白桦酸及其衍生物在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用的制作方法

本发明属于兽医药物领域，具体涉及白桦酸及其衍生物在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，prrs)是一种在世界范围内严重危害养猪业的传染性疾病，俗称“猪蓝耳病”，其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，prrsv)。发病猪的主要症状为：各年龄段猪特别是仔猪表现为严重的呼吸性障碍(间质性肺炎)；妊娠期母猪表现为严重的繁殖障碍(生产过程中多发流产、生产出仔猪为木乃伊胎、死胎及弱胎)等。prrs于1987年在美国首次被报道，随后在全球其他国家迅速传播。我国在1996年由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所首次从国内疑似prrs病例中分离到美洲型prrsv(ch-1a)株。2006-2007年席卷我国各地的高致病性prrs，给养猪业带来巨大的损失。世界动物卫生组织将prrs列为b类疾病，《中华人民共和国动物防疫法》将经典的prrs列为二类动物疫病、高致病性prrs列为一类动物疫病。

目前尚无针对prrs的特效药物，预防该病除了加强管理(如严格检疫，自繁自养，严格的卫生消毒措施)之外，疫苗免疫是预防该病的主要措施，通常以常规的灭活苗和弱毒苗对猪群进行免疫。但prrsv易发生变异、多毒株同时感染等情况，使得疫苗免疫并不能完全控制prrsv的传播。目前临床上也没有被批准应用的prrs防止药物。因此，开发有效药物对防治prrs至关重要。

我国的中医药应用历史悠久，丰富的中药及天然药物资源成为发现防治prrs药物的宝库。中国发明专利cn201610046350.0公开了“一种抗猪蓝耳病的中药复方、提取方法、浓度和效果测定”，该发明以青蒿、穿心莲、板蓝根和赤芍为药物原料制备了抗prrsv药物；中国发明专利cn200810127067.6公开了“连翘酯苷诱生ifn-α抗pcv2和prrsv的研究方法”，该发明利用连翘酯苷可诱生ifn-α表达发挥抗prrsv病毒作用；中国发明专利cn200610156354.0公开了“金丝桃素在防治猪的pc和prrs中的应用”，利用金丝桃素防治prrs。中国发明专利cn102531868a公开了一种软珊瑚内生真菌alternariasp.(zj-2008003)产生的蒽醌衍生物代谢物对prrsv具有显著抑制作用。这些工作都是利用中药及天然产物中的活性成分防治prrs的有益探索和尝试。

白桦酸(betulinicacid)及其衍生物23-羟基白桦酸(23-hydroxybetulinicacid)、路路通酸(betulonicacid)属于五环三萜类化合物，广泛存在于自然界中。白桦酸，又称桦木酮酸或白桦脂酮酸，分子式为c30h48o3，分子量为456.71，在白桦树皮及树叶中含量最大；23-羟基白桦酸，分子式为c30h48o4，分子量为472.70，在中药白头翁中含量较高；路路通酸，分子式为c30h46o3，分子量为454.34，在中药路路通中含量较高。它们的化学结构如下：

白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性。中国发明专利cn201410055004.x公开了包括白桦酸和23-羟基白桦酸在内的一类五环三萜类化合物作为肠道病毒ev71抑制剂的医药用途；中国发明专利cn1491651a公开了23-羟基白桦酸对小鼠黑色素瘤、脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、肺癌、肝癌以及爱滋病的预防和治疗有作用；中国发明专利cn03152904.6公开了23-羟基白桦酸可作为脑神经胶质瘤、肠道肿瘤、肺癌、肝癌细胞及hiv病毒的抑制剂。中国发明专利cn102108092a公开了23-羟基白桦酸衍生物的制备方法及其可用于抗肿瘤和作为肿瘤耐药逆转剂的用途。刘婷等报道了(中国实验方剂学杂志，2006年12月)路路通酸能明显对抗角叉菜胶引起的小鼠足肿胀，明显对抗醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进并降低小鼠的扭体次数，显示显著的抗炎镇痛活性。

有关白桦酸及其衍生物的抗prrsv作用研究及其在防治猪繁殖与呼吸综合征上的应用未见报道，也未见相关的专利公开。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供白桦酸及其衍生物在制备抗prrsv药物上的应用；本发明的另一目的是提供白桦酸及其衍生物在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用。

为了上述发明目的实现，本发明采用如下技术方案：

首先运用mtt法测定白桦酸及其衍生物对猴胚胎肾上皮细胞(marc-145)的毒性，确定其安全浓度。然后通过建立prrsv感染细胞模型，评价白桦酸及其衍生物对感染prrsv的marc-145细胞的保护效果。评价手段主要为间接免疫荧光试验(ifa)、实时荧光定量pcr试验(real-timepcr)以及蛋白免疫印迹试验(westernblot)等。并通过对病毒复制周期过程的抑制作用研究阐述其抗病毒机制。

本发明通过体外细胞试验发现白桦酸及其衍生物具有显著的抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的作用，其抑制活性随药物浓度的增高而增强。本发明还显示，该系列药物主要通过干扰猪繁殖与呼吸综合征病毒对细胞的吸附从而抑制病毒复制。这些研究结果为其作为有效成分制备防治猪繁殖与呼吸综合征的药物提供了有力支持。

白桦酸及其衍生物在细胞培养中抗prrsv的有效剂量范围为1.25μg/ml～5μg/ml。显然，在大于5μg/ml而低于其毒性浓度的范围都会显示良好的抗病毒活性。

本发明提供了白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸、路路通酸在制备抗prrsv药物上的应用，及其在制备防治prrs药物中的应用。

进一步地，提供了以白桦酸或其衍生物23-羟基白桦酸、路路通酸作为有效成分配以辅助剂制成的药物制剂在防治猪繁殖与呼吸综合征上的应用。

进一步地，所述药物制剂为注射剂、粉剂、颗粒剂等临床上可接受的药物剂型。

本发明用于防治猪繁殖与呼吸综合征具有如下优点：

(1)白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸、路路通酸抑制prrsv的活性强，在浓度低至1.25μg/ml时还具有显著的抗prrsv活性，表明其具有高效的抗prrsv作用。

(2)白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸来源于临床常用的中药，药材原料来源广泛，成本低廉；其抗prrsv病毒的药效成分及作用机制明确，安全可靠，在开发防治猪繁殖与呼吸综合征病毒新药中具有潜在价值。

附图说明

图1是用mtt法测定白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸对marc-145细胞的细胞毒性试验；

图2是用实时荧光定量pcr测定不同浓度的白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸在marc-145细胞中对猪繁殖与障碍呼吸综合征病毒rna增殖的抑制作用；

图3是用间接免疫荧光法分析不同浓度白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸在marc-145细胞中对猪繁殖与呼吸综合征病毒n蛋白合成的抑制作用；

图4是用westernblot分析不同浓度白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸对猪繁殖与呼吸综合征病毒n蛋白在marc-145细胞中合成的抑制作用；

图5是用实时荧光定量pcr测定不同浓度的白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸在marc-145细胞中对猪繁殖与呼吸综合征病毒吸附阶段的抑制作用

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：mtt法测定白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸对marc-145细胞的细胞毒性试验

采用mtt细胞毒性检测法检测不同浓度的白桦酸及其衍生物对marc-145细胞毒性的影响，以确定三种化合物对细胞的安全浓度。

将处于对数生长期的marc-145细胞接种于96孔板(5×104/孔)。将白桦酸及其衍生物用细胞培养液稀释成终浓度为50μg/ml，40μg/ml，30μg/ml，20μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，0μg/ml的7个干预浓度，每孔100μl，同时设置调零组和空白组，每组设定6个平行孔。置于37℃，5％c02的培养箱中避光培养48小时。弃上清，每孔加20μlmtt溶液，细胞培养箱内继续培养4h。终止培养，小心吸取孔内培养液，弃去。每孔入150μl二甲基亚砜(dmso)，摇床低速震荡10min，使甲臜结晶充分溶解，用酶联免疫检测仪在490nm处测量吸光值。

图1结果显示，白桦酸和路路通酸在10μg/ml及其以下浓度对marc-145无细胞毒性作用，23-羟基白桦酸在20μg/ml及其以下浓度对marc-145无细胞毒性作用。

实施例2：实时荧光定量pcr测定不同浓度的白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸在marc-145细胞中对猪繁殖与障碍呼吸综合征病毒rna增殖的抑制作用

待marc-145细胞在12孔细胞培养板生长至单层后，弃去培养基，用pbs(磷酸盐缓冲液)清洗2遍，加入用含有2％胎牛血清和100tcid50的猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的dmem细胞维持液稀释，1ml/孔，37℃孵育2h，弃去含病毒上清，pbs清洗2遍，分别加入5，2.5，1.25μg/ml的白桦酸、23-羟基白桦酸和路路通酸，2ml/孔。试验同时设正常对照组(不加受试药物，不加prrsv)与prrsv对照组(不加受试药物)，每个受试浓度设三个平行。细胞继续37℃培养，至感染后48h终止培养，观察其病变状况。同时含细胞和上清的细胞板于-80℃和4℃反复冻融三次，使细胞充分裂解，致使细胞内的病毒全部释放进入细胞上清，然后收集各孔上清液。用总rna极速抽提试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)推荐的操作方法，将收集到的细胞上清液进行总rna抽提。提取rna后立即进行反转录，以cdna为模板，gapdh为内参基因，realtimepcr检测prrsv的nsp9基因的拷贝数。以正常对照组做参照，评价nsp9mrna的变化情况。

prrsvnsp9基因上下游引物序列：

nsp9-f：5’-ctaagagaggtggcctgtcg-3’

nsp9-r：5’-gagactcggcatacagcaca-3’

gapdh基因上下游引物序列：

gapdh-f：5’-gtcagtggtggacctgacct-3’

gapdh-r：5’-tgctgtagccaaattcgttg-3’

试验结果如图2所示，与病毒感染对照组比较，“*”表示差异显著(p＜0.05)；“**”表示差异极显著(p＜0.01)。结果显示本发明的药物白桦酸及其衍生物在1.25～5μg/ml的浓度范围内，对marc-145细胞内猪繁殖与呼吸综合征病毒的rna增殖有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。

实施例3：免疫荧光法分析不同浓度白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸在marc-145细胞中对猪繁殖与呼吸综合征病毒n蛋白合成的抑制作用

marc-145细胞感染prrsv及加入药物的步骤与实施例2相同。加入不同浓度的白桦酸及其衍生物后细胞培养至48h后终止培养。弃去上清液，pbs洗3遍，每孔加入质量浓度为4％的多聚甲醛50μl固定10min，pbs清洗3次，加入质量浓度为0.25％tritonx-100透膜化，室温下15min；加入质量浓度为5％bsa封闭杂蛋白，室温封闭2h；pbs清洗3次，加入鼠源n单抗(1∶400稀释)，4℃孵育过夜；pbs清洗3次，避光加入二抗(alexa488标记抗小鼠igg，1∶1000)，37℃避光孵育1h，pbs洗净；荧光显微镜下观察，绿色荧光代表prrsv的n蛋白。

试验结果如图3所示，本发明的药物白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸在1.25～5μg/ml的浓度范围内，对猪繁殖与呼吸综合征病毒的n蛋白在marc-145细胞内的合成有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。

实施例4：westernblot分析不同浓度白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸对猪繁殖与呼吸综合征病毒n蛋白在marc-145细胞中合成的抑制作用

marc-145细胞感染prrsv、加入药物的步骤与实施例2中相同，细胞培养至感染后48h终止培养，弃去上清液，用pbs洗2遍。将细胞培养板放置在冰上，加入ripa裂解液120μl/孔，经吹打后将液体吸出至离心管中，12000转/分钟离心10分钟，将上清吸出至另一干净的管中备用。用bca法测定各样品蛋白浓度后，采用westernblot检测prrsv的n蛋白和内参蛋白gapdh的条带。

试验结果如图4所示，本发明的药物白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸在1.25～5μg/ml的浓度范围内，对猪繁殖与呼吸综合征病毒的n蛋白在marc-145细胞内的合成有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。

实施例5：实时荧光定量pcr测定不同浓度的白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸在marc-145细胞中对猪繁殖与呼吸综合征病毒吸附阶段的抑制作用

marc-145细胞在12孔细胞培养板生长至单层后，弃去培养基，用pbs(磷酸盐缓冲液)清洗2遍，加入用含有2％胎牛血清和分别含有1.25，2.5，5μg/ml药物的细胞维持液稀释prrsv至100tcid50，混匀后接种到长满单层marc-145细胞的6孔细胞培养板上，1ml/孔，并设置空白对照组，置入4℃作用2h。弃去病毒液，用pbs洗2遍，换为空白细胞维持液后，转入37℃培养48h。终止培养后，放入-80℃反复冻融3次，按照实施案例3的方法进行real-timepcr试验检测药物处理组、病毒对照组的prrsv-nsp9基因的相对表达量变化。

试验结果如图5所示，本发明的药物白桦酸及其衍生物23-羟基白桦酸和路路通酸在1.25～5μg/ml的浓度范围内，能显著抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在marc-145细胞上的吸附作用，且呈现良好的量效关系。

实施例6：以本发明药物为活性成分制备抗prrsv制剂：油乳剂注射液

油乳剂注射液的配制：3g本发明的药物白桦酸(或23-羟基白桦酸，或路路通酸)溶解于10mldmso中，加40ml橄榄油，充分混匀，加3ml的tween80，再次混匀，缓慢加入47ml纯净水，边加边高速搅拌(6000rpm/min)，搅拌同时体系进行冰浴冷却，搅拌10min，乳液分装至5ml的安瓿瓶中，熔封，灭菌，即制得本发明药物的油乳剂注射液。该注射液药物含量为3％，使用前反复摇匀复乳。