachestothesynthesisofpeptidesandproteins,williamsetal.,eds.,crcpress,bocaratonflorida,(1997)；apracticalapproach,atherton&sheppard,eds.,irlpress,oxford,england,(1989))。通过基因工程方法制备的重组肽或化学合成肽可以通过本领域已知的方法分离和纯化，如提取法、重结晶法、各种色谱技术(凝胶过滤、离子交换、沉淀、吸附、反相)、电泳、逆流分布法等。根据本发明的组合物可以以组合物本身或盐，优选药学上可接受的盐的形态使用。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指生理上可接受的，并且当施用于人时，通常不引起过敏反应或类似的反应，所述盐优选由药学上可接受的游离酸(freeacid)形成的酸加成盐。所述游离酸可以使用无机酸和有机酸。所述有机酸包括但不限于柠檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、甲酸、丙酸、草酸、三氯乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甲磺酸酸、乙醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、谷氨酸和天冬氨酸。另外、所述无机酸包括但不限于盐酸、溴酸、硫酸和磷酸。本发明的组合物,根据给药途径通过本领域已知的方法可以与药学上可接受的载体一起以各种方式配制，以显示平滑肌细胞增殖抑制作用。所述载体包括各种溶剂、分散介质、水包油或油包水乳剂、水性组合物、脂质体、微珠和微粒体。所述药物载体的具体实例如说明书的其他部分所述。给药途径可以是口服或非口服给药。非口服给药方式包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、经皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、肠道、局部、舌下或直肠内给药。所述给药途径的具体实例如说明书的其他部分所述。所述本发明的包含fgf12蛋白或其片段的组合物，可根据显示治疗效果的剂量施用给患者。通常，1日剂量约为0.0001至100mg/kg的范围。本发明的组合物可在优选剂量范围内1日1次或多次给药。但本发明的组合物的剂量可根据给药方式、给药对象、年龄、性别、体重、个体差异、疾病程度等进行适当调整。本发明提供包含测量fgf12mrna或fgf12蛋白表达水平的制剂的平滑肌细胞增殖性疾病的诊断用组合物。本发明人发现fgf12的表达与平滑肌细胞的增殖具有高度相关性。fgf12在健康血管的平滑肌细胞中高度表达，但在由血管手术损伤的血管或经历动脉硬化的血管中增殖的平滑肌细胞中，fgf12的表达大大降低。另外，通过促进平滑肌细胞增殖的pdgf-bb，可使fgf12的表达水平显著降低。利用所述fgf12与平滑肌细胞增殖之间的功能性相关关系可以测量fgf12的表达水平，并可以将其用于平滑肌细胞增殖性疾病的诊断。术语“诊断”是指鉴定病理状态的存在或特征。本发明中的诊断是检查是否存在平滑肌细胞增殖性疾病的病理状态，并确定疾病的发生或疾病发生的可能性。在本发明的诊断用组合物中，用于测量fgf12mrna表达水平的制剂可以是与fgf12mrna特异性结合的探针或引物组。本发明中的fgf12mrna可以包含由seqidno：1或seqidno：3所示的核苷酸序列。“引物(primer)”是充当dna合成起点(startingpoint)的短单链寡核苷酸(single-strandedoligonucleotide)。引物在合适的缓冲液(buffer)和温度条件下与作为模板(template)的多核苷酸特异性结合，dna聚合酶将具有与模板dna互补的碱基的核苷三磷酸添加到引物并连接来合成dna。引物通常由15至30个核苷酸的序列组成，并且与模板链结合的解链温度(meltingtemperature，tm)根据核苷酸构成和长度而变化。引物的序列不一定需要与模板的一些核苷酸序列完全互补，只要引物具有足够的互补性，在与模板杂交的过程中能够发挥其固有的作用即可。因此，本发明中用于测量fgf12mrna表达水平的引物不一定需要与fgf12基因序列完全互补，并且只要引物具有一定长度和互补性，使其符合通过dns合成扩增fgf12mrna或fgf12cdna的特定切片来测量fgf12mrna量的目的。所述用于扩增反应的引物由待扩增的fgf12mrna的特定区域的两端模板(或义，sense)与在相反侧(反义，antisense)分别互补结合的一组(一对)组成。本领域技术人员可以通过参考fgf12mrna或cdna的核苷酸序列来容易地设计引物。在本发明中，由于fgf12mrna优选包含由seqidno：1或seqidno：3所示的核苷酸序列，本发明的引物可以是与由seqidno：1或seqidno：3所示的核苷酸序列特异性结合的一组或一对，最优选地，本发明的引物组可以是由seqidno：15和seqidno：16所示的一组核苷酸序列。术语“探针(probe)”是指能够特异性结合特定基因mrna或cdna(complementarydna，互补dna)且长度为数个至数百个碱基对(basepair)的rna或dna等多核苷酸的片段,被标记(labeling)以检查待结合的靶mrna或cdna的存在与否或其表达水平。为了本发明的目的，通过将与fgf12mrna互补的探针和受试者的样本杂交(hybridization)来测量fgf12mrna的表达水平，用于诊断平滑肌细胞增殖性疾病。探针的选择和杂交条件可根据本领域已知的技术适当选择。本发明的引物或探针可以使用亚磷酰胺(phosphoramidite)固相合成法或其他已知的方法化学合成。另外，可以通过本领域已知的方法在与fgf12mrna的杂交不被干扰的范围内对引物或探针进行各种修饰。修饰的实例有甲基化、加帽、用其类似物取代至少一个天然核苷酸以及核苷酸之间的修饰例如用不带电链接子(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电链接子(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)修饰、使用荧光或酶与标志物(labelingmaterial)结合等。在本发明的诊断组合物中，用于测量fgf12蛋白表达水平的制剂可以是特异性结合fgf12蛋白的抗体。本发明中的fgf12蛋白可以优选包含由seqidno：2或seqidno：4所示的氨基酸序列。术语“抗体(antibody)”是指特异性结合抗原性部位的免疫球蛋白(immunoglobulin)。本发明中的抗体是仅与fgf12蛋白特异性结合但不与其他蛋白质即fgf12以外的其他fgf反应的抗体。将fgf12基因克隆到表达载体中以获得由该基因编码的蛋白质，并通过本领域常规方法从获得的蛋白质制备fgf12抗体。所述抗体包括多克隆抗体(polyclonalantibody)或单克隆抗体(monoclonalantibody)，并且包括与fgf12特异性结合的所有免疫球蛋白抗体。在本发明中，fgf12蛋白优选包含由seqidno：2或seqidno：4所示的氨基酸序列，而与fgf12蛋白特异性结合的抗体可以优选特异性结合包含由seqidno：2或seqidno：4所示的氨基酸序列的蛋白质的抗体。本发明提供平滑肌细胞增殖性疾病的标志物检测方法，该方法为了提供诊断平滑肌细胞增殖性疾病所需的信息，包含(a)提供受试者的样本的步骤；及(b)测量所述样本中的fgf12表达水平的步骤；和(c)将所述fgf12的表达水平与正常人进行比较，把fgf12表达水平低于正常人的受试者判定为已患有或将可能患有平滑肌细胞增殖性疾病的步骤。下面按照每个步骤对本发明的方法进行说明。本发明的方法中(a)步骤是提供受试者的样本的步骤。所述步骤(a)中受试者的样本可以是平滑肌细胞或含有平滑肌细胞的组织或血液，并且可以优选为血管平滑肌细胞或血管。本发明的样本可以来源于哺乳动物，并且可以优选来源于人。可以通过本领域已知的技术采集受试者的样本，例如可以提供血管手术中切除的血管组织或血液作为样本。另外，按照本领域已知的方法，根据用于测量fgf12表达水平的方法适当地预处理受试者的样本。例如，可以将受试者的样本固定在福尔马林(formalin)等固定剂(fixative)中，也可以使用液氮等进行快速冷冻，在-20℃～-70℃下冷冻保存。组织切片可以由固定的或冷冻的样本制备，然后冷冻储存。在本发明的方法中，步骤(b)是测量步骤(a)中提供的样本中fgf12的表达水平。所述步骤(b)中测量fgf12表达水平的步骤可以是测量fgf12mrna的表达水平。关于fgf12mrna的表达水平，可以通过使用特异性结合fgf12mrna的引物组或探针从受试者样本中扩增fgf12的mrna或cdna，或通过利用与探针的杂交(hybridization)反应来测量受试者样本中fgf12mrna的存在和表达水平。所述引物和探针如本发明的诊断组合物中所述。测量fgf12mrna的表达水平的方法，可以使用本领域常规的表达水平测量方法而没有限制，分析方法的实例包括但不限于反转录聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction，rt-pcr)、竞争性rt-pcr(competitivert-pcr)、实时rt-pcr(real-timert-pcr)、rna酶保护测定(rnaseprotectionassay，rpa)、诺瑟杂交(northernblotting)、dna微阵列芯片(dnamicroarraychip)、rna测序(rnasequencing)、使用纳米带(nanostring)的杂交或组织切片的原位杂交(insituhybridization)等。另外，步骤(b)可以是测量fgf12蛋白的表达水平的步骤。fgf12蛋白的表达水平可以通过使用特异性结合fgf12蛋白的抗体来检测和测量。所述抗体如本发明的诊断组合物中所述。对于fgf12蛋白表达水平的测量方法，可以使用本领域已知的方法而没有限制，例如可以包括但不限于蛋白质印迹(westernblotting)、斑点印迹(dotblotting)、酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay)、放射免疫测定(ria)、放射免疫扩散、琼脂免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀(immunoprecipitation)、补体结合分析、流式细胞术(facs)或蛋白芯片(chip)方法等。在本发明的方法中，步骤(c)是比较步骤(b)中测量的fgf12的表达水平与正常受试者的表达水平，然后把fgf12表达水平低于正常人的受试者判定为已患有或将可能患有平滑肌细胞增殖性疾病的步骤。通过所述步骤(b)中的方法测量受试者的fgf12表达水平，并通过相同的方法测量正常受试者的fgf12表达水平。然后，将受试者的fgf12表达水平与正常受试者的fgf12表达水平进行比较。根据本发明，健康的正常状态下的平滑肌细胞几乎不增殖并高水平表达fgf12，而fgf12表达水平在由血管损伤或疾病等引起的增殖中的平滑肌细胞中显著降低。因此，与正常受试者相比，当受试者的fgf12表达水平降低时，可以确定平滑肌细胞在增殖中。此外，根据fgf12表达水平的降低程度，可以确定受试者是否具有平滑肌细胞增殖性疾病的发病可能性，或已经患有该疾病或疾病处于发展阶段等。用作诊断标准的fgf12表达水平的降低程度，可以通过适合用于测量这种表达水平的特定方法，根据本领域已知的技术对其表达水平的程度进行分级来确定。例如，可以在多数正常受试者和多数患者的样本中测量fgf12表达水平，随后对所获得的数据进行累积和分析，从而可以根据fgf12表达水平程度分为正常范围、平滑肌细胞增殖性疾病范围(或疾病重症范围)或疾病发病可能性范围等，以此提供适当的诊断标准。具体而言，本发明的方法在实施例中具体示出。在本发明的实施例中，通过免疫荧光染色证实，用球囊栓塞切除术导管(balloonembolectomycatheter)弄伤的大鼠颈总动脉，与未受伤的正常动脉相比，表达ki67的增殖平滑肌细胞显著增加，并且fgf12的蛋白表达水平大大降低。同时，随着血管损伤恢复，增殖的平滑肌细胞数量减少，并且fgf12的蛋白表达水平增加至与正常状态类似的水平。血管损伤和恢复引起的fgf12表达水平的降低和增加倾向，还通过rt-pcr测量的mrna水平所证实。在本发明的另一个实施例中，证实fgf12蛋白在正常情况下在小鼠动脉的平滑肌细胞中高度表达，而用高脂饮食喂养的apo-/-小鼠的动脉平滑肌细胞增殖增加，并且fgf12蛋白的表达大幅度降低。通过免疫荧光染色实验证实，在人动脉粥样硬化动脉组织中，与动物实验相同，fgf12蛋白表达也大幅度降低。在本发明的又一个实施例中，通过免疫荧光染色和rt-pcr证实，注射野百合碱(monocrotaline，mct)诱导肺动脉高压的实验组大鼠与给予生理盐水(saline)的对照组相比，肺动脉血管平滑肌细胞中的fgf12蛋白表达大幅度降低，基因表达也大幅度降低。本发明提供用于制备平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物的，含有编码fgf12的多核苷酸的重组表达载体的用途。本发明提供平滑肌细胞增殖性疾病的治疗方法，其特征在于，把包含含有编码fgf12的多核苷酸的重组表达载体作为活性成分的平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物按照有效量投入到需要的个体。本发明提供用于制备平滑肌细胞增殖性疾病治疗用制剂的，fgf12蛋白或其片段的用途。本发明提供平滑肌细胞增殖性疾病的治疗方法，包括把包含fgf12蛋白或其片段作为活性成分的平滑肌细胞增殖性疾病治疗用组合物按照有效量投入到需要的个体。本发明提供用于制备平滑肌细胞增殖性疾病诊断用制剂的，测量fgf12mrna或fgf12蛋白表达水平的制剂的用途。本发明提供平滑肌细胞增殖性疾病的诊断方法，包括把含有测量fgf12mrna或fgf12蛋白表达水平的制剂的平滑肌细胞增殖性疾病诊断用组合物按照有效量投入到需要的个体。如本文所用，所述“有效量”是指当将组合物施用于个体时表现出平滑肌细胞增殖性疾病的改善、治疗、预防、检测或诊断效果的量。如本文所用，术语“个体”是指动物，优选哺乳动物，尤其是包括人的动物，并且可以是来源于动物的细胞、组织、器官等。所述个体可以是需要治疗的患者(patient)。本发明的所述“治疗”概括来说指改善平滑肌细胞增殖性疾病的症状，可包括治愈疾病、实质性预防或改善疾病的状况，并且可包括减轻、治愈或预防由平滑肌细胞增殖性疾病引起的一种症状或大多数症状，但不限于此。发明的效果：因此，本发明提供利用fgf12的用于预防、治疗和诊断平滑肌细胞增殖性疾病的组合物，以及利用所述fgf12的检测平滑肌细胞增殖性疾病的诊断标志物的方法。根据本发明，可通过使用编码fgf12的多核苷酸诱导平滑肌细胞中fgf12的过表达或通过将fgf12蛋白或其片段递送至平滑肌细胞中有效抑制平滑肌细胞的增殖。另外，用于测量本发明的fgf12的表达量的诊断用组合物和诊断标志物的检测方法可以用于诊断平滑肌细胞增殖性疾病，例如由于血管手术导致的血管狭窄、血管再狭窄、肺动脉高压和动脉硬化等。附图说明图1显示由于球囊损伤(ballooninjury)而受伤的大鼠颈动脉,损伤后随时间变化的fgf12的表达倾向的确认实验结果；图1a显示当损伤的大鼠颈动脉针对ki67(红色)、fgf12(绿色)和α-sma(红色)染色时的免疫荧光染色结果；细胞核用dapi(蓝色)染色，nc表示阴性对照(negativecontrol)组，比例尺(scalebar)为50μm；图1b显示了rt-pcr结果,说明fgf12和平滑肌细胞(smc)标记基因(sm-mhc、sm22α、srf)的mrna水平；gapdh被用作上样内参；图2显示进行动脉硬化中的小鼠和人的动脉中的fgf12表达倾向的确认实验结果；图2a显示当用正常饮食(nd)或高脂饮食(hfd)饲喂12周的apoe-/-小鼠的动脉,针对fgf12(绿色)和α-sma(红色)染色时的免疫荧光染色结果；细胞核用dapi(蓝色)染色,比例尺(scalebar)为50μm；图2b显示当正常人动脉(正常)和动脉硬化动脉(患者)针对fgf12(绿色)和α-sma(红色)染色时的免疫荧光染色结果；nc表示阴性对照(negativecontrol)组,比例尺(scalebar)为100μm；图3显示通过向大鼠注射野百合碱(mct)制备的肺动脉高压动物模型中，确认fgf12在肺血管平滑肌细胞中的表达倾向的实验结果；图3a显示用盐水(saline)或野百合碱(mct)注射5周后在肺组织中针对fgf12的免疫荧光染色结果；图3b显示通过rt-pcr在肺动脉高压动物模型中分析fgf12mrna表达的结果，表明fgf12表达在肺动脉高压动物模型中与免疫荧光染色结果类似即显著降低；图4显示出fgf12表达受pdgf-bb调节的实验结果；图4a的左侧面板显示用pdgf-bb(50ng/ml)刺激3小时或24小时的人平滑肌细胞(hasmc)中fgf12、cdk1和sm-mhcmrna表达倾向的rt-pcr结果；图4a的右侧面板显示用pdgf-bb(50ng/ml)刺激3小时或24小时的人肺动脉平滑肌细胞(hpasmc)中fgf12和sm-mhcmrna表达倾向的rt-pcr结果；图4b的左侧面板显示当在含有或不含有pdgf-bb(50ng/ml)的基础培养基中培养1天的hasmc，针对fgf12(绿色)染色时的免疫荧光染色图像；细胞核用dapi(蓝色)染色，比例尺(scalebar)为50μm；图4b的右侧面板显示当在含有或不含有pdgf-bb(50ng/ml)的基础培养基中培养1天的hpasmc，针对fgf12(绿色)染色时的免疫荧光染色图像；细胞核用dapi(蓝色)染色，比例尺(scalebar)为50μm；图4c显示由fgf12启动子控制的荧光素酶报告基因载体(pgl3-fgf12)或对照载体(pgl3-basic)转染48小时后测量的萤光素酶活性；*表示p<0.05和n＝5；图4d显示用pdgf-bb(50ng/ml)刺激并用信号传导抑制剂(ly294002、pd98059、u0126、sb203580、birb796)处理的hasmc中表达的fgf12和cdk1mrna的rt-pcr结果；图5显示在hasmc中表达受fgf12调节的基因的分析实验结果；图5a为维恩图(venndiagram)，显示通过未转染的野生型(wt)hasmc、pcmv6-entry转染的hasmc(pentry)和pcmv6-fgf12转染的hasmc(pfgf12)的多重比较得出的deg数；图5b显示了使用戴维的功能注释聚类(functionalannotationclusteringfromdavid)识别的362个deg的基因本体论项(geneontology(go)term)。p值使用-log表示；图5c显示了rt-pcr结果，表明fgf12和细胞周期相关基因的表达模式；图6显示了fgf12对细胞周期的影响的实验结果；图6a显示了facs结果，用于分析野生型hasmc(wt)、空载体转染的hasmc(pentry)和fgf12过表达的hasmc(pfgf12)的细胞周期；图6b是定量显示图6a得出的细胞的细胞周期分布的柱状图；图6c显示了mts实验结果，说明fgf12对fbs(10％)诱导的hasmc细胞增殖的影响。对于wt和pentry，*表示p<0.05和n＝5；图6d显示了mts实验结果，说明fgf12对pdgf-bb(50ng/ml)诱导的hasmc细胞增殖的影响；对于wt和pentry，*表示p<0.05和n＝5；图6e显示了mts实验结果，说明fgf12对pdgf-bb(50ng/ml)诱导的hpasmc细胞增殖的影响。对于wt和pentry，*表示p<0.05和n＝6；图7显示当野生型(wt)或由sirna转染的hasmc(contsirna，fgf12sirna)针对细胞增殖标志物ki67(绿色)染色时的免疫荧光染色结果；细胞核用dapi(蓝色)染色，比例尺(scalebar)为50μm；各个hasmcs中被ki67染色的细胞定量分析用下方的柱状图表示；对于wt和pentry，*表示p<0.05和n＝5；图8显示了说明由fgf12诱导的hasmc增殖抑制和p53的功能关系的实验结果；图8a为rt-pcr结果，用于显示在野生型或转染的(pentry，pfgf12)hasmc中表达的p53和p21mrna水平；转染的hasmc中的mrna水平用wthasmc中的mrna的相对值表示；*表示p<0.05和n＝4；图8b为蛋白质印迹结果，用于显示在野生型或转染的hasmc中表达的fgf12、p53和磷酸化p53(p-p53)的蛋白质水平；β-肌动蛋白(β-actin)被用作上样内参；图8c显示由于球囊损伤而受损的大鼠颈动脉针对fgf12(绿色)和p-p53(红色)染色时的免疫荧光染色结果；细胞核用dapi(蓝色)染色，比例尺为50μm；图9显示出实验结果，用于说明p53表达或功能障碍对hasmc增殖的影响；图9a显示了rt-pcr结果，用于确认为了fgf12过表达用腺病毒(ad-fgf12)转染，用p53sirna(25nm或50nm)或对照sirna(contsirna)转染24小时后hasmc中p53的表达；gapdh表示上样内参；图9b显示用sirna(contsirna，p53sirna)转染经腺病毒转染(ad-lacz，ad-fgf12)或未转染(wt)的hasmcs后，通过ki67染色分析的细胞增殖倾向；图9c显示了经腺病毒转染或未转染的hasmc用p53抑制剂即皮斐松(pifithrin)(10μm)或pbs的处理后，通过ki67染色分析的细胞增殖倾向；对于对照组，*表示p<0.05，n＝4和ns＝不显著；图9d显示用腺病毒转染或未转染的hasmc用p53抑制剂即皮斐松(pifithrin)(10μm)或pbs处理后，通过ki67染色分析的细胞增殖倾向；对于对照组，*表示p<0.05，n＝6和ns＝不显著；图10显示出实验结果，用于说明fgf12过表达对血管新内膜(neointima)形成的影响；图10a显示在用腺病毒(ad-lacz或ad-fgf12)转染后，在施加球囊损伤后两周，大鼠颈总动脉(commoncarotidartery)的h&e染色图像；比例尺为200μm；图10b显示了施加球囊损伤的大鼠颈总动脉的形态分析(morphometricanalysis)结果；血管新生内膜面积(neointimalarea)与内膜中膜面积比(intimatomediaarearatios，i/m)和管腔狭窄(luminalstenosis，％)的定量分析结果用柱状图表示；*表示p<0.05和n＝5；图10c显示了用腺病毒(ad-lacz，ad-fgf12)转染后施加球囊损伤的大鼠颈总动脉中，fgf12(绿色)的表达模式和通过ki67(红色)染色的细胞增殖模式的免疫荧光染色结果；放大图10c左侧图标示的白色虚线部分，并显示该部分；图10c右侧图的白色箭头表示ki67高水平表达的增殖中的细胞，比例尺为200μm；图11显示出实验结果，用于说明fgf12过表达对人血管平滑肌细胞和血管内皮细胞增殖的影响；图11a显示在用ad-fgf12转染或未用病毒处理的huvec细胞或hasmc细胞中针对fgf12(绿色)和ki67(红色)的免疫荧光染色结果；细胞核用dapi(蓝色)染色；在huvecad-fgf12图像上，白色*标记表示在ad-fgf12转染的huvec中同时表达fgf12和ki67的细胞；在hasmcad-fgf12图像上，白色箭头标记表示在ad-fgf12转染的hasmc中表达ki67而不表达fgf12的细胞；图11b为的柱状图，通过被ki67染色的细胞的百分比(％)定量显示图11a的ki67染色结果。具体实施方式下面将详细说明本发明。下面说明的实施例，是为了帮助理解本发明的示例性说明，本发明的内容不局限于以下实施例。<实验方法>动物实验使用9至10周龄的雄性斯泼累格·多雷(sprague-dawley，sd)大鼠(rat,orient)和载脂蛋白e-敲除(apolipoproteine-knockout,apoe-/-)小鼠(日本slc)进行动物实验。大鼠喂养正常饮食(normalchowdiet)，不限制供水。apoe-/-小鼠喂养正常饮食(normaldiet)或西式高脂饮食(western-typehigh-fatdiet，hfd；脂肪占总热量的42％，0.15％胆固醇；researchdiets)4周。按照美国国立卫生研究院(unitedstatesnationalinstitutesofhealth)出版的“实验动物护理和使用指南(guideforthecareanduseoflaboratoryanimals)”对所有动物进行照护。所有动物实验的方案均由机构动物管理及使用委员会(institutionalanimalcareandusecommittee)批准。为了进行外科手术，通过腹膜内注射氯胺酮(ketamine)(小鼠，79.5mg/kg；大鼠，80mg/kg)和甲苯噻嗪(xylazine)(小鼠：9.1mg/kg；大鼠5mg/kg)麻醉小鼠和大鼠。通过监测踏板撤回反射(pedalwithdrawalreflex)来评估适量麻醉水平。大鼠颈动脉损伤模型为了获得大鼠颈动脉损伤模型(ratcarotidinjurymodel)，将sd大鼠麻醉并通过中线颈部切割暴露颈总动脉(commoncarotidartery)。向颈外动脉插入2ffogarty球囊栓塞切除导管(2ffogartyballoonembolectomycatheter，baxter)并且推进到胸主动脉中进行充气，随后导管被收回到插入点。整个过程重复3次。使用腺病毒的基因传递，将1×109空斑形成单位(plaque-formingunits)/100ml浓度的腺病毒注射到颈总动脉的结扎段(ligatedsegment)中30分钟。然后永久结扎颈外动脉，恢复颈总动脉血流。在球囊损伤(ballooninjury)后两周，采集颈总动脉进行组织学评估。形态分析为了进行形态分析(morphometricanalysis)，将颈动脉固定，脱水并包埋在石蜡中。颈动脉组织切片(5μm)用苏木精和伊红(hematoxylin&eosin，h&e)染色。由不知道实验条件(blinded)的研究者,使用从每个受损动脉段的中间分离的三个切片进行形态分析。使用元素成像软件(niselementsimagingsoftware，nikon)测量内膜/中膜面积比(i/m)、管腔狭窄(luminalstenosis，％)和新生内膜面积(neointimalarea)。人动脉硬化组织临床研究方案(clinicalresearchprotocol)经当地伦理委员会(localethicalcommittee，irb2014-04-077；韩国三星医疗中心)批准，并获得所有患者的知情同意。从接受颈动脉内膜切除术(carotidendarterectomy)的患者获得人动脉硬化组织。为进行免疫组织化学检查，将收集的组织用福尔马林固定并包埋在石蜡中。肺动脉高压动物模型为了制备大鼠肺动脉高压动物模型，将sd大鼠分成对照组和野百合碱(monocrotaline)组。将野百合碱(300mg；monocrotaline，mct)溶于1.8ml的1mhcl中，加入3～4ml蒸馏水，用1mnaoh将ph调至7.4，加入蒸馏水，制成15ml水溶液。野百合碱组皮下注射野百合碱水溶液(60mg/kg)一次，对照组皮下注射等量的生理盐水。实验通过牺牲注射野百合碱后5周的动物来进行。免疫荧光染色免疫荧光染色(immunofluorescencestaining)通过将组织切片和细胞用针对ki67(dakoinc.)、fgf12(abcam)、磷酸化p53(p-p53；cellsignalingtechnology)、α-平滑肌肌动蛋白(smoothmuscleactin，α-sma；sigma)或sm22α(abcam)的一抗和适当的用荧光标记的二抗(分子探针，molecularprobes)染色来实施。细胞核用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，dapi)染色。使用荧光显微镜(nikon)观察染色的细胞。示意图显示出独立的三次实验的图像。逆转录聚合酶链式反应用trizol试剂(invitrogen)分离用于逆转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,rt-pcr)的细胞或组织的总rna(totalrna)。接下来，使用特异于相应基因的引物和上标第一链合成试剂盒(superscriptfirst-strandsynthesiskit,invitrogen)从总rna合成cdna，并通过pcr扩增30～35个循环。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,gapdh)作为上样内参。使用sybr-greenpcrmastermix(使用biosystems)和steponeplustm实时pcr系统(使用biosystems)进行实时pcr。根据δδct方法分析数据，并将基因表达值标准化为gapdh表达。用于pcr反应的引物列于下表1中。表1引物核苷酸序列primernucleotidesequences细胞培养在平滑肌生长培养基(smoothmusclegrowthmedium,，smgm；sciencellresearchlaboratories)或基础培养基中培养人主动脉血管平滑肌细胞(humanaorticvascularsmoothmusclecell，hasmc；sciencellresearchlaboratories)和人肺主动脉血管平滑肌细胞(humanpulmonaryaorticvascularsmoothmusclecell，hpasmc，sciencellresearchlaboratories)。对于化合物抑制剂实验，将hasmc和hpasmc用皮斐松(10μm；sigma公司)、ly294002(20μm；cellsignalingtechnology)、pd98059(50μm；cellsignalingtechnology)、u0126(10μm；cellsignaling技术)、sb203580(50μm；cellsignalingtechnology)和birb796(10μm；merck)在37℃下预处理(pretreatment)24小时。转染用于fgf12过表达的转染(transfection)，使用编码与人fgf12cdna具有100％氨基酸序列同源性的大鼠同源基因(origene)的表达载体(c端标记为myc-ddk的pcmv6-entry)。根据制造商的方案使用lipofectamientm2000用pcmv6-fgf12(pfgf12)或pcmv6-entry(pentry)对照载体转染hasmc和hpasmc，并选择使用g418(sigma)2周。fgf12或p53抑制表达实验中，使用lipofectamientm2000，用特异性或非特异性小干扰rna(smallinterferingrna，sirna；gehealthcare)转染亚汇合(subconfluent)hasmcs。sirna核苷酸序列显示在表2中。表2sirna核苷酸序列sirnanucleotidesequencecdna微阵列根据制造商的方案(affymetrixgenchiphumangene1.0st寡核苷酸阵列)进行cdna微阵列(microarray)分析。简而言之，使用rneasyminikit柱(qiageninc.)，从等量的总rna合成生物素标记的cdna。根据genechipwholetranscriptsensetargetlabelingassay手册(affymetrix)进行cdna探针杂交(hybridization)，使用genechiparrayscanner30007g(affymetrix)扫描芯片，并使用affymetrix命令控制台软件(affymetrixcommandconsolesoftware,版本1.1)进行分析。使用p值不超过0.05(p<0.05)的探针进行分析，根据鲁棒多阵列平均归一化法(robustmulti-arrayaveragenormalizationmethod)进行归一化。将具有2倍以上表达转录物(transcript)水平差异的基因定义为差异表达基因(differentiallyexpressedgenes，degs)。使用数据库为annotation，利用可视化和集成发现(visualizationandintegrateddiscovery，david)对派生的deg进行基因本体论(geneontology，go)术语富集(termenrichment)分析。细胞周期分析为进行细胞周期分析(cellcycleanalysis)，使细胞血清饥饿(serumstarvation)，并用smgm刺激24小时。接下来，将细胞用胰蛋白酶处理，洗涤并在-20℃用70％乙醇固定。然后将细胞重悬于碘化丙啶(propidiumiodide，pi)缓冲液(50μg/mlpi，0.1％triton-x，0.1mmedta，0.05mg/mlrna酶)中，并使用bdfacscalibur(becton，dickinsonandcompany)进行分析。使用软件分析细胞周期分布。细胞增殖分析对于细胞增殖分析(cellproliferationanalysis)，将细胞一式三份(triplicate)接种在24孔板中，并在补充有50ng/ml血小板源性生长因子-bb(plateletderivedgrowthfactor-bb，pdgf-bb；r&dsystems)或10％fbs的基础培养基中培养。通过mts测定(mts测定；promega)或使用抗ki67igg(dako)的免疫荧光测定来确定细胞增殖。从每个样本中随机获取五个代表性彩色图像以定量ki67染色细胞(ki67+细胞)，并且通过将ki67+细胞的平均值除以每个图像上的细胞总数来测定ki67+细胞的百分比。萤光素酶报告基因测定为了萤光素酶报告基因测定(luciferasereportererassay)，将大约2000个碱基对(basepair)的fgf12基因的5'-utr克隆到萤火虫萤光素酶报告载体(fireflyluciferasereportervector,pbl3-phfgf12)中。hasmcs用空载体(pgl3-basic)或pbl3-phfgf12，与活性持续型(constitutivelyactive)β-半乳糖苷酶(galactosidase)报道质粒共转染。48小时后，使用萤光素酶和半乳糖苷酶(galactosidase)测定试剂盒(stratagene)分析萤光素酶和半乳糖苷酶活性。将荧光素酶活性对半乳糖苷酶活性标准化，并表示为与用pgl3-basic转染并在含有pdgf-bb(50ng/ml)的培养基中培养1天的hasmc中测量的荧光素酶活性相比的相对值。腺病毒的制备为了制备腺病毒(adenovirusproduction)，使用padeasy-1载体(qbiogene)将人fgf12cdna亚克隆到pshuttle-cmv载体中以构建重组腺病毒质粒。用于该实验的重组腺病毒由viraquestinc.制备并纯化。蛋白质印迹通过sds-page分离细胞裂解液(lysate)，并用印迹转移蛋白条带。将印迹与合适的一级抗体例如fgf12(abcam)、p-p53(cellsignalingtechnology)、p53(bdbiosciences)或β-actin(santacruz生物技术)等反应，随后与辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)缀合的二级抗体反应。通过化学发光试剂(chemiluminescentreagent,,amershambiosciences)确认与抗体反应的蛋白条带。统计分析所有数据均以平均值±标准误差(means±sem)表示。统计学显著性采用单因素方差分析(onewayanalysisofvariance)进行评估，然后进行邦弗朗尼事后多重比较检验(bonferroni’sposthocmultiplecomparisontest)。p<0.05的p值被认为是统计学显著的。采样(sample)数量用n表示。<实施例1>fgf12在受损动脉中的差异表达倾向<1-1>在球囊损伤的动脉中fgf12表达的降低检查了受损动脉中fgf12的表达模式。在正常大鼠主动脉的中膜(mediallayer)中表达α-smc(α-smc+)的平滑肌细胞(smc)中fgf12高度表达(第0天，图1a)。然而，在球囊损伤(ballooninjury)后第7天，增殖(ki67+)中的新生血管内膜和不表达α-smc(α-smc-)的非收缩性平滑肌细胞的中fgf12表达显著降低。损伤进行部分恢复的第15天，新生血管内膜中的α-smc+平滑肌细胞中的fgf12水平再次增加。通过rt-pcr可证实，血管损伤诱导的fgf12表达水平随时间的变化与平滑肌细胞收缩标志物sm-mhc、sm22α和srf的表达的变化同步进行(图1b)。<1-2>动脉硬化中fgf12表达的降低检查了动脉硬化动脉中fgf12的表达模式。作为动脉硬化动物模型，在高脂饮食喂养的apoe-/-小鼠中，显示动脉中的fgf12表达模式与主动脉斑块(aorticplaque)中的α-smc表达模式几乎一致(图2a)。在人动脉硬化患者动脉粥样硬化组织标本的免疫组织化学分析中，fgf12在α-smc+中膜平滑肌细胞中选择性表达，并且动脉硬化损伤部位的α-smc-平滑肌细胞中fgf12表达显著降低。这些结果与动物模型中的结果一致(图2b)。<1-3>肺动脉高压中fgf12表达的降低在肺动脉高压动物模型中检测fgf12的表达模式。在由野百合碱(mct)注射诱导的肺动脉高压动物模型中，fgf12表达显著降低(图3a，mct)，并且在正常大鼠中显示高表达模式(图3a，盐水)。从通过rt-pcr确认的fgf12表达模式证实，与生理盐水注射组相比，mct注射组中的fgf12基因表达显著降低(图3b)。上述实验结果表明fgf12的表达水平与血管平滑肌细胞的增殖密切相关。也就是说，fgf12在非增殖平滑肌细胞中高表达，而fgf12的表达水平在增殖中的平滑肌细胞中显著降低。<实施例2>通过血管平滑肌细胞增殖因子pdgf-bb调节fgf12的表达检查了fgf12表达是否受强有力的血管平滑肌细胞分类促进物质(mitogen)pdgf-bb调节。通过rt-pcr证实，在基础培养基中加入pdgf-bb3小时后，人主动脉平滑肌细胞(humanaorticsmoothmusclecell，hasmc)和人肺动脉平滑肌细胞(humanpulmonaryaorticvascularsmoothmusclecell，hpasmc)中fgf12的mrna水平大大降低(图4a)。在pdgf-bb刺激24小时后，fgf12的mrna水平进一步降低，增殖标志物cdk1增加，并且可收缩基因sm-hmc减少。还可以通过免疫荧光实验证实，在用pdfgf-bb处理的hasmc和hpasmc中fgf12的表达水平降低(图4b)。使用fgf12启动子的报告实验结果表明，当从基础培养基中去除pdgf-bb时，fgf12启动子的转录活性(transcriptionalactivity)显著增加(图4c)，这验证了pdgf-bb在转录水平上抑制fgf12的表达。为了检测pdgf-bb信号系统的fgf12表达调节机制，在用各种信号传导抑制剂(inhibitor)处理后，通过rt-pcr检测fgf12的表达模式(图4d)。pi3激酶(kinase)(pi3k)抑制剂ly294002消除了在hasmc中pdgf-bb诱导的fgf12表达的下降。然而，mek、erk或p38mapk信号传导抑制剂不影响fgf12的表达。也就是说，它表明pdgf-bb通过pi3k信号传导抑制fgf12基因的转录。类似地，确认了用促进血管平滑肌细胞的增殖的fbs刺激的hasmc和hpasmc中，fgf12的表达显著降低(数据未显示)。<实施例3>利用fgf12抑制血管平滑肌细胞增殖<3-1>利用fgf12的基因表达调节通过在hasmc中的fgf12过表达的功能获得实验(gainoffunction)和利用微阵列(microarray)的基因测定图谱分析，检查了fgf12是否可以调节血管平滑肌细胞的增殖。基因表达谱比较分析的结果证实，在fgf12过表达的hasmc(pfgf12)和两种类型的对照组(野生型(wt)hasmc和用空载体转染的hasmc(pentry))之间共有362个基因是差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,deg)(图5a)。对362个deg的go富集(goenrichment)分析的结果显示，在fgf12过表达的hasmc中，生物学过程如细胞周期、对dna损伤的应答、微管细胞骨架组织(microtubulecytoskeletonorganization)和染色质组装和分解(chromaticassemblyanddisassembly)发生了深刻的改变(图5b)。特别地，通过rt-pcr证实，在fgf12过表达的hasmc中，参与细胞周期进展的几个基因(cdk1、cdk2、ccna2、cdc6、cdc20)的表达显著降低(图5c)。<3-2>通过fgf12抑制细胞分裂进一步分析了fgf12表达对细胞周期的影响。细胞的细胞周期状态的分析结果中，为了fgf12过表达而转染的hasmc中g1期细胞的比例显著高于对照组(图6a和图6b)。mts细胞增殖实验结果也表明，在fgf12过表达的hasmc中血清(serum)诱导的或pdgf-bb诱导的细胞增殖被显著抑制(图6c和图6d)。此外，为了过表达fgf12而转染的hpasmc中，pdgf-bb诱导的细胞增殖也受到显著抑制(图6e)。上述实验结果表明，fgf12的过表达足以抑制血清诱导的或pdgf-bb诱导的hasmc和hpasmc的增殖。此外，还分析了fgf12的表达对抑制hasmc静止期的细胞分裂是否是必需的。将hasmc在不含血清或pdgf-bb的基础培养基中培养3天。在这种饥饿(starvation)条件下使用fgf12sirna抑制fgf12表达，并用ki67染色，观察到用fgf12sirna处理的hasmc中细胞增殖大大增加(图7)。上述结果证实，fgf12的表达对于抑制饥饿状态的hasmcs静息期细胞分裂是必不可少的。<实施例4>通过fgf12在抑制平滑肌增殖中对p53信号传递的活化<4-1>通过fgf12调节p53表达为了揭示fgf12抑制hasmcs细胞增殖的分子机制，分析了fgf12与p53之间的功能关系。首先，深入分析实施例<3-1>中的微阵列的结果，发现在过表达fgf12的hasmc的deg中包括转录受p53调节的多种基因(cdkn1a、cdk1、ccne、brca1、ccnb1、mdm2)，揭示出fgf12过表达可能激活p53信号系统。作为rt-pcr的结果，与野生型(wt)hasmc和空载体(pentry)转染的hasmc相比，在fgf12过表达的hasmc中p53直接转录的p53和p21的mrna水平显著增加(图8a)。通过蛋白质印迹也证实，fgf12过表达的hasmc中p53蛋白和磷酸化p53蛋白(phosphorylatedp53，p-p53)的水平大大增加(图8b)。在大鼠颈动脉损伤组织样本中fgf12和p-p53的表达谱也非常相似(图8c)。在正常大鼠主动脉的中膜(第0天)中的表达fgf12的smc中检测到高水平的p-p53，但在新生内膜(neointimallayer)中在不表达fgf12的大多数smc中未检测到p-p53(第7天)。同时，在第15天，当smc在新生内膜中表达fgf12时，在新内膜中的许多表达fgf12的smc中的检测到p-p53。上述实验结果表明，fgf12的表达与血管平滑肌细胞中的p53的表达密切相关。<4-2>p53在fgf12诱导的细胞增殖抑制中的作用为了揭示fgf12诱导的hasmc细胞增殖抑制中的p53功能，利用p53sirna和p53抑制化合物抑制p53信号系统，研究对hasmc和hpasmc细胞增殖的影响。用p53sirna转染通过含有fgf12的腺病毒(ad-fgf12)感染的hasmc，然后证实了p53sirna显著降低p53mrna水平(图9a)。用p53sirna敲除(knockdown)p53表达的hasmc中，fgf12诱导的细胞增殖抑制作用也降低(图9b)。类似地，p53抑制剂皮斐松(pifithrin)也发挥显著改善ad-fgf12转染的hasmc的细胞增殖的作用(图9c)。另外，p53抑制剂皮斐松(pifithrin)也显示出显著改善ad-fgf12转染的hpasmc的细胞增殖的效果(图9d)。上述实验结果表明，fgf12通过促进p53的表达和活化来抑制hasmc和hpasmc的增殖。<实施例5>fgf12过表达对体内血管损伤的治疗作用使用颈动脉球囊损伤模型检查fgf12过表达是否可以抑制血管损伤诱导的新生内膜(neointima)的形成。使用腺病毒在具有球囊损伤的颈动脉的大鼠中过表达fgf12，并且对受损血管的变化进行免疫组织学分析(图10)。在球囊损伤后第14天，与用ad-lacz腺病毒转染的对照血管壁相比，用ad-fgf12腺病毒转染的血管壁明显较薄(图10a)，血管损伤的所有指标如新生内膜面积、内膜/中膜面积比例(intima/mediaratio，i/m)和管腔狭窄(luminalstenosis，％)均显著降低，并且新生内膜形成总体减少约50％(图10b)。另外，与对照组相比，用ad-fgf12腺病毒转染的血管显示极低数量的表达ki67的细胞，与对照组相比显示出极低的细胞分裂和增殖程度(图10c)。以上结果表明，在体内血管中fgf12过表达可以抑制损伤血管的新生内膜形成。<实施例6>fgf12过表达对血管内皮细胞增殖的影响检测了fgf12对血管内皮细胞(vascularendothelialcell)增殖的影响。使用腺病毒在人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell，huvec)或人主动脉平滑肌细胞(hasmc)中过表达fgf12(ad-fgf12)，然后对细胞增殖标志物ki67蛋白进行免疫荧光染色。结果，如在上述实施例中所证实的，观察到fgf12过表达显著降低人主动脉平滑肌细胞(hasmc)中的细胞分裂和增殖(图11)。对每种类型的细胞中表达ki67的分裂中的细胞的数目显示在图11b中。与未转染病毒的细胞相比，ad-fgf12转染的hasmc显示出表达ki67的细胞的数量显著减少，而大多数表达ki67的细胞是不表达fgf12的(图11a，hasmcad-fgf12，由白色箭头表示的细胞)。相反，虽然在huvec中用ad-fgf12转染使fgf12过表达，但在huvec中表达ki67的细胞的数量与未转染病毒的细胞相比数目没有很大差异。特别地，在ad-fgf12转染的huvec中观察到高水平表达fgf12和ki67的细胞(图11a，huvec_ad-fgf12，由白色*标记的细胞)，由此明确显示出fgf12的表达不影响内皮细胞的分裂。上述实验结果表明，fgf12对血管平滑肌细胞具有特异性的细胞增殖抑制作用，对血管内皮细胞的分裂和增殖无抑制作用。产业利用可能性：如上所述，通过使用包含编码fgf12的多核苷酸或fgf12蛋白作为活性成分的本发明组合物，可以用于开发能够有效抑制平滑肌细胞增殖的基因或蛋白质治疗剂。特别是，由于本发明的组合物不会影响与血管平滑肌细胞相邻的内皮细胞，因此可以用于开发对血管平滑肌细胞具有特异性且副作用少的治疗剂。此外，本发明的用于测量fgf12的表达量的诊断用组合物和诊断标志物检测方法可以有效地利用于开发血管狭窄、血管再狭窄、肺动脉高压和动脉硬化等平滑肌细胞增殖性疾病用诊断试剂或试剂盒。序列表<110>中央大学校产学协力团<120>利用fgf12的血管平滑肌细胞增殖性疾病的诊断、预防或治疗用组合物<130>dag35789<150>pct/kr2016/008575<151>2016-08-03<150>kr10-2015-0113727<151>2015-08-12<160>45<170>kopatentin2.0<210>1<211>732<212>dna<213>humanfgf12isoform1mrna<400>1atggctgcggcgatagccagctccttgatccggcagaagcggcaggcgagggagtccaac60agcgaccgagtgtcggcctccaagcgccgctccagccccagcaaagacgggcgctccctg120tgcgagaggcacgtcctcggggtgttcagcaaagtgcgcttctgcagcggccgcaagagg180ccggtgaggcggagaccagaaccccagctcaaagggattgtgacaaggttattcagccag240cagggatacttcctgcagatgcacccagatggtaccattgatgggaccaaggacgaaaac300agcgactacactctcttcaatctaattcccgtgggcctgcgtgtagtggccatccaagga360gtgaaggctagcctctatgtggccatgaatggtgaaggctatctctacagttcagatgtt420ttcactccagaatgcaaattcaaggaatctgtgtttgaaaactactatgtgatctattct480tccacactgtaccgccagcaagaatcaggccgagcttggtttctgggactcaataaagaa540ggtcaaattatgaaggggaacagagtgaagaaaaccaagccctcatcacattttgtaccg600aaacctattgaagtgtgtatgtacagagaaccatcgctacatgaaattggagaaaaacaa660gggcgttcaaggaaaagttctggaacaccaaccatgaatggaggcaaagttgtgaatcaa720gattcaacatag732<210>2<211>243<212>prt<213>humanfgf12isoform1protein<400>2metalaalaalailealaserserleuileargglnlysargglnala151015arggluserasnseraspargvalseralaserlysargargserser202530proserlysaspglyargserleucysgluarghisvalleuglyval354045pheserlysvalargphecysserglyarglysargprovalargarg505560argprogluproglnleulysglyilevalthrargleuphesergln65707580glnglytyrpheleuglnmethisproaspglythrileaspglythr859095lysaspgluasnserasptyrthrleupheasnleuileprovalgly100105110leuargvalvalalaileglnglyvallysalaserleutyrvalala115120125metasnglygluglytyrleutyrserseraspvalphethrproglu130135140cyslysphelysgluservalphegluasntyrtyrvaliletyrser145150155160serthrleutyrargglnglngluserglyargalatrppheleugly165170175leuasnlysgluglyglnilemetlysglyasnargvallyslysthr180185190lysproserserhisphevalprolysproilegluvalcysmettyr195200205arggluproserleuhisgluileglyglulysglnglyargserarg210215220lysserserglythrprothrmetasnglyglylysvalvalasngln225230235240aspserthr<210>3<211>546<212>dna<213>humanfgf12isoform2mrna<400>3atggagagcaaagaaccccagctcaaagggattgtgacaaggttattcagccagcaggga60tacttcctgcagatgcacccagatggtaccattgatgggaccaaggacgaaaacagcgac120tacactctcttcaatctaattcccgtgggcctgcgtgtagtggccatccaaggagtgaag180gctagcctctatgtggccatgaatggtgaaggctatctctacagttcagatgttttcact240ccagaatgcaaattcaaggaatctgtgtttgaaaactactatgtgatctattcttccaca300ctgtaccgccagcaagaatcaggccgagcttggtttctgggactcaataaagaaggtcaa360attatgaaggggaacagagtgaagaaaaccaagccctcatcacattttgtaccgaaacct420attgaagtgtgtatgtacagagaaccatcgctacatgaaattggagaaaaacaagggcgt480tcaaggaaaagttctggaacaccaaccatgaatggaggcaaagttgtgaatcaagattca540acatag546<210>4<211>181<212>prt<213>humanfgf12isoform2protein<400>4metgluserlysgluproglnleulysglyilevalthrargleuphe151015serglnglnglytyrpheleuglnmethisproaspglythrileasp202530glythrlysaspgluasnserasptyrthrleupheasnleuilepro354045valglyleuargvalvalalaileglnglyvallysalaserleutyr505560valalametasnglygluglytyrleutyrserseraspvalphethr65707580proglucyslysphelysgluservalphegluasntyrtyrvalile859095tyrserserthrleutyrargglnglngluserglyargalatrpphe100105110leuglyleuasnlysgluglyglnilemetlysglyasnargvallys115120125lysthrlysproserserhisphevalprolysproilegluvalcys130135140mettyrarggluproserleuhisgluileglyglulysglnglyarg145150155160serarglysserserglythrprothrmetasnglyglylysvalval165170175asnglnaspserthr180<210>5<211>20<212>dna<213>ratfgf12forward<400>5gcgatagccagctccttgat20<210>6<211>20<212>dna<213>ratfgf12reverse<400>6gaagcgcactttgctgaaca20<210>7<211>20<212>dna<213>ratsm-mhcforward<400>7aaagccagatgtccgaagca20<210>8<211>20<212>dna<213>ratsm-mhcreverse<400>8agatctgctactggggtgga20<210>9<211>21<212>dna<213>ratsm22aforward<400>9accaagccttttctgcctcaa21<210>10<211>20<212>dna<213>ratsm22areverse<400>10ggttctcaggcaccttcact20<210>11<211>20<212>dna<213>ratsrfforward<400>11acgaccttcagcaagaggaa20<210>12<211>20<212>dna<213>ratsrfreverse<400>12gagagtctggcgagttgagg20<210>13<211>20<212>dna<213>ratgapdhforward<400>13ctcatgaccacagtccatgc20<210>14<211>20<212>dna<213>ratgapdhreverse<400>14ttcagctctgggatgacctt20<210>15<211>20<212>dna<213>humanfgf12(total)forward<400>15gcgatagccagctccttgat20<210>16<211>20<212>dna<213>humanfgf12(total)reverse<400>16gaagcgcactttgctgaaca20<210>17<211>20<212>dna<213>humanfgf12(exo)forward<400>17agcttggtttctgggactca20<210>18<211>24<212>dna<213>humanfgf12(exo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