一种建立心肌致密化不全的动物模型的方法与流程

本发明涉及一种动物实验用动物模型的建立方法，特别涉及一种心肌致密化不全的动物模型建立方法，属于动物实验准备的方法、造模型方法。

背景技术：

关于心肌致密化不全：

心肌致密化不全（non-compactionofventricularmyocardium，nvm），又称为左室肌小梁过多、海绵状或蜂窝状心肌，其病理学特征是心内膜面肌小梁显著突起和与心室腔相连小梁间隙深陷隐窝。nvm可单独存在，也可并存于其他的先天性心脏病。主要累及左心室，又称为左心室致密化不全（leftventricularnon-compaction，lvnc）或者左心室过度小梁形成（leftventricularhypertrabeculation，lvht），也可伴有右心室受累。

nvm的临床表现缺乏特异性，极易被漏诊和误诊，多表现为渐进性心力衰竭、体循环栓塞和心律失常，也可无任何临床症状，病程缓慢迁延或急速恶化最终导致心源性猝死。

心肌致密化是在正常胚胎发育的前4周，胚胎心室壁心肌由大量的肌束相互交织成网，呈海绵状心肌构成，冠状动脉尚未发育完善，心室壁相应区域的心肌由心腔血液通过其小梁间隐窝供血，这种结构可改善胚胎心肌的供氧。

心肌致密化过程和冠状动脉形成是同步化进行的。随着胚胎的不断发育，5-8周心室内膜下心肌开始发生正常的致密化，6周以后，较大的小梁间隐窝逐渐发育成为毛细血管，最终形成冠状动脉微循环系统并于心外膜表面冠状动脉连接。与此同时，心室壁内心肌因此产生心肌重构，多数网间间隙随之变平或消失，疏松的小梁网逐渐转变为致密心肌^[1]。心肌致密化的过程一般从心外膜到心内膜，从右心室到左心室，从基底段到心尖部、从间隔段到侧壁逐渐致密化。

nvm是心室心肌发育不良的特殊类型，按受累部位可分为左室型、右室型、双室型，以左室型多见。病理解剖学特点为：①大体上看，心脏扩大，心室壁增厚，心肌重量增加，病变主要累及左右室壁，以左心室和心尖部为主^[2]；心室壁心肌发育不良，致密化心肌较薄，心室腔内可见非致密心肌肌束明显肥大，异常粗大的肌小梁和交错深陷的心室壁隐窝，表面覆有心内膜与冠状动脉不相通，大体看去类似海绵状组织，通常与其他心脏形态学异常无关^[3-4]；②nvm病理组织学通过心内膜活检或尸检等检查发现有不同程度的心肌或心内膜纤维化、纤维弹性组织变性、心肌纤维粗短、排列紊乱，心肌结构破坏，心肌瘢痕等；③显微镜下可见室壁内层非致密化心肌细胞肥大，细胞核异形，心肌结构破坏，炎症细胞浸润，室壁外层致密化心肌细胞形态及排列基本正常，心肌厚度变薄^[5]。这些形态学异常可单独出现，也可同时出现，或伴有其他心脏形态学异常^[6]。值得注意的是在类似于假腱索的肥大的肌小梁中还发现有心脏蒲肯野氏纤维传导束^[7]，目前还不清楚这些不同的心肌形态学异常是代表不同的疾病还是相同的疾病的不同病理阶段，但这些都不是特定的nvm病理形态表现，只有结合心脏的大体形态表现才有一定的诊断参考价值。

现有nvm发病机制多认为由于遗传或基因突变等因素，在胚胎发育期上述心肌致密化过程停顿、心肌间窦状隙未闭合和网状纤维致密化失败，最终导致正常心肌致密化过程停滞在某一阶段，从而出现心室壁内出现较多异常粗大突起的肌小梁和与心室腔交通的深陷交错的海绵状小梁间隐窝等病理改变。

由于左心室心肌的致密化过程晚于右心室，故受累部位多发生于左心室，且主要累及心尖部^[8-10]。hamamichi^[11]等也研究发现：心肌致密化不全主要发生在左心室的心尖、前壁、下壁和侧壁，单独的右心室心肌致密化不全非常少见。随着病程的进展，nvm虽有心肌供血，但心肌供血与众多肌小梁的需求不匹配以及肌小梁和心内膜的纤维化现象等因素均可能诱发左室收缩和舒张功能异常。另外心肌结构功能异常、血流紊乱容易导致心律失常和附壁血栓形成，甚至发生猝死。

nvm的病因及发病机制目前尚不明确，一些研究表明nvm可发散或成家族聚集性，并具有遗传异质性，为x染色体隐性遗传或常染色体显性遗传性疾病。也有研究表明nvm是非单一遗传因素的心肌病，常与导致心肌病、骨骼肌疾病和染色体异常的线粒体相关性疾病有关，研究显示nvm与taz、dtna、ldb3基因有关。

xing等^[12]研究发现，在nvm患者中，taz、dtna或ldb3基因突变仅占的17％，提示还有其他基因突变可导致本病发生。还有研究表明nvm与lmna、myh7、ywhae、mib1、prdm16、actc1、tnnt2、fkbp-12、scn5a、肌浆网蛋白编码基因、dmpa及线粒体等基因突变有关，也有学者发现nvm致病基因出现在11p15、1p36、1q43位点。随着对nvm研究的不断深入，不同的基因缺陷逐步被发现，提示着nvm可能是多种致病基因在疾病发生的过程中共同作用，发病机制较为复杂，不能从单一的病理生理机制去解释。

由于nvm是心肌的形态学改变，缺乏特异性临床表现，仅依靠病史、体格检查、心电图表现诊断极易造成漏诊和误诊。因而其诊断主要依据异常心肌结构特征。超声心动图（ultrasoniccardiogram，ucg）和心脏核磁共振（cardiacmagneticresonanceimaging，cmri）在其诊断和鉴别诊断中起决定作用。ucg具有能直接显示该病心肌结构的异常特征，经济简便易行，无辐射，可重复性高等特点，广泛应用于临床，故为nvm确诊的首选方法。

关于维甲酸：

维甲酸（retinoicacid，ra）是维生素a（维甲醇）的代谢中间产物，主要影响骨的生长和上皮代谢。ra是保持胚胎正常发育和维护成人组织正常分化必不可少的重要元素。ra也是正常心肌发育过程中重要的形态发生素。

现有研究概况：

现有技术中关于心肌致密化不全的研究主要是基于临床治疗过程中发现的心肌致密化不全的病人的配合。但是，心肌致密化不全发病率低，检出率在0.05％～0.24％，科研临床研究资源有限。而且，由于病因及发病机制目前尚不明确，没有确切的治疗方案，研究进展十分缓慢。

在无法快速实现对于心肌致密化不全的研究病例缺乏的情况下，医护人员难以推进心肌致密化不全的病症的研究治疗。同时，如上所述诊断依据异常超声心动图和心脏核磁共振等影像学心肌结构特征来查找，本身的准确性，精确度较低，大量其他病症的伴随发生心肌致密化不全。诊断可靠性受到设备先进性及技术人员经验和学识的限制，而确切的侵袭性病理诊断较为少用，另外由于心肌致密化不全临床症状不典型，以对症治疗为主，进一步的限制了医学技术研究心肌致密化不全的疾病的进展速度。

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技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中关于心肌致密化不全的研究缺少相关的研究基础的问题，提供一种建立心肌致密化不全的动物模型的方法。本发明的方法利用维甲酸在小鼠中建立心肌致密化不全的动物模型，使得大量的心肌致密化不全的动物模型能够快速实现，为研究心肌致密化不全的诊断治疗等提供了先决的基础条件。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种建立心肌致密化不全的动物模型的方法，包括以下步骤：筛选孕鼠，称重，按照5-100mg/kg体重给予全反式维甲酸，继续饲养直到幼鼠出生。

本发明的心肌致密化不全的小鼠模型是在动物培养过程中给予全反式维甲酸（ra），诱导胎鼠/幼鼠心肌致密化不全，实现相应的胎鼠/幼鼠心肌致密化不全模型。本发明的方法简单可靠，方便科研人员建立起小鼠胎鼠/幼鼠心肌致密化不全的模型，并进行相关的试验研究。造模型的过程简单高效，同时还可以设置相应的对照组，对比分析没有全反式维甲酸进行造模型的小鼠在同样的用药环境/操作情况下的表现。本发明通过给予维甲酸实现试验组的小鼠诱导产生nvm症状的效果，具有造模型建立nvm成功率高，方便进行其他相关试验研究的特点。

进一步，给予全反式维甲酸的方式是灌胃、腹腔灌注、静脉滴注、动脉注射中的一种或几种。

进一步，孕鼠孕期给予全反式维甲酸的量为10-80mg/kg。优选地，将小鼠进行称重按80、70、60、50、40、30、20、10或5mg/kg体重进行给药。优选腹腔灌注，一致性更好。最优选，全反式维甲酸的用量为10-40mg/kg。

进一步，将维甲酸是溶解于二甲基亚砜溶液中，进行腹腔灌注给药。溶解比例为20-200mg全反式维甲酸的粉末溶于2ml二甲基亚砜溶液中，优选50mg全反式维甲酸溶解于2ml二甲基亚砜溶液。溶解全反式维甲酸的过程可以是将二甲基亚砜加入到ra小棕瓶中进行溶解，优选地采用规格为50mg/瓶的ra原药，在ra小棕瓶中注入2ml的二甲基亚砜进行溶解，溶解得到注射用ra。

通过给予过量的全反式维甲酸使得孕鼠体内的鼠胎在药物全反式维甲酸的干扰下产生心肌致密化不全，实现相应的动物模型造型的目的。

进一步，筛选孕鼠的过程如下：选用3-8个月龄的小鼠进行雌雄合笼，定期/定时检查筛选出孕鼠。优选地，选用4-8月龄的小鼠进行雌雄合笼。

进一步，每日上午进行筛选。雌雄合笼培养以后，性成熟的雌雄小鼠按照雌雄比例1-3:1合笼，更优选雌雄比例2-3:1合笼具有很高的交配成功率，所以在雌雄合笼以后定时进行筛选可以筛选出孕鼠。优选地，通过查看阴道栓或阴道分泌物图片发现精子筛选出孕鼠。更优选，在雌雄合笼的次日上午7时进行筛选，雌雄合笼培养后的次日上午进行筛选，既可以快速筛选出孕鼠，又能够减少雌鼠阴道栓脱落或分泌物排除导致孕鼠漏检。

进一步，在孕鼠孕期的第6-10天给予全反式维甲酸。利用全反式维甲酸构建nvm小鼠模型，记作模型组。优选地，在孕鼠孕期的第8-9天，特别是低8.5天，给予全反式维甲酸。优选地，将全反式维甲酸溶解于溶剂中，进行灌胃、静脉滴注、动脉注射或腹腔灌注。优选方式为腹腔灌注。

进一步，还包括设置空白对照组，孕鼠在相同的孕期，给予相同剂量的溶剂构建空白对照组。溶剂的类型和溶解全反式维甲酸的溶剂相同，用量相同。空白对照组的给药方式与模型组相一致。优选地，根据孕鼠体重给予同等剂量的二甲基亚砜灌胃、静脉滴注、动脉注射或腹腔灌注。二甲基亚砜用量同模型组溶解全反式维甲酸的溶剂用量，建立起空白对照组进行对比分析。

进一步，本发明建立心肌致密化不全的动物模型的方法还包括以下步骤：在幼鼠出生后0-1天，解剖幼鼠获取心脏。构建的小鼠nvm模型过程中，一般幼鼠都在出生后几个小时就死亡了，少数在出生后1天死亡，死亡后立即解剖。超过1天未死亡的，深度麻醉处死或电击处死，解剖获取心脏。由于本发明的构建的小鼠模型是心肌致密化不全的胎鼠/幼鼠，所以幼鼠出生后基本不能成活，在24小时内死亡，死亡后开始解剖即可。

进一步，对幼鼠的心脏进行研究，初生幼鼠死亡后解剖研究心脏。优选地，对孕鼠给予两种或两种以上剂量的全反式维甲酸，对不同剂量的实验下获得的幼鼠心脏进行对比分析。更优选地，将两种不同剂量全反式维甲酸腹腔灌注的幼鼠心脏进行石蜡病理切片，在显微镜下观察确定幼鼠发生典型的心肌致密化不全情况。

对于建立起的nvm动物模型的小鼠胎鼠/幼鼠，在幼鼠出生以后进行解剖获取心脏，能够方便的进行科学的显微镜检，通过切片观察小鼠心脏中心肌致密化不全的情况，配合适当的药物研究，可以分析不同的药物成分对于nvm症状的作用/影响。

进一步，还可以研究药物作用后的分子通路中多种mrna（反转录cdna）及蛋白的变化与临床疾病基因与蛋白的相关性，有望找到致病的相关基因和蛋白，以及相关拮抗或者作用相反的药物来缓解或逆转抑或从根本上治疗nvm。

进一步，试验开始之前，向伦理委员会申请动物实验同意书，本发明的主要目的是造动物模型，在造动物模型的实验过程中涉及到动物伦理，所以需要向伦理委员会申请动物实验同意书，为伦理科学研究的基础先决条件保障。

进一步，本发明心肌致密化不全的动物模型选用的小鼠为c549、balb/c、c3h/he、km、icr、nih、cfw、laca、nude、scid等小鼠。其中优选使用的小鼠为c549，利用c549小鼠建立动物模型，经过试验验证可靠可行，动物模型建立成功率高，解剖小鼠心脏表明建立nvm模型非常具有典型意义。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1.本发明的方法克服现有技术中nvm临床表现缺乏特异性，容易被漏诊和误诊，难以建立可靠的实验基础模型的问题。通过化学试剂诱导建立动物心肌致密化不全的模型，具有可控性，容易实现精确的模型建立，可以快速的提供大量的适合相关研究应用的动物模型。

2.本发明建立动物模型的情况，不再是基于临床表现、心电图、超声心动图或核磁共振特征等表象的研究，而是基于实在的可控的动物模型，具有高度的一致性。

3.本发明建立模型的过程中，ra浓度的控制可以调节，通过实验分析可以选择出适宜的ra浓度使得建立的模型更好的符合医学研究的需求。

4.本发明的建立模型的方法中，应用的ra直接参与到动物孕期胎鼠代谢中，影响其中的蛋白代谢等情况，具有一定的原发性，模型接近自然发病的心肌致密化不全，可以用于寻找治疗的干预拮抗剂、阻断药物等，对于研究缓解或治愈nvm患者的方法具有重要意义。

5.本发明构建的小鼠模型还可以进一步研究药物作用后的分子通路中多种mrna（反转录cdna）及蛋白的变化与临床疾病基因与蛋白的相关性，有望找到致病的相关基因和蛋白，以及相关拮抗或者作用相反的药物来缓解或逆转亦或从根本上治疗nvm。

附图说明：

图1是本发明的建立心肌致密化不全动物模型的流程示意图。

图2是模型组左心室心尖部显微镜1：40的图片。

图3是模型组左心室心尖部显微镜1：100的图片。

图4是对照组左心室心尖部显微镜1：40的图片。

图5是对照组左心室心尖部显微镜1：100的图片。

具体实施方式

本发明的方法在一般的小鼠培养过程中，对孕鼠采取过量的ra诱导，使得实验用胎鼠/幼鼠心肌致密化不全，建立心肌致密化不全的动物模型，弥补了科研中罕见病nvm的资源不足。可以很好的克服nvm临床表现缺乏特异性，极易被漏诊和误诊的不足，能够提供确切的病理诊断研究资料，指导临床治疗工作。

另外，还可以通过研究ra作用后其参与蛋白及相关的信号转导通路改变情况，在用药后的模型胚胎中提取总rna，反转录成相关通路蛋白的cdna，观察其与近几年研究的突变基因及异常蛋白是否有相同或相关性。研究nvm的发病机制，找出相关的干预拮抗剂或与ra作用相反的药物，阻断或者逆转心肌致密化不全的发展，寻找缓解或治愈nvm方法，提供基础先决条件，为nvm的治愈提供新的可能性。

本发明的动物模型建立方法的研究方式，和目前国内外在心肌致密化不全流行病学、影像学(超声心动图心脏核磁共振)、心肌的病理形态学、染色体及基因等方面的研究相比，通过过量的ra诱导胎鼠/幼鼠心肌致密化不全，建立心肌致密化不全的动物模型属于完全创新型研究。可获得大量确切心肌致密化不全的动物模型，具有高效率，高精确度，科学规范的特点，并进行在体及离体的实验研究，从而了解其可能的发病机制，促进心肌致密化不全科学研究及临床诊治的发展。

综上，本发明方法所能够实现以下效益：

（1）减少心肌疾病患者的死亡率。nvm的临床表现缺乏特异性，极易被漏诊和误诊，多表现为渐进性心力衰竭、体循环栓塞和心律失常，也可无任何临床症状，病程缓慢迁延或急速恶化最终导致心源性猝死。通过本发明的研究获得典型的病理学特征，普及医务、科研人员对心肌致密化不全这种疾病病理的认识，加强对此类疾病的临床科研意识，提高医务科研人员的诊断水平，提高诊断的准确率，避免漏诊和误诊，及时的给予相关的临床治疗，延长患者的生存时间，提高患者的生活质量，减少相关患者死亡概率。

（2）提高心脏疾病的研究水平，具有研究明确发病机理的潜力。近年来人们对nvm的认知水平有所提高，但大多局限于临床表现、心电图、超声心动图及心脏核磁共振特征等，对其病因和发病机制以及临床分型缺乏足够认识，在临床诊断和治疗等方面仍然存在诸多争议。本发明具有研究明确发病机理的潜力，对于治疗方案的研究具有指导意义。

（3）明确ra和nvm之间的潜在联系。由于正常的心脏发育需要精确的ra浓度，ra浓度的缺乏/不足或者过量都会导致nvm的发生，这个分子可能涉及建立适当心肌致密化某个或某些重要的信号通路。通过本发明的研究可以定性/定量研究ra和nvm之间的潜在联系，对于诊断、治疗药物、治疗方案等研究具有指导意义。

（4）通过过量的ra诱导胎鼠/幼鼠心肌致密化不全，建立心肌致密化不全的动物模型，可弥补科研中罕见病nvm的资源不足，为科学对照研究分析nvm疾病提供研究资源。

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

建立小鼠心肌致密化不全模型

如图1所示的流程，首先向伦理委员会申请动物实验同意书。取得同意书以后准备实验，选择4个月龄的小鼠（鼠种类型为c549）雌雄2:1进行雌雄合笼。在雌雄合笼的次日上午7时通过查看阴道栓或阴道分泌物图片发现精子筛选出孕鼠。孕鼠单独培养，实验组孕鼠在孕期的第8.5天给予全反式维甲酸（将50mg全反式维甲酸的粉末溶于2ml二甲基亚砜溶液中），将小鼠进行称重按70mg/kg体重进行腹腔灌注，继续观察培养直到幼鼠出生。对照组根据孕鼠体重给予同等剂量的二甲基亚砜作为对照比较。

在幼鼠出生后0-1天，解剖死亡的幼鼠获取心脏。一般实验组小鼠都在出生后几个小时就死亡了，少数在出生后1天死亡，死亡后立即解剖。对幼鼠的心脏进行研究，将幼鼠心脏进行石蜡病理切片，在显微镜下观察确定幼鼠发生典型的心肌致密化不全。对照组的幼鼠出生后1天处死，获取心脏，解剖研究。

本实施例中，实验组选用70mg/kg体重比例腹腔灌注全反式维甲酸，造模成功，小鼠出生若干小时后或出生后1天死亡，30%孕鼠用药后死亡。显微镜检新生幼鼠心脏切面，如图2所示，实验组幼鼠左心室心尖部出现明显的心肌致密化不全，出现了明显nvm症状，表明过量的ra诱导产生了心肌致密化不全动物模型建立成功。放大至100x显微镜下观察，如图3所示，可以看见小鼠的心肌致密化不全十分明显，这可能是小鼠出生后死亡的主要原因。对照组的幼鼠心脏在显微镜下观察，如图4所示，左心室心尖部显微镜40x观察，心肌完全正常，没有出现实验组的nvm症状。放大至100x观察，如图5所示，更加显著的看到幼鼠心尖的充分致密化，反证了本发明采用全反式维甲酸造模型的方法是具有科学性、可行性的。

实施例2

构建nvm小鼠动物模型

本实施例实验过程与实施例1相同，同样选用5个月龄的小鼠（鼠种类型为c549）雌雄3:1进行雌雄合笼。筛选出孕鼠以后，孕鼠单独培养，在孕鼠孕期的第8.5天给予全反式维甲酸。将小鼠进行称重按40mg/kg体重进行腹腔灌注，继续观察培养直到幼鼠出生。在幼鼠出生后0-1天，解剖幼鼠获取心脏。进行研究，选用35mg/kg.体重全反式维甲酸进行腹腔灌注，造模成功，小鼠出生后若干小时后死亡，孕鼠无死亡。

实施例3

构建nvm小鼠动物模型

本实施例实验过程与实施例1相同，同样选用6个月龄的小鼠（鼠种类型为c549）雌雄2:1进行雌雄合笼。筛选出孕鼠以后，孕鼠单独培养，在孕鼠孕期的第9天给予全反式维甲酸。将小鼠进行称重按50mg/kg体重进行灌胃，继续观察培养直到幼鼠出生。在幼鼠出生后0-1天，解剖幼鼠获取心脏。进行研究，选用50mg/kg.体重全反式维甲酸进行腹腔灌注，造模成功，小鼠出生后若干小时后死亡，孕鼠无死亡。在幼鼠出生后0-1天死亡，解剖幼鼠获取心脏，对幼鼠的心脏进行解剖研究，小鼠心肌致密化不全的症状十分明显。

实施例4

构建nvm小鼠动物模型

本实施例实验过程与实施例1相同，同样选用3个月龄的小鼠雌雄各半，进行雌雄合笼。筛选出孕鼠以后，孕鼠单独培养，在孕鼠孕期的第7天给予全反式维甲酸。将小鼠进行称重按20mg/kg体重进行静脉滴注，继续观察培养直到幼鼠出生。在幼鼠出生后0-1天，解剖幼鼠获取心脏。进行研究，选用20mg/kg.体重全反式维甲酸进行腹腔灌注，造模成功，小鼠出生后若干小时后死亡，孕鼠无死亡。

实施例5

构建nvm小鼠动物模型

选用5个月龄的小鼠（鼠种类型为c549）按照2:1进行雌雄合笼，次日上午7时通过查看阴道栓或阴道分泌物图片发现精子筛选出孕鼠，孕鼠单独饲养。在孕鼠孕期的第8.5天给予全反式维甲酸（将50mg全反式维甲酸的粉末溶于2ml二甲基亚砜溶液中），将小鼠进行称重按70mg/kg、40mg/kg体重进行腹腔灌注，继续观察培养直到幼鼠出生。在幼鼠出生后0-1天（备注：一般小鼠都在出生后几个小时就死亡了，少数在出生后1天死亡，死亡后立即解剖），解剖幼鼠获取心脏，对幼鼠的心脏进行研究。将两种不同剂量全反式维甲酸腹腔灌注的幼鼠心脏进行石蜡病理切片，在显微镜下观察确定幼鼠发生典型的心肌致密化不全。