冻干法稳定疫苗的制作方法

发明领域本发明涉及药物组合物，例如疫苗，以及制备和使用这样的组合物的方法。发明背景接种疫苗是医学最伟大的成就之一，使数以百万计的人免受毁灭性疾病的影响。在疫苗广泛使用前，传染病每年仅在美国就杀死了数以千计的儿童和成年人，同样在世界各地杀死了更多得多的人。接种疫苗广泛用于预防和治疗细菌、病毒和其他病原体所致的感染，接种疫苗也是用于预防和治疗癌症的方法。疫苗接种中使用一些不同的方法，包括灭活病原体，活减毒病原体和灭活病原体亚单位给药。就病毒感染而言，已发现活疫苗带来最有效和持久的保护性免疫应答。已经开发出抗黄病毒的活减毒疫苗，黄病毒是通常通过感染的蚊子或壁虱传播的小的包膜正链RNA病毒。黄病毒科家族的黄病毒属包括大约70种病毒，其中许多如黄热病(YF)、登革热(DEN)、日本脑炎(JE)和森林脑炎(TBE)病毒是主要的人类病原体(综述BurkeandMonath，FieldsVirology，4thEd.，1043-1126，2001)。不同的方法已用于开发抗黄病毒的疫苗。就黄热病病毒而言，例如两种疫苗(黄热病17D和法国嗜神经疫苗)已通过连续传代进行开发(Monath，“YellowFever，”InPlotkinandOrenstein，Vaccines，3rded.，Saunders，Philadelphia，pp.815-879，1999)。用于接种疫苗的黄病毒减毒的另一方法包括构建包括两种不同黄病毒组分的嵌合黄病毒。了解这种嵌合体如何构建需要解释黄病毒基因组的结构。黄病毒蛋白是通过翻译单个、长开放阅读框生成多蛋白，之后是一系列复杂的宿主以及病毒蛋白酶对多蛋白的翻译后蛋白水解，生成成熟的病毒蛋白(Ambergetal.，J.Virol.73：8083-8094，1999；Rice，“Flaviviridae，”InVirology，Fields(ed.)，Raven-Lippincott，NewYork，1995，VolumeI，p.937)。病毒结构蛋白以C-prM-E的顺序在多蛋白中排列，其中“C”是衣壳，“prM”是病毒包膜结合M蛋白的前体，“E”是包膜蛋白。这些蛋白质出现在多蛋白的N端区域，而非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)位于多蛋白的C端区域。已制备的嵌合黄病毒包括来自不同黄病毒的结构和非结构蛋白。例如所谓的ChimeriVaxTM技术采用黄热病17D病毒衣壳蛋白和非结构蛋白，以递送其他黄病毒的包膜蛋白(prM和E)(参见例如Chambersetal.，J.Virol.73：3095-3101，1999)。这项技术已用来开发针对登革热、乙型脑炎(JE)、西尼罗(WN)和圣路易斯脑炎(SLE)病毒的候选疫苗(参见例如Pugachevetal.，NewGenerationVaccines，3rded.，Levineetal.，eds.，MarcelDekker，NewYork，Basel，pp.559-571，2004；Chambersetal.，J.Virol.73：3095-3101，1999；Guirakhooetal.，Virology257：363-372，1999；Monathetal.，Vaccine17：1869-1882，1999；Guirakhooetal.，J.Virol.74：5477-5485，2000；Arroyoetal.，TrendsMol.Med.7：350-354，2001；Guirakhooetal.，J.Virol.78：4761-4775，2004；Guirakhooetal.，J.Virol.78：9998-10008，2004；Monathetal.，J.Infect.Dis.188：1213-1230，2003；Arroyoetal.，J.Virol.78：12497-12507，2004；和Pugachevetal.，Am.J.Trop.Med.Hyg.71：639-645，2004)。对疫苗成功使用和商业化而言最重要的是以何种方式处理和配制疫苗，以确保在使用前疫苗运输和储存条件下稳定和疗效的保持。冷冻干燥是一些疫苗产品处理中涉及的方法，本质上是低压下通过升华去除水，留下内有少量水分的干饼产物的冻干过程。此过程可能对疫苗是有利的，包括如上所述的嵌合黄病毒疫苗，因为这样的疫苗往往在低湿度环境中更稳定。冷冻干燥还可以增加产物的存储温度，使其更易于运输。影响冻干过程有效性的关键因素是疫苗的制剂。例如可取的是通过除去水，所述制剂提高产品的稳定性。通常疫苗制剂将包含任何或全部下列成分：填充剂(如糖)、稳定剂(如糖或蛋白质)以及缓冲剂。因此如上所讨论的，开发有效和高效的加工方法和制剂对临床上有用和商业上成功的疫苗，包括黄病毒疫苗的开发都是非常重要的。发明概述本发明提供包括一种或多种活减毒黄病毒疫苗、一种或多种稳定剂，一种或多重填充剂以及一种或多种缓冲剂成分的组合物。在一个实施例中，该稳定剂是人血清白蛋白(HSA)(例如非重组人血清白蛋白(HSA)或重组人血清白蛋白(rHA))(例如约0.05-2.0％或0.1％)。可以包括在本发明组合物中的填充剂的例子是乳糖(例如约2-10％或4％)和/或甘露醇(例如约2-10％或5％)，而可以包括在组合物中的缓冲剂成分的例子是组氨酸(例如约1-20mM或10mM)和/或谷氨酸钾(例如约20-80mM或50mM)。组合物可以是冻干形式或冻干前的液体形式。此外，组合物的pH值可以是例如6-10、7-9、7.5-8.5或7.9-8.1。包括在本发明组合物中的活的减毒疫苗可以是例如嵌合黄病毒，如包括第一黄病毒的结构蛋白和第二不同黄病毒的非结构蛋白的嵌合黄病毒。在一个实施例中，这样的嵌合黄病毒包括第一黄病毒的前膜/膜和包膜蛋白，以及第二不同黄病毒的衣壳和非结构蛋白。第一和第二黄病毒可以独立地选自黄热病(例如YF17D)、日本脑炎、登革热-1、登革-2、登革热-3、登革热-4、墨莱溪谷脑炎、圣路易脑炎、西尼罗、库宁、罗西奥脑炎、Ilheus、中欧脑炎、西伯利亚脑炎、俄罗斯春夏脑炎、Kyasanur森林病、Alkhurma、鄂木斯克出血热、跳跃病、Powassan、Negishi、Absettarov、Hansalova、Apoi和Hypr病毒。在具体实施例中，第一黄病毒为日本脑炎病毒或西尼罗病毒，第二黄病毒是黄热病病毒(例如YF17D)。本发明还包括的是包括一种或多种基于蛋白和/或病毒的药物、人血清白蛋白(例如非重组人血清白蛋白(HSA)或重组人血清白蛋白(rHA))(例如约0.05-2.0％或0.1％)、谷氨酸碱金属盐(如谷氨酸钾)(例如约20-80mM或50mM)、一种或多种额外氨基酸(例如组氨酸)(例如约1-20mM或10mM)，以及一种或多种糖或糖醇(如乳糖和/或甘露醇)(例如约2-10％、4％或5％)。组合物可以是冷冻干燥形式或冻干前的液体形式。此外组合物的pH值可以是例如6-10、7-9、7.5-8.5或7.9-8.1。在一个实施例中，基于病毒的药品包括天花疫苗(如牛痘病毒或减毒痘苗病毒，例如ACAM1000、ACAM2000或改良安卡拉痘苗(MVA))。在另一实施例中，基于蛋白的药品包括乙型肝炎病毒核心蛋白融合体(如乙型肝炎病毒核心蛋白融合体进一步包括一种或多种流感M2e肽)。此外，在另一实施例中，基于蛋白的药物包括艰难梭菌的毒素或类毒素。本发明还包括制备药物组合物的方法，其包括将如上所述的那些组合物冻干处理。此过程可包括冷冻、一次干燥和二次干燥。在实施例中，冷冻步骤包括约-50℃下冷冻约120分钟。一次干燥步骤可以包括温度递变(ramp)步骤，其包括温度递变约+0.1℃/分钟至搁板温度约-40℃，保持约500分钟；温度递变约+0.1℃/分钟至搁板温度约-35℃，保持约500分钟；温度递变约+0.1℃/分钟至搁板温度约-30℃，保持约500分钟；温度递变约+0.1℃/分钟至搁板温度约-25℃，保持约800分钟。在此实施例中，二次干燥步骤可包括温度递变步骤，其包括温度递变约+0.1℃/分钟至搁板温度约+20℃，保持约800分钟。在另一实施例中，冷冻步骤可以包括在约-40℃冷冻约60分钟。一次干燥步骤可包括温度递变步骤，其包括温度递变约+0.5℃/分钟至搁板温度约-5℃，保持约300分钟；以及温度递变约-0.5℃/分钟至搁板温度约-0℃，保持约300分钟。二次干燥步骤可包括温度递变步骤，其包括温度递变约+0.2℃/分钟至搁板温度约+30℃，保持约600分钟；以及温度递变约-1.0℃/分钟至搁板温度约+5℃，保持约9999分钟。本发明还包括预防或治疗受试者一种或多种疾病的方法，其包括如上所述或本文其他地方所述，施用一种或多种本发明的组合物。在这些方法的某些实施例中，受试者有黄病毒(例如日本脑炎病毒、西尼罗病毒、登革热病毒或黄热病病毒感染)、天花、流感或艰难梭菌发展的风险，或有以上病毒。此外，本发明包括在如本文所述的疾病的预防和治疗中本文所述的组合物和制剂的用途，以及用于这些目的的药品的制备。一般而言，如果本发明的物质或组合物给药前，受试者没有所述疾病或感染，则执行所述方法以“预防”受试者的疾病或感染。如果受试者有这样的疾病或感染，则执行该方法以“治疗”疾病或感染。可以进行预防和/或治疗以减少如不给药则出现的所述影响，或消除这种影响。本发明提供若干好处。例如如上所述，对包括蛋白和/或病毒成分的药物组合物，如疫苗的有效使用而言，关键是在不同的运输和储存条件下保持组合物稳定。如下文进一步讨论的，本发明提供制剂和加工步骤，制备具有提高的稳定性的组合物。本发明的其他特征和优点从以下详细说明、附图和权利要求是显而易见的。附图说明图1为实验JEPD-018中，37℃储存时效价损失图。图2为实验WNPD-033中，有和没有组氨酸的稳定性图。图3为实验WNPD-045中，37℃下有和没有谷氨酸钾的稳定性图。图4为实验JEPD-145中，37℃下不同浓度乳糖的稳定性图。图5为与37℃下甘露醇/乳糖组合比较单一糖制剂的稳定性图。图6为退火样品中，37℃储存的效价损失图。图7为4％乳糖溶液的热分析图，其玻璃化温度为-32.6℃。图8为当5％甘露醇加到制剂中时，玻璃转化温度降低约6℃至-38℃的热分析图。图8显示5％甘露醇、4％乳糖制剂退火的DSC热分析图。图9为-80℃时，最终制剂的实时稳定性图。图10是使用调制式DSC分析以提高分辨率的WNPD-045样品的热分析图。图11是无需使用调制式扫描即表现足够分辨率的JEPD-172样品的热分析图。图12是所示实验中冻干的ChimeriVaxTM残留水分的稳定性的相互关系。图13是实验JEPD-151的热电偶温度图。详细说明本发明提供可用于制备基于病毒和/或蛋白的药品，包括活病毒疫苗的制备的组合物和方法，进一步介绍如下。本发明的组合物包括如下所述已发现在疫苗制备中有利的成分(例如尤其是稳定剂、填充剂和缓冲剂)，而所述方法包括涉及也是有利的冻干的步骤。本发明还提供了采用本文所述组合物的预防和治疗方法。本发明的组合物和方法进一步说明如下。本发明的组合物包括一种或多种基于蛋白和/或病毒的治疗药物，以及一种或多种稳定剂、填充剂，和/或缓冲成分。本发明的组合物的具体实施例以下进一步详述，包括嵌合黄病毒疫苗、作为稳定剂的人血清白蛋白(0.1％)、作为填充剂的甘露醇(5％)和乳糖(4％)，以及作为缓冲组分的组氨酸(10mM)和谷氨酸钾(50mM)。如下所述，除了此具体实施例，本发明还包括其中这些类型成分的特性和/或数量改变的组合物。本发明的组合物中可出现的稳定剂包括血清白蛋白蛋白。优选血清白蛋白蛋白人血清白蛋白(HSA)，无论重组或非重组形式。可包括在本发明所述组合物中的血清白蛋白蛋白的另外的例子是牛血清白蛋白。除了血清白蛋白，可包括在本发明组合物中的其他稳定剂是明胶，如人明胶(如可以是野生型或基因工程的重组人明胶)和猪明胶、酪蛋白、PVP，及本文提及的任何稳定剂(或本领域已知的其他)的组合。就人血清白蛋白而言，此成分的量可以是例如约0.05-2.0％、0.075-1.0％或0.1％。可存在于本发明组合物中的填充剂包括糖，如乳糖、蔗糖和果糖，和/或糖醇，如甘露醇和山梨醇。正如下文进一步讨论的，在包括甘露醇的本发明组合物中，对此组分而言优选无定形，而非结晶形式。此外，在某些实施例中，本发明的组合物可优选包括糖和/或糖醇的组合。在一个实施例中，下文进一步阐述的，本发明的组合物可以包括乳糖和甘露醇的组合，后者优选无定形形式。在一个实施例中，乳糖为约1-10％、2-8％或4-6％(例如4％)，而甘露醇为约1-10％、2-8％或4-6％(如5％)。正如以上所指出的，除了稳定剂和填充剂，本发明的组合物可包括缓冲组分，如氨基酸，这可能有助于保持例如某一特定pH水平或范围，和/或产物稳定性。可包括在本发明组合物中的缓冲组分的一个例子是组氨酸，可能出现在组合物中的浓度为约例如1-20、5-15或10mM。缓冲组分的另一个例子是谷氨酸碱金属盐，如谷氨酸钠或钾，组合物中存在的浓度为约10-100、25-75或50mM。此外，所述组合物一般pH值为例如6-10、7-9、7.5-8.5或7.9-8.1。本发明的组合物还包括一种或多种活性治疗成分，其可为基于肽或蛋白的治疗药物，以及病毒，如活的减毒病毒疫苗。后一组治疗药物(活减毒病毒疫苗)类型的例子是黄病毒疫苗，如黄热病病毒疫苗。这样的黄热病病毒疫苗的例子是YF17D疫苗株(，Smithburnetal.，“YellowFeverVaccination，”WorldHealthOrg.，p.238，1956；Freestone，inPlotkinetal.(eds.)，Vaccines，2ndedition，W.B.Saunders，Philadelphia，1995)。其他黄热病病毒株，如YF17DD(GenBank检索号U17066)和YF17D-213(GenBank检索号U17067)(dosSantosetal.，VirusRes.35：35-41，1995)，YF17D-204France(X15067，X15062)，YF17D-204，234US(Riceetal.，Science229：726-733，1985；Riceetal.，NewBiologist1：285-296，1989；C03700，K02749)，和Galleretal.，Vaccine16(9/10)：1024-1028，1998所描述的黄热病病毒株，也可以存在于本发明的组合物中。可在本发明的组合物中存在的其他黄病毒包括其他蚊子传播的黄病毒，如日本脑炎(例如SA14-14-2)，登革热(血清型1-4)、墨莱溪谷脑炎、圣路易脑炎、西尼罗、库宁、Rocio脑炎，Ilheus病毒；蜱传黄病毒，如中欧脑炎、西伯利亚脑炎、俄罗斯春夏脑炎，Kyasanur森林病、Alkhurma、鄂木斯克出血热、跳跃病、Powassan、Negishi、Absettarov、Hansalova、Apoi和Hypr病毒，以及丙型肝炎病毒属病毒(如丙型肝炎病毒)。除了上面列出的病毒以及其他黄病毒，嵌合黄病毒也可以包括在本发明的组合物中。这些嵌合体可以由黄病毒(即骨架黄病毒)组成，其中结构蛋白(或多种结构蛋白)已经被第二病毒(即待测或预定的病毒，例如黄病毒；参见例如美国专利号6,696,281；美国专利号6,184,024；美国专利号6,676,936和美国专利号6,497,884)的相应结构蛋白(或多种结构蛋白)取代。例如，所述嵌合体可由骨架黄病毒(如黄热病病毒)组成，其中所述黄病毒的膜和包膜蛋白已被第二待测病毒(例如西尼罗病毒、登革热病毒(血清型1、2、3或4)、日本脑炎病毒，或其他病毒，如任何本文提及的那些)的膜和包膜取代。嵌合病毒可以从任意组合的病毒制备，但通常需要针对哪种病毒的免疫力，则所述病毒就是插入的结构蛋白的来源。可包括在本发明组合物的嵌合病毒类型的具体例子是黄热病人疫苗株YF17D，其中膜蛋白和包膜蛋白已被另一黄病毒，如西尼罗病毒、登革热病毒(血清型1、2、3或4)、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒，墨莱溪谷脑炎病毒，或任何其他黄病毒，如以上所列那些之一的膜蛋白和包膜蛋白取代。使用此方法制备的嵌合黄病毒已被指定为所谓的“ChimeriVax”病毒。使用ChimeriVaxTM技术制备，保藏在布达佩斯条约确认的美国弗吉尼亚马纳萨斯的美国菌种保藏中心(ATCC)，保藏日期1998年1月6日的以下嵌合黄病毒可用于制备本发明的病毒：嵌合黄热病17D/登革热2型病毒(YF/DEN-2；ATCC检索号ATCCVR-2593)和嵌合黄热病17D/日本脑炎SA14-14-2病毒(YF/JEA1.3；ATCC检索号ATCCVR-2594)。可用于本发明的嵌合病毒的详细信息在例如下列出版物中提供：WO98/37911；WO01/39802；Chambersetal.，J.Virol.73：3095-3101，1999；WO03/103571；WO2004/045529；U.S.专利号6,696,281；U.S.专利号6,184,024；U.S.专利号6,676,936；和U.S.专利号6,497,884。能在本发明的组合物中出现，并可以包括特定减毒突变的嵌合黄病毒的另外具体例子例如在WO02/072835、WO02/102828、WO03/103571、WO2004/045529、WO2005/082020、WO2006/044857、WO2006/116182和U.S.专利号6,589,531中描述。可出现在本发明组合物中的另外的病毒疫苗包括天花疫苗(例如基于牛痘病毒的疫苗，包括ACAM1000、ACAM2000、改良安卡拉痘苗(MVA)，和Lister，以及基于猴痘的疫苗)以及疱疹病毒和疫苗(如HSV-1及其重组体，以及HSV-2及其重组体)(参见例如美国专利号7,115,270)。除了病毒，本发明的组合物还可以包括治疗或疫苗肽或蛋白，例如乙型肝炎核心蛋白融合体构建物(如与一种或多种流感肽例如M2e融合的乙型肝炎核心蛋白；参见例如WO2005/055957)和艰难梭菌类毒素疫苗(包括例如类毒素A和/或B)。上述及本文其他地方所述的组合物可以是冻干形式，或液体形式，如冻干过程之前或之后的形式。正如本文其他地方进一步详细讨论的，由于活性组分的稳定性，本发明的组合物尤其有利，活性组分的稳定性主要是由于制剂以及包括冻干的产物制备过程。一般来说，这个过程包括以下步骤：冷冻、一次干燥、二次干燥和加塞。这个过程在以下实验性实施例中进一步详细说明，但所述过程的例子如下。冷冻步骤中冻干机搁板预冷至-50℃。一旦所有托盘放上样品，搁板保持在-50℃120分钟。在一次干燥步骤中，真空设置为25mT，并进行以下温度递变步骤：温度递变+0.1℃/分钟至搁板温度-40℃，保持500分钟；温度递变+0.1℃/分钟至搁板温度-35℃，保持500分钟；温度递变+0.1℃/分钟至搁板温度-30℃，保持500分钟；温度递变+0.1℃/分钟至搁板温度-25℃，保持800分钟。在二次干燥步骤中，真空保持为25mT，并进行温度递变步骤：温度递变+0.1℃/分钟至搁板温度+20℃，保持800分钟。如有必要，产品可在20℃、25mT最多再保持24小时，然后加塞。在加塞步骤中，用0.22μm过滤的干燥氮气对室内脱气，真空设为800mbar(略有真空)，并将塞子挤到小瓶中。可用于本发明的另一冻干循环总结在下表中。表1-另一冻干循环因此，本发明的所述方法可以包括在或至约例如-70℃至-30℃(例如-60℃至-40℃，或-50℃)冷冻。冷冻可以进行约30至240分钟(例如60至120分钟)或更长的时间。如本文所述，所述材料可随后进行一个或多个干燥步骤。在这些步骤中，可使用真空(例如25mT)，温度可以经一段时间(如100-1000分钟，例如200-600或300-500分钟)，逐步改变(例如0.1至1.0℃/分钟，或0.5℃/分钟)。在一次干燥中，温度可提高到或约例℃-30℃至+10℃，例如-20℃至+5℃或-15℃至0℃，而在二次干燥中，温度可改变至例如+5℃至+35℃，例如10℃至30℃，或15℃至20℃。正如本领域技术人员所知的，这些参数(如温度、保持时间，温度递变速率和真空水平)可以基于例如得到的结果改变。配制前，可包括在本发明组合物中的病毒(包括嵌合体)可以使用本领域的标准方法制备。例如，病毒基因组相应的RNA分子可引入原代细胞、鸡胚或二倍体细胞系，则子代病毒就可从中(或其上清)纯化。可用于制备所述病毒的另一方法采用异倍体细胞，如Vero细胞(Yasumuraetal.，NihonRinsho21：1201-1215，1963)。在此方法中，病毒基因组相应的核酸分子(例如RNA分子)引入异倍体细胞，从其中培养细胞的培养基收集病毒，收集的病毒用核酸酶(例如降解DNA和RNA的核酸内切酶，如BenzonaseTM；美国专利号5,173,418)处理，核酸酶处理的病毒浓缩(例如通过使用截留分子量例如500kDa的滤器超滤)，为接种疫苗之目的配制浓缩的病毒。这种方法的详细资料在WO03/060088A2中提供，其全部在此引作参考。本发明的疫苗组合物可以作为一线预防性药物施用于那些有感染风险的人，或可用作为二线药物治疗患者。由于这些组合物的一些中病毒是减毒的，它们尤其适合施用于“有风险的个体”，如老年人、儿童，或艾滋病毒感染者。这样的疫苗还可以用于兽医的情况，例如给马接种疫苗抗西尼罗病毒感染，或给鸟(例如有价值的、濒危的或驯养的鸟类，分别例如火烈鸟、秃头鹰和鹅)接种疫苗。此外，本发明的所述疫苗可以包括病毒，如与缺乏这样突变的病毒混合的混合物中的包括特定突变的嵌合病毒。本发明的疫苗可采用本领域熟知的方法给药，施用的疫苗的适当量可由本领域计数人员容易地确定。确定施用的病毒的适当量可通过考虑以下因素确定，例如待施用所述病毒的受试者的体型和一般健康状况。例如，本发明的病毒可以配制成0.1至1.0ml剂量体积中含有102和108之间，例如103至107感染单位(例如噬斑形成单位或组织培养感染剂量)的无菌水溶液，以例如肌肉内、皮下或皮内途径给药。另外，由于黄病毒可能通过粘膜途径，例如口腔途径感染人宿主(Gresikovaetal.，“Tick-borneEncephalitis，”InTheArboviruses，EcologyandEpidemiology，Monath(ed.)，CRCPress，BocaRaton，Florida，1988，VolumeIV，177-203)，所以本发明的基于黄病毒的疫苗还可通过粘膜途径给药。此外，正如本领域技术人员确定合适的，本发明的疫苗可以单剂量给药，或可选地给药可包括使用首剂量，然后例如2-6个月后给予加强剂量。实施例在配制和冻干两种疫苗ChimeriVaxTM-WN(包括黄热病病毒衣壳和非结构蛋白以及西尼罗病毒前膜/膜和包膜蛋白的嵌合黄病毒)和ChimeriVaxTM-JE(包括黄热病病毒衣壳和非结构蛋白以及日本脑炎病毒前膜/膜和包膜蛋白的嵌合病毒)的开发计划中，进行下文所述的实验，但就其他蛋白/肽和/或含有病毒的治疗产物的配制和加工而言，这些方法也包括在本发明中，如上所讨论。因此，在一个实施例中，本发明的制剂包括10mM组氨酸(氨基酸)、50mM谷氨酸钾(氨基酸)、0.1％HSA(人血清白蛋白，USP)、5％甘露醇以及4％乳糖，pH7.9-8.1。在本发明方法的实施例中，冻干如下进行。冻干机搁板预冷至-50℃，一旦所有托盘都放置样品，搁板-50℃保持120分钟。一次干燥步骤过程中，真空设为25mT，步骤包括：温度递变+0.1℃/分钟至搁板温度约-40℃，保持约500分钟；温度递变+0.1℃/分钟至搁板温度约-35℃，保持约500分钟；温度递变约+0.1℃/分钟至搁板温度约-30℃，保持约500分钟；温度递变+0.1℃/分钟至搁板温度约-25℃，保持约800分钟。在二次干燥步骤中，真空设为25mT，温度递变+0.1℃/分钟至搁板温度+20℃，保持约800分钟。如有必要，产物可在20℃、25mT，再保持最多24小时，然后加塞。在加塞步骤中，用0.22μm过滤的干燥氮气室内脱气，真空设为800mbar(略有真空)，将塞子挤到小瓶中。以下提供部分此实施例的基础，以及包括在本发明中的其他制剂和方法。实施例1-用甘露醇/乳糖制剂(WNPD-045)进行西尼罗冻干研究在此实施例中描述的实验中，研究了以5％甘露醇、4％乳糖和10mM组氨酸为基础的西尼罗制剂。完整的制剂以及相关玻璃体转化温度见表2。表2：WNPD-045制剂和玻璃转化温度病毒是将WNPD-001澄清原液(ClarifiedBulk)以1∶100稀释在配制缓冲液中制备的。配制在BSC中进行。冻干在下列条件下进行：0.5℃/分钟温度递变至搁板温度为-55℃，保持120分钟；当产物温度达到-50℃时，保持15分钟；室内设为150mT，前级管道(foreline)设为100mT时干燥；50mT下0.2℃/分钟温度递变至搁板温度为-20℃，保持1034分钟；50mT下，0.53℃/分钟温度递变至搁板温度为20℃，保持大约862分钟。此冻干周期在约38小时内完成。对冻干材料进行加速稳定性研究。一些冻干瓶37℃培养。第7日和14日时，取出小瓶，标记，置于-80℃储存。37℃下7天后，所有有谷氨酸钾的制剂已有明显的饼收缩。无谷氨酸钾的制剂没有此收缩。实验WNPD-049和WNPD-051为确定这些制剂中病毒稳定性的PFU分析。所有样品用WFI复溶。结果冻干后所有制剂看起来非常相似。饼是完整的，没有出现明显体积损失。一些饼已从小瓶壁分离，但在制剂中似乎是随机的。表3显示了冷冻得率，以及与制剂中使用的澄清原液(ClarifiedBulk)物质比较的经冻干的得率。表4显示37℃加速稳定性研究的结果。表3：WNPD-045冻干和冷冻得率表4：37℃下WNPD-045稳定性结论有HSA的制剂表现非常好，有迄今为止一些最好的结果。-80℃保存没有明显损失。这些制剂也显示非常好的冻干得率，平均得率为73％。应当指出的是，这些样品的饼的外观比起迄今为止任何其他制剂更一致得多。HSA制剂的稳定性非常令人鼓舞。这两种制剂37℃下14天后显示＜0.5的对数损失。看起来有谷氨酸钾对制剂是有利的。有重组人明胶rHG-272的制剂得到的结果不及有HSA的那些好，但如果增加0.1％浓度，则结果可能改善。这些制剂当-80℃下冷冻时，显示低得率。此支持数据见WNPD-033(见下文)，当在rHG-272制剂中冷冻后回收率低。37℃下14天后，稳定性研究中有重组明胶的制剂还显示损失(＞1log)。实施例II-ChimeriVaxTM-WN和ChimeriVaxTM-JE产物冻干疫苗的开发此实施例描述了适合ChimeriVaxTM-WN和ChimeriVaxTM-JE疫苗的制剂的开发和表征，以及这些疫苗冻干周期的开发和最优化。实验步骤和结果步骤配制为配制大量样品(bulk)用于冻干实验，将浓的ChimeriVaxTM-WN或ChimeriVaxTM-JE1∶100稀释于配制缓冲液中。配制缓冲液组合物根据实验计划进行变动。冻干前得到配制的大量样品(bulk)，-80℃储存作为“冻干前样品”。冻干对于直至WNPD-070和直至JEPD-144的实验，使用FTSDuraStopMP系统冻干。以JEPD-145开始，使用动力学LyoStarII系统。冻干参数根据实验计划进行变动。所有实验都使用3mL小瓶。通常使用0.5mL填充体积，但是实验使用0.3mL填充体积，适当时会指出。ChimeriVaxTM-WN噬斑分析噬斑分析用于评估冻干过程的小瓶回收率和稳定性研究。冻干的ChimeriVaxTM-WN样品用注射用水(WFI)或0.9％注射用氯化钠复溶。复溶的样品用WNPFU培养基稀释。稀释液置于O-Vero板，每孔100μl，接种每孔2x105细胞。板37℃和5％CO2下孵育1小时，然后覆盖甲基纤维素膜。板于37℃、5％CO2孵育96±12小时，然后用1％结晶紫的70％甲醇溶液染色。冲洗染色的板，然后计数。可接受的稀释每孔有10-120噬斑，每次稀释计数的所有孔的相对标准偏差＜40％。ChimeriVaxTM-JE噬斑分析噬斑分析用于评估冻干过程的病毒回收率和稳定性研究。冻干的ChimeriVaxTM-JE样品用注射用水(WFI)或0.9％氯化钠注射液复溶。复溶的样品用JEPFU培养基稀释。稀释液置于O-Vero板上，每孔100μl，接种3x105个细胞每孔。板37℃、5％CO2孵育1小时，然后用甲基纤维素膜覆盖。板37℃、5％CO2孵育96±12小时，然后用1％结晶紫的70％甲醇溶液染色。冲洗染色的板，然后计数。可接受的稀释为10-120个斑块每孔，每次稀释计数的所有孔的相对标准偏差＜40％。稳定性研究进行了一些温度的稳定性研究。加速稳定性研究在37℃培养箱中进行。样品还保持在室温(15-30℃)、25℃、2-8℃和-20℃。零时间样品-80℃储存。在一些例子中，于特定天数在提高的温度下取样，储存在-80℃，日后分析。残留水分分析样品直接注射到卡尔费休库仑法水分测定仪中进行残留水分分析。该测试由Canton，MA的Acambis质量控制小组(QualityControlgroup)按照US02-FRM-158-02完成。差示扫描量热差示扫描量热用TAInstrumentsQ1000进行。液体样品冷却到-70℃，然后温度递变至20℃。当需要更高的分辨率时，使用调制方法。这些方法为制剂缓冲剂候选物产生玻璃化转变温度。固体样品从0℃温度递变至120℃。此方法用于评价冻干物质的玻璃转化温度，并确定储存条件。结果制剂开发概述基于下列标准评价制剂：●Tg’-冷冻材料的玻璃转化温度●冻干的饼的外观●冻干回收率●冻干的物质37℃稳定性●冻干的物质的残留水分●Tg-冻干物质的玻璃转化温度在早期制剂实验中评估了大量赋形剂。初筛的成分包括：山梨醇、甘露醇、蔗糖、葡聚糖、乳糖、甘氨酸、羟乙基淀粉、喷他淀粉、PEG3350、PVP40K、氯化钠、氯化钾、Tween-80、组氨酸、丙氨酸、HEPES、TRIS、谷氨酸钾、三聚磷酸盐和磷酸钾。一些无法得到可接受的饼的制剂冻干后，病毒回收率非常低(低于30％)。随着HSA加入制剂中作为稳定剂，病毒回收率开始改善。HSA试验在实验WNPD-021中，HSA首次用作稳定剂。不同浓度的HSA加到两种基础制剂中。两种制剂为：●1％羟乙基淀粉、1％蔗糖、0.1％山梨醇和50mM谷氨酸钾●4％乳糖、2％山梨醇、10mM组氨酸、10mM丙氨酸和50mM谷氨酸钾，加入浓度为0％、0.2％、1％和2％的HSA。噬斑分析显示通过用WFI复溶的下列得率。表5：WNPD-021冻干得率制剂得率WNPD-021羟乙基淀粉，0.2％HSA40.10％WNPD-021羟乙基淀粉，2％HSA28.06％WNPD-021乳糖/山梨醇，0.2％HSA41.33％WNPD-021乳糖/山梨醇，2％HSA39.80％实验JEPD-018进一步探讨了HSA作为冻干制剂的稳定剂的作用。本实验使用了4％乳糖、2％山梨醇、10mM组氨酸、10mM丙氨酸、50mM谷氨酸钾制剂，并检查0％、0.05％、0.1％、1％和2％的HSA浓度。冻干后，在加速稳定性研究中样品存放在37℃下。表6表明HSA的存在大大提高了冻干后的病毒得率。37℃储存5、12和19天后测定效价的样品显示明显良好的回收率(图1)。HSA浓度超过0.1％，似乎没有任何明显改善，因此决定着重于使用0.1％HSA的制剂。表6：JEPD-018冻干收率和37℃加速稳定性数据也评估重组稳定剂，以探讨是否有可能去除HSA。实验JEPD-080检测DeltaBiologics的重组HSA和Fibrogen的重组人明胶(2株-野生型和基因工程的)的用途。重组人明胶重(rHG)产品的使用浓度为0.5％和1％。所有稳定剂用于5％甘露醇、4％乳糖、10mM组氨酸和50mM谷氨酸钾的基础制剂。重组HSA的表现比得上非重组的，但是明胶产品一般冻干回收率不好，37℃研究中稳定性不好。表7：JEDP-080冻干收率和37℃加速稳定性数据筛选缓冲组分组氨酸被选为缓冲组分，因为其pK值接近ChimeriVaxTM产品的最适pH值范围。我们的目标pH值范围是7.9-8.1，组氨酸pK3’为8.97。实验WNPD-033测试5％蔗糖、0.1％HSA和50mM谷氨酸钾，有或没有10mM组氨酸的制剂。将这些制剂冻干，进行37℃加速稳定性研究。所述两种冻干的制剂经复溶得率非常相似(有组氨酸为74％，没有组氨酸为87％)，并显示37℃下类似稳定性分布(图2)。尽管有没有组氨酸分布都相似，但因其在目标pH值范围内的缓冲容量，所以选作制剂组分。实验WNPD-045检测有或没有50mM谷氨酸钾的5％甘露醇、4％乳糖、0.1％HSA和10mM组氨酸的制剂。将这两种制剂冻干，然后37℃孵育28天。37℃孵育过程中间隔7天取样，得到如图3所示的稳定性分布。冻干后这两种制剂有相当的得率(80％以上)。有50mM谷氨酸钾的制剂37℃下比没有谷氨酸钾的稳定性好。28天后，有谷氨酸钾的制剂效价损失的对数为0.26。没有谷氨酸钾的损失的对数为0.56。根据这些数据，确定制剂中包括50mM谷氨酸钾。选择填充剂在WNPD-021中，乳糖首次作为制剂组分进行研究。此实验得到令人鼓舞的冻干得率，如表5所示。在JEPD-018中进一步研究乳糖，在加速稳定性试验中显示非常有希望的结果(表6和图1)。实验WNPD-029阐述了这些令人鼓舞的结果。此实验采用4％乳糖、2％山梨醇、10mM组氨酸、10mM丙氨酸和50mM谷氨酸钾的基础制剂。以下数据巩固了使用HSA作为稳定组分的益处。表8：WNPD-029冻干得率和37℃加速稳定性数据在实验JEPD-145中，乳糖浓度有变动。浓度2％的乳糖、3％乳糖和4％乳糖都与5％甘露醇、0.1％HSA、10mM组氨酸和50mM谷氨酸钾一起冻干。此实验表明，3％和4％乳糖表现相似，但在加速稳定性研究中2％乳糖表现不够好(图4)。由于使用3％的乳糖没有可觉察的优势，因此使用4％的乳糖浓度继续研究。实验WNPD-036比较下列三种制剂：●4％乳糖、2％山梨醇、10mM组氨酸、0mM丙氨酸、50mM谷氨酸钾、0.1％HSA●4％乳糖、3％山梨醇、10mM组氨酸、50mM谷氨酸钾、0.1％HSA●4％乳糖、3％甘露醇、10mM组氨酸、O.1％HAS表9：WNPD-036冻干收率和37℃加速稳定性数据该乳糖/甘露醇制剂表现良好。冻干后回收率很好，37℃两星期后效价损失的对数仅有0.15。此制剂被选作进一步研究的候选。人们希望，甘露醇的结晶性能可用于加快冻干周期。单一的糖制剂其他实验研究分别利用这些填充剂。WNPD-030检查仅含甘露醇或蔗糖的制剂。在WNPD-047中检测乳糖。将这些制剂与WNPD-045的含有5％甘露醇和4％乳糖的两种糖组合的制剂比较。WNPD-045制剂(5％甘露醇、4％乳糖、0.1％人血清白蛋白、10mM组氨酸，50mM谷氨酸钾)的稳定性远远超过了任何单一的糖制剂。所有单一的糖制剂显示37℃14天后病毒效价损失的对数超过0.9。同一时期甘露醇/乳糖制剂损失的对数只有0.46。这在图5中有说明。退火在两次冻干实验JEPD-166和JEPD-172中尝试退火。在这些实验中，瓶子-50℃冷冻，然后温度递变0.8℃/分钟至-15℃，保持180分钟退火。下一步降温0.8℃//分钟至-50℃，再保持120分钟，然后开始一次干燥。这两个实验得到很好的饼。退火使甘露醇结晶，饼的外观是典型晶型甘露醇饼。但是与所有无退火生成饼的实验相比，退火的物质表现出的稳定性差。退火的样品37℃储存两周后损失的对数近1.0，而非退火样品通常同一时期损失的对数范围为0.3-0.5(图6)。这些数据加上来自单一糖体系的数据，得出这样的结论：结晶甘露醇不利于ChimeriVaxTM产品的稳定。差示扫描量热法确认结晶退火基本上使所有甘露醇结晶。图7显示了4％乳糖溶液的热分析图，其玻璃转化温度为-32.6℃。图8显示当往制剂中加入5％甘露醇时，玻璃转化温度降低约6℃至-38℃。然而，退火使甘露醇结晶，并使玻璃转化温度恢复到仅乳糖的热分析图中所见的范围。玻璃转化温度降低的消失证实甘露醇已完全结晶。可从这些数据得出另一结论。冻干时乳糖始终保持无定形状态。制剂本身中的甘露醇将作为结晶物质冻干，但是当与其它糖类合并时，甘露醇可以是结晶或无定形的。之前的实验已表明下列情况中稳定性不好：●仅乳糖(4％)-其中乳糖为无定形●仅甘露醇(5％)-其中甘露醇为晶型●乳糖(4％)和甘露醇(5％)退火-其中甘露醇为晶型，乳糖为无定形良好的稳定性仅体现在包括这两种组分的制剂之一。当乳糖(4％)和甘露醇(5％)无退火步骤冻干时，乳糖和甘露醇都保持无定形状态。因此无论是无定形的甘露醇或无定形的甘露醇/乳糖组合都赋予冻干的ChimeriVaxTM优越的稳定性。仅无定形乳糖已证明无效，正如任何类型的晶态甘露醇一样。最终制剂的支持数据正如上文所述，5％甘露醇、4％乳糖、0.1％HSA、10mM组氨酸和50mM谷氨酸钾(pH7.9-8.1)被选做ChimeriVaxTM疫苗的制剂缓冲剂。进行了一系列试验鉴定制剂，并建立和优化冻干周期。液体稳定性可检测WNPD-052、JEPD-072和JEPD-087的数据，以表明此制剂在实时-80℃储存实验中有极好的稳定性。由于储存所致的无统计学意义的显著效价损失可以在这些实验中观察到(图9)。冻干前-80℃存储时，此制剂使ChimeriVaxTM产物足够稳定。差示扫描量热法差示扫描量热法(DSC)用于确定此制剂的玻璃转变温度(Tg′)。图10显示了WNPD-045样品的热分析图。这使用调制DSC分析，以改善分辨率。图11是未使用调制扫描即显示足够分辨率的JEPD-172样品。这两个样本显示低玻璃化转变温度(由中点)，范围是-38--40℃。水分分析37℃2周后，当将残留水分的量与疫苗稳定性相比时，可以看到趋势。图12显示从实验JEPD-072、JEPD-087、JEPD-145、JEPD-147和JEPD-151收集的数据，并显示与残留水分的百分比相比效价的损失。冻干参数表10中显示的实验详述了最终制剂冻干中使用的参数。还提供冻干后病毒得率、冻干饼的水分百分比、冻干饼的外观，37℃1周和2周加速稳定性试验，以及37℃孵育最高时间点。表10：最终制剂实验的冻干参数*表示从稳定性曲线外推出的数量根据这些数据，有必要确立可移交给合同制造商的冻干周期。JEPD-151冻干后有最高得率、37℃下2周后最好的稳定性、最低的水分残留，并产生一些美学角度最好的饼(图13)。此实验的冻干周期作为提供给合同制造商的技术规范的模型。技术规范这些技术规范是根据JEPD-151，但延长保持时间以弥补不同冻干机的可能的规模问题。这些规范被移交给WalterReedArmyInstituteofResearch，以满足ChimeriVaxTM-WN和ChimeriVaxTM-JEPhaseI/II材料的合同。冷冻周期●冻干机搁板预冷至-50℃●一旦所有托盘都放置样品，搁板保持-50℃120分钟。一次干燥●真空设为25mT●温度递变+0.1℃/分钟至搁板温度-40℃，保持500分钟●温度递变+0.1℃/分钟至搁板温度-35℃，保持500分钟●温度递变+0.1℃/分钟至搁板温度-30℃，保持500分钟●温度递变+0.1℃/分钟至搁板温度-25℃，保持800分钟二次干燥●真空保持在25mT●温度递变+0.1℃/分钟至搁板温度+20℃，保持800分钟●如果需要，产品可于+20℃、25mT另外保持最高24小时，然后加塞加塞●用0.22μm过滤的干燥氮气对室内脱气●真空设为800mbar(稍有真空)●将塞子塞入小瓶材料和设备材料●WNPFU培养基-含10％FBS(Hyclone，Catalog#SH30070.03)和1x青霉素/链霉素(Sigma，P4333)的M199培养基(Gibco，Catalog#12340-030)●JEPFU培养基-含10％FBS(Hyclone，Catalog#SH30070.03)和1x青霉素/链霉素(Sigma，P4333)，1xL-谷氨酰胺(2mM)(Gibco，Catalog#25030-018)和20mMHEPES的EMEM培养基●甲基纤维素覆盖膜-含5％或10％FBS(Hyclone，Catalog#SH30070.03)、1xL-谷氨酰胺(Gibco，Catalog#25030-018)，1x抗生素/杀真菌药(Gibco，Catalog#15240-062)的甲基纤维素(按照SOP#502-066制备)设备●FTSDurastopMP冻干机●KineticsLyostarII冻干机●Orion卡尔费休库仑法水分测定仪modelAF7LC●TAInstrumentsDSCQ1000(ID#8769)●HeraeusHeracell240培养箱(ID#9055)●VWR低温培养箱Model2005(ID#s8618和8617)●VWR冰箱(ID#8663)●FischerScientificIsotemp(ID#9059)●RevcoUltimaII(ID#9061)结论/讨论此实施例中出现的数据描述旨在ChimeriVaxTM产品的冻干的制剂的选择和开发。该制剂已彻底鉴定，并表现出足够的液体形式的稳定性，以及冻干后出色的回收率和稳定性。冻干前，所配制的疫苗可以液体形式-80℃保存，对效价无任何重大影响。此实施例也进行了3mL小瓶，0.5mL填充量的冻干周期的研发和最优化。此周期应生成有可接受外观、高病毒回收率(＞70％)、低水分残留(＜2％)的饼。提高的温度下冻干产品表现出出色稳定性，并且在≤-10℃的储存条件下储存时没有明显效价损失。以上提及的所有出版物的内容在此引作参考。其他实施方案在以下权利要求的范围内。当前第1页1 2 3