SCS用于制备巨噬细胞M2极化诱导剂的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及仿生纤维内硅化胶原支架用于制备巨噬细胞m2极化诱导剂的应用。

背景技术：

仿生纤维内硅化胶原支架(scs)，以胶原纤维内部无定形水合二氧化硅有序沉积为特征，是一种具有良好理化性能和机械性能的生物材料。我们的前期研究显示，scs在体外、体内均表现出了良好的促进骨缺损修复的能力，scs在植入体内早期，可作用于宿主单核细胞使其表型转化为trap阳性分泌型细胞，并促进其分泌vegf、tgf-β、sdf-1及pdgf-bb等活性因子，促进骨缺损区域早期血管化，从而为内源性骨再生提供营养及氧气等环境优势。

技术实现要素：

本发明提供了仿生纤维内硅化胶原支架浸提液用于制备巨噬细胞m2极化诱导剂的应用和仿生纤维内硅化胶原支架用于制备巨噬细胞m2极化诱导剂的应用。

发明人前期研究已证实仿生纤维内硅化胶原支架具备低免疫原性，高效促成骨、成血管活性，值得注意的是，发明人进一步研究显示仿生纤维内硅化胶原支架在体内及体外环境中均可显著促进巨噬细胞的m2型极化，从而能够有效调节宿主免疫反应向着促进组织修复及愈合的良性方向发展，最终促进材料与机体的有机整合及骨缺损的修复。

附图说明

图1为流式细胞计数检测scs浸提液对巨噬细胞m1/m2极化的影响(数据图中不同字母表示组间存在统计学差异p<0.05；相同字母表示组间无统计学差异p>0.05)；

图2为流式细胞计数检测scs浸提液对巨噬细胞胞内诱导性一氧化碳合酶蛋白表达的影响(数据图中不同字母表示组间存在统计学差异p<0.05；相同字母表示组间无统计学差异p>0.05)；

图3为实时定量pcr检测scs浸提液对巨噬细胞胞内炎症因子、抗炎因子及生长因子基因表达的影响(数据图中不同字母表示组间存在统计学差异p<0.05；相同字母表示组间无统计学差异p>0.05)；

图4中a图为mtt实验检测scs浸提液对巨噬细胞增殖活动的影响；b图为流式细胞计数检测scs浸提液对巨噬细胞凋亡活动的影响；

图5为实时定量pcr检测经scs刺激的巨噬细胞对骨髓间充质干细胞成骨相关基因表达的影响(图中不同字母表示组间存在统计学差异p<0.05；相同字母表示组间无统计学差异p>0.05)；

图6为碱性磷酸酶染色检测经scs刺激的巨噬细胞对骨髓间充质干细胞成骨活动的影响(数据图中不同字母表示组间存在统计学差异p<0.05；相同字母表示组间无统计学差异p>0.05)；

图7为茜素红染色检测经scs刺激的巨噬细胞对骨髓间充质干细胞成骨活动的影响(数据图中不同字母表示组间存在统计学差异p<0.05；相同字母表示组间无统计学差异p>0.05)；

图8为免疫组化染色检测scs体内植入区m2型巨噬细胞标识分子cd163蛋白的表达，以及m1型巨噬细胞标识分子cd68及ccr7蛋白的表达(*代表对照组与预实验组间存在统计学差异，p<0.05)；

图9为大鼠股骨部分缺损模型应用scs修复后1个月时的micro-ct检测结果(数据图中不同字母表示组间存在统计学差异p<0.05；相同字母表示组间无统计学差异p>0.05)；

图10为大鼠股骨部分缺损修复后1个月时的硬组织切片vangeison染色结果(数据图中不同字母表示组间存在统计学差异p<0.05；相同字母表示组间无统计学差异p>0.05)。

具体实施方式

发明人前期研究结果显示：scs具有较低的免疫原性，对淋巴细胞的二次刺激并没有引起明显的增殖反应(p>0.05)；同时，材料的异位植入对循环淋巴细胞的数量、活性没有影响(p>0.05)，循环中的炎症因子浓度也维持在正常水平(p>0.05)；原位组织学切片的he染色结果显示，硅化胶原支架在植入后7天、14天发生了明显的吸收，材料周围无明显炎症细胞浸润，证明了仿生硅化胶原支架材料具有良好的生物相容性，可以进一步安全地应用于体内骨缺损修复。

本发明的scs浸提液是将scs在rmpi1640细胞培养液浸泡适宜时间后，收集培养液所得。

发明人以scs作为研究模型，以人外周血中分离的单核-巨噬细胞作为研究对象，通过细胞形态学观察及半定量分析、流式细胞术、酶联免疫吸附试验、实时定量pcr方法对材料表面形貌对巨噬细胞炎症功能的影响进行了研究。

scs浸提液制备：

将scs切成500mg每份的长方体，浸于50ml配制好的rmpi1640细胞培养液中，4℃放置48小时后，取出材料，收集培养液作为scs浸提液，用于后续实验中对细胞进行刺激。

单核-巨噬细胞获取：

根据ma等的报道(biomaterials.2014dec；35(37):9853-67)，采用基于泛影钠溶液的梯度离心法分离人外周血单个核细胞，并采用黏附法纯化单核细胞。用含5％胎牛血清的rmpi1640培养基培养新鲜分离并纯化的单核细胞，培养基中不添加任何有可能刺激单核细胞的药物。将单核细胞以1×10⁶个/孔接种于6孔板中，用于体外浸提液的刺激实验。

研究结果如下：

(1)采用scs浸提液培养巨噬细胞6天，可显著诱导巨噬细胞发生m2极化，表现为较溶剂对照组显著促进cd11b⁺f4/80⁺cd11c^-cd206⁺亚型m2巨噬细胞占总细胞的百分比，该百分数与阳性对照组(il4+il13刺激组)无显著差异(图1)；scs亦可显著促进m2巨噬细胞胞内标志性蛋白诱导性一氧化碳合酶(inos)的表达(图2)；同时抑制促炎症因子il-1β、il-6及il-8的分泌，促进抑炎因子il-10及生长因子pdgf-bb、tgf-β的分泌(图3)。

(2)scs浸提液培养巨噬细胞6天，对巨噬细胞增殖、凋亡活动并不显著影响(图4)。

(3)经scs浸提液刺激的巨噬细胞可显著促进骨髓间充质干细胞(bmscs)的成骨分化，表现为促进其成骨相关标志物osterix，runx2，osteocalcin，alp及col1基因表达水平的增强(图5)，促进其碱性磷酸酶活性(图6)，促进其形成茜素红强阳性成骨结节(图7)。

(4)在大鼠股骨部分缺损的动物模型中，scs植入一个月后可显著促进植入区局部m2亚型巨噬细胞的形成，表现为局部cd163阳性m2型巨噬细胞百分数较对照组显著增高(图8)，然而，scs植入区cd68及ccr7阳性m1亚型巨噬细胞的百分数则较对照组显著降低(图8)。

(5)伴随局部m2亚型巨噬细胞的增多，局部新生骨量也显著增高。micro-ct结果显示scs能够明显的提升小鼠股骨缺损的修复水平(p<0.05)。和对照组相比，在术后1个月时，能够观察到缺损区形成了更多的新骨，同时其修复后的骨组织的改建活动更加活跃(图9)。vangeison染色的结果显示(图10)，scs修复后1个月时，大鼠股骨的缺损区域内形成了更多的胶原纤维组织(红色染色部分)，对其进行半定量分析后，其阳性区域明显高于对照组(p<0.05)。

人工材料植入体内后，巨噬细胞及其分泌的细胞因子会首先向材料植入区集聚，并产生一系列级联免疫反应，当材料未能促进或保持相关免疫反应向良性愈合发展，便会引起局部炎症反应、细胞死亡以及组织不能愈合等一系列问题，因此人工材料对宿主巨噬细胞启动的免疫应答的影响，直接关系到其最终的修复效果。巨噬细胞具有高度的功能可塑性，当其迁移至材料植入区后，可在局部微环境的作用下以不同方式激活极化，m1型极化的巨噬细胞主要发挥促炎和组织防御的作用，m2型巨噬细胞则主要行使抗炎及组织修复作用，因此巨噬细胞的m1/m2极化状态对于生物材料植入后的骨愈合起到至关重要的作用。然而，现有的人工骨修复支架材料虽具备促成骨、促成血管的效应，但并不具备对巨噬细胞调节的功能，造成体外与体内实验中促成骨效果的差异悬殊。发明人前期研究已证实仿生纤维内硅化胶原支架具备低免疫原性，高效促成骨、成血管活性，值得注意的是，发明人最新研究显示该支架在体内及体外环境中均可显著促进巨噬细胞的m2型极化，从而能够有效调节宿主免疫反应向着促进组织修复及愈合的良性方向发展，最终促进材料与机体的有机整合及骨缺损的修复。进一步说明仿生纤维内硅化胶原支架兼具高促成骨活性以及巨噬细胞调节功能，可以实现促进组织修复与调控免疫结合。