一种pH响应性肽基水凝胶及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种pH响应性肽基水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术：

水凝胶是由亲水性三维网状结构与大量水构成的独特分散体系，能够在水中溶胀而不溶解。它是一类非常重要的生物材料，在组织工程、药物运输、细胞粘附和生物传感器等医药领域具有广泛应用。智能水凝胶是一类能对外界刺激(例如温度、酸度、溶剂、盐浓度与光等)作出响应的水凝胶。人体内的不同部位包括病灶部位有着不同的酸度环境，pH已成为一种重要的生理刺激因素。pH响应性的智能水凝胶药物缓释体系可增加药物(如蛋白分子、化疗药物和抗生素等)的生物利用度，并减少毒副作用。

肽是由一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合形成的两性化合物，涉及生物体内多种功能活性物质。因具有独特的生物活性及其结构和功能上的多样性和可调性，基于肽分子的水凝胶体系日益受到关注。肽分子具有合成快速简洁、易于分子组装及良好的生物相容性等优点，已成为重要的自组装构筑单元，为生物材料的研发和制备提供了新的分子基础。基于肽分子的智能水凝胶更是展现出广泛的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有pH响应的肽基水凝胶及其制备方法与应用，本发明的肽基水凝胶对酸、碱缓冲溶液均具有响应性；其制备方法简单、易操作。

本发明所提供的具有pH响应的肽基水凝胶，由生物肽、蛋白质与交联剂反应制备得到。

所述生物肽为苯丙氨酸的二聚体，即二苯丙氨酸。

所述蛋白质可为血红蛋白、牛血清蛋白、人血清蛋白、胃蛋白酶、胰蛋白酶、过氧化氢酶中的一种。

所述交联剂可为脂肪族二醛或含有二醛结构的聚合物。

所述脂肪族二醛具体可为戊二醛或丁二醛；所述含有二醛结构的聚合物具体可为氧化海藻酸钠或氧化肝素。

生物肽、蛋白质与交联剂的质量比为1：2-50：1-10，具体可为1:4:2.65。

本发明所提供的具有pH响应的肽基水凝胶可缓释蛋白质分子。

本发明所提供的具有pH响应的肽基水凝胶的pH刺激条件为酸性条件下pH4.0-6.0，具体可为4.9；碱性条件下pH7.4-8.5，具体可为8.1。

本发明还提供了上述肽基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：将生物肽溶液与交联剂溶液及蛋白质溶液混合，静置后即得到所述具有pH响应的肽基水凝胶。

上述制备方法中，溶解所述生物肽的溶剂可为六氟异丙醇和/或二甲基亚砜；

所述生物肽溶液的浓度可为100mg/mL～250mg/mL，具体可为200mg/mL；

溶解所述蛋白质的溶剂可为水和/或磷酸缓冲溶液；

所述蛋白质溶液的浓度可为4mg/mL～70mg/mL，具体可为4mg/mL、16mg/mL、30mg/mL、60mg/mL；

溶解所述交联剂的溶剂可选自水、乙醇和甲醇中的至少一种；

所述交联剂溶液的质量百分浓度可为0～25％，且不包括零，具体可为0.4％～0.12％、0.13％～0.30％、0.31％～0.50％；

所述静置的时间可为12～48h，具体可为12～20h、22～30h或32～48h。

所述静置的温度可为0℃～40℃，具体可为4℃～10℃，15℃～26℃，28℃～40℃。

本发明还提供了上述具有pH响应的肽基水凝胶作为药物释放载体材料的应用以及上述具有pH响应的肽基水凝胶在制备具有生物相容性的药物载体材料中的应用。

本发明的具有pH响应的肽基水凝胶中，蛋白质白既作为成胶因子，又作为具有生物活性的基元可以部分释放出来(例如血红蛋白，它自身就具有运载氧气的作用)。另外一些抗癌药物也可以通过物理封装或是化学封装的方法包载在其中。

本发明具有以下优点：

(1)本发明提供的制备水凝胶的方法，操作简单。

(2)本发明的具有pH响应的肽基水凝胶在酸性或碱性缓冲溶液中均可响应释放蛋白质分子，且蛋白质分子的生物活性依然存在。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶的扫描电镜图。

图2为实施例1制备的二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶的流变学表征图。

图3为实施例1制备的二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶在pH 8.1、pH 4.9的缓冲溶液中转变为溶胶。

图4为实施例1制备的二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶中血红蛋白分子在pH 8.1、pH4.9的缓冲溶液及超纯水中的累积释放量。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所采用的二苯丙氨酸，即苯丙氨酸的二聚体的英文名为di-L-phenylalanine(Phe-Phe)，购自Sigma公司，货号为P4126；血红蛋白，英文名为Hemoglobin,购自Solarbio公司，货号为H8020；戊二醛，英文名为Glutaraldehyde，购自国药集团化学试剂有限公司，货号为30092438。

实施例1、二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶的制备

1)将1mg生物肽二苯丙氨酸溶于5μL六氟异丙醇中，得到生物肽二苯丙氨酸的六氟异丙醇溶液(又称为溶液a)，浓度为200mg/mL，4℃存放24h以上使其充分溶解；

2)将50μL质量浓度为25％的戊二醛溶液(质量为53mg)通过超纯水稀释到5mL，得到溶液b，质量浓度为0.25％；

3)将4mg血红蛋白溶于250μL超纯水中，得到溶液c；

4)将250μL溶液b(含有戊二醛2.65mg)加入到溶液a中敞口放置10s后，再加入溶液c，混合均匀后静置12-48h即得到可释放血红蛋白分子的水凝胶。

实施例2、实施例1所得二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶的表征

本发明实施例1制备得到的二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶扫描电镜表征：将二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶于冻干机中冷冻干燥24小时，取少量样品通过导电胶固定于样品台，通过溅射仪向其表面喷洒Au颗粒后于HITACHI S-4800扫描电镜显微镜下观察，其加速电压为10kV；结果如图1所示。

由图1可知，本发明所得到的水凝胶呈片状堆积，在每一个片层之上有球状凸起。

实施例3、实施例1中所得二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶的流变学表征

二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶的流变学表征：将水凝胶置于流变仪中，在25℃，扫描频率0.1-100rad s-¹,扭转张力为0.1％的条件下进行测试；结果如图2所示。

由图2可知，本发明得到的水凝胶储能模量是损耗模量的4倍以上，证明其凝胶网络构建完善。

实施例4、实施例1所得二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶的在酸碱缓冲溶液中的响应性

1)将pH＝4.9的磷酸盐缓冲溶液250μL加入到二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶中，静置3h；

2)将pH＝8.1的磷酸盐缓冲溶液250μL加入到二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶中，静置3h；

3)将超纯水250μL加入到二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶中，静置3h；结果如图3所示；

由图3可知，在pH＝4.9的磷酸盐缓冲溶液和pH＝8.1的磷酸盐缓冲溶液中，二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶会转变为溶胶状态，而在超纯水中无变化。

实施例5、水凝胶中蛋白分子响应性释放

1)对本发明实施例1所得的二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶蛋白分子的释放测试。

具体步骤如下：

将缓冲溶液250μL加入到二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶中，置于振荡器上缓慢震荡，在规定的时间点取出100μL上清液，同时加入100μL磷酸缓冲溶液，直至48h，对各时间点取出的上清液进行稀释，释放出的蛋白分子的量用UV-Vis光谱测定并结合蛋白分子的标准曲线来确定。

蛋白分子的释放分别于pH＝4.9、pH＝8.1的缓冲溶液和超纯水中进行，其中在超纯水中的过程作为对照组。将250μL磷酸缓冲溶液或超纯水加入到二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶中，置于振荡器上缓慢震荡，在规定的时间点取出100μL上清液，同时加入100μL磷酸缓冲溶液或超纯水，直至48h。

所得结果如图4所示。

由图4可知，二苯丙氨酸-血红蛋白水凝胶可在酸性或碱性的条件下释放蛋白分子，而在近中性条件中无蛋白分子释放。