1.一种制备斑马鱼血栓模型的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)挑选发育正常的斑马鱼幼鱼20-45条移入微孔板,微孔板中加入用胚胎培养水配制的一定浓度的肾上腺素溶液,药液加好后加盖封闭,置于培养箱内培养4-30小时后,吸弃培养水,用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液于微孔板中避光染色15min;
或
挑选发育正常的斑马鱼幼鱼20-45条,在其卵黄部位注射一定浓度的肾上腺素溶液,注射完成后移入事先加入胚胎培养水的微孔板中,然后加盖封闭,置于培养箱内培养4-30小时后,吸弃培养水,用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液于微孔板中避光染色15min;
2)移除染色液,用DMSO快速清洗3遍;
3)将斑马鱼转入新的微孔板中,加入DMSO;
4)取斑马鱼置载玻片上,于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存;
5)利用图像处理软件计算斑马鱼躯干部及尾部血管染色面积,记录斑马鱼尾部血管红细胞的染色面积作为血栓发生程度的指标。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,其中所述的斑马鱼幼鱼指的是受精后发育3-14天的幼鱼,所述的斑马鱼指各种实验用品系的斑马鱼。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,其中所述的肾上腺素溶液的浓度在2mmol/L~30mmol/L之间。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述置于培养箱内培养时间为4-30小时。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,斑马鱼胚胎培养用水配方:5mmol/L NaCl,0.17mmol/L KCl,0.4mmol/L CaCl2,0.16mmol/L MgSO4。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,邻联茴香胺染色液配方:含0.6mg/mL邻联茴香胺,0.01moL/L醋酸钠,0.65%,H202,、40%酒精,溶剂为水。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:挑选健康性成熟的斑马鱼,按雌雄1∶2的比例放入交配缸内,次日清晨获得胚胎,用胚胎培养水进行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培养箱,每日更换胚胎培养水两次,在斑马鱼发育至5dpf时,在体视显微镜下挑选发育正常的斑马鱼幼鱼进行实验,挑选发育正常的斑马鱼30条移入6孔板,6孔板中加入用胚胎培养水配制的浓度为4mmol/mL肾上腺素溶液,药液加好后置于28℃培养箱内培养8小时后,吸弃培养水,用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液(含0.6mg/mL邻联茴香胺,0.01moL/L醋酸钠,0.65%,H202,、40%酒精)于微孔板中避光染色15min;移除染色液,用DMSO快速清洗3遍;取斑马鱼置载玻片上,于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存;利用图像处理软件计算斑马鱼躯干部及尾部血管染色面积。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,
血栓增加率和血栓抑制率的计算方法为:
血栓增加率%=模型对照组斑块染色面积*100/空白对照组斑块染色面积;
血栓抑制率%=(模型对照组斑块染色面积-阳性药组斑块染色面积)*100/模型对照组斑块染色面积。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
挑选健康性成熟的斑马鱼,按雌雄1∶2的比例放入交配缸内,次日清晨获得胚胎,用胚胎培养水进行清洗,除去死卵,放入28℃下控光培养箱,每日更换胚胎培养水两次,在斑马鱼发育至5dpf时,在体视显微镜下挑选发育正常的斑马鱼幼鱼进行实验,空白对照组、模型对照组、阳性药组各挑选发育正常的斑马鱼幼鱼30条移入6孔板,6孔板中除空白对照组外均加入用胚胎培养水配制的浓度为4mmol/mL肾上腺素溶液,空白对照组仅加入胚胎培养用水,阳性药组加入Warfarin至终浓度为300μmol/L,药液加好后置于28℃培养箱内培养8小时后,吸弃培养水,用移液枪吸取等体积邻联茴香胺染色液(含0.6mg/mL邻联茴香胺,0.01moL/L醋酸钠,0.65%,H202,、40%酒精)于微孔板中避光染色15min;移除染色液,用DMSO快速清洗3遍;取斑马鱼置载玻片上,于显微镜下对斑马鱼进行拍照并保存;利用图像处理软件计算斑马鱼躯干部及尾部血管染色面积,
血栓增加率和血栓抑制率的计算方法为:
血栓增加率%=模型对照组斑块染色面积*100/空白对照组斑块染色面积;
血栓抑制率%=(模型对照组斑块染色面积-阳性药组斑块染色面积)*100/模型对照组斑块染色面积,
其中,空白对照组溶液的配制:使用去离子水配制含5mmol/L NaCl,0.17mmol/L KCl,0.4mmol/L CaCl2,0.16mmol/L MgSO4,
其中,阳性药组溶液的配制:使用去离子水配制含5mmol/L NaCl,0.17mmol/L KCl,0.4mmol/L CaCl2,0.16mmol/L MgSO4,4mmol/mL肾上腺素,300μmol/L Warfarin。
10.如权利要求1所述的斑马鱼血栓模型的使用方法,包括以下步骤:
斑马鱼躯干部及尾部血管染色面积代表了血栓发生的程度,待评价药物在造模前加入,或者与肾上腺素溶液同时加入,或者在肾上腺素溶液加入后2-4小时内加入均可,通过比较空白对照组,模型对照组以及给药组的染色面积,可以定量的比较药物的抗血栓生成效应。