一种pH响应和肿瘤靶向的双载药纳米粒子及制备方法与应用与流程
本发明涉及一种ph响应和肿瘤靶向的双载药纳米粒子及制备方法与应用。
背景技术：
近年来，癌症成为临床上一类主要的致死疾病，一般的肿瘤疗法主要包括手术治疗、化学治疗和放射治疗等。尽管这些疗法目前依然是临床上较为有效的方法，它们的一些不足之处也值得注意：侵入性的治疗手段以及各种毒副作用常常给病人带来较大痛苦；传统的给药方式使得小分子药物在体内随机分布，不能有效富集在肿瘤部位，而大量用药又会带来抗药性；这些治疗手段不能区分正常细胞与肿瘤细胞，使得体内随机分布的药物在杀伤肿瘤细胞的同时对其他正常细胞造成损害。
基于靶向纳米载体的药物递送是一种克服传统疗法缺点的重要策略，它通过连接靶向配体的纳米载体将其负载的抗肿瘤药物精准地递送到肿瘤组织并实现药物的控制释放。靶向纳米药物有如下优点：基于纳米载体有效增加疏水性药物的溶解度；通过亲水性基团的修饰来延长药物在体内的循环时间；借助靶向配体改善药物在体内的生物分布。采用这一策略使得药物能够富集在肿瘤组织并且特异性地杀伤肿瘤细胞，提高疗效的同时减少毒副作用。同时，聚合物纳米粒子是一类可生物降解的材料，具有良好的生物相容性，被广泛应用于药物载体。因此，靶向聚合物纳米药物载体具有提高疗效的前景以及实现的可能性。
纳米粒子表面的靶向分子修饰是其中的关键技术，直接在纳米粒子表面修饰以及预先制备聚合物-靶向分子共聚物的方法具有以下缺点：采用的偶联剂、催化剂等需要通过复杂的纯化过程予以剔除；复杂的反应机理大大增加了合成的难度，降低了方法的通用性。聚多巴胺是一种具有良好生物相容性并且可以粘附在多种材料表面的表面改性剂。基于michaladdition或schiffbasereactions，具有氨基或巯基的靶向分子可以在碱性条件下方便地连接到粘附在纳米粒子表面的聚多巴胺分子上从而实现靶向纳米粒子的制备。这种方法可以实现靶向纳米粒子的简单并且通用的制备工艺。
叶酸受体介导的靶向给药主要是以叶酸受体为靶点，通过叶酸与肿瘤细胞表面过表达的叶酸受体特异性结合，进而将药物载体内吞进入细胞。研究表明，叶酸受体在包括乳腺癌、宫颈癌、肺腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌等在内的多种恶性肿瘤表面均过表达，有时可比正常组织高出100～300倍。因此，叶酸受体介导的纳米药物可以适用于包括乳腺癌和宫颈癌在内的多种恶性肿瘤的治疗。
儿茶酚和硼酸在中性或碱性条件下会生成稳定地共价相连的结构，同时该结构在酸性条件下会裂解为儿茶酚与硼酸，具有可逆性，这一过程如下图所示。由于聚多巴胺分子上充足的儿茶酚基团以及具有硼酸结构的抗癌药物硼替佐米(btz)，可以设计如下载药策略：在中性或碱性条件下聚多巴胺表面修饰的载药纳米粒子可以负载硼替佐米，在中性的血液循环中聚多巴胺与硼替佐米稳定结合有效抑制了药物的活性，在酸性的肿瘤组织中释放药物并杀伤肿瘤细胞。该策略能够同时达到双载药与ph响应的效果，可以大大提高疗效。
技术实现要素：
本发明提供一种ph响应和肿瘤靶向的双载药纳米粒子及其制备方法与应用。
具体地，本发明一个方面提供了一种ph响应和肿瘤靶向的双载药纳米粒的制备方法，其包括如下步骤：
(1)制备载疏水性药物的聚合物纳米粒；
(2)以聚多巴胺修饰载疏水性药物的聚合物纳米粒；
(3)以主动靶向配体对聚多巴胺修饰载疏水性药物的聚合物纳米粒子进行修饰，得到主动靶向配体和聚多巴胺修饰的载疏水性药物的聚合物纳米粒；
(4)将具有硼酸结构的药物负载在主动靶向配体和聚多巴胺修饰的载疏水性药物的聚合物纳米粒上，得到ph响应和肿瘤靶向的双载药纳米粒。
在本发明的技术方案中，在步骤4)中，药物负载在ph为7.5-12的弱碱性水溶液中进行，将具有硼酸结构的药物溶于有机溶剂中，加入混悬主动靶向配体和聚多巴胺修饰的载疏水性药物的聚合物纳米粒的弱碱性水溶液中，至反应完全，分离后得到双载药纳米粒；
更优选地，主动靶向配体和聚多巴胺修饰的纳米粒与硼替佐米的质量比为100:1-20，更优选为100:8-16。
所述有机溶剂选自丙酮、二氧六环、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃或n,n-二甲基甲酰胺。
在本发明的技术方案中，步骤1)为将聚合物和疏水性药物溶于有机溶剂中，并加入聚乙二醇维生素e琥珀酸酯水溶液中，反应至有机溶剂挥发完全，分离沉淀，得到载疏水性药物的聚合物纳米粒子；
其中，所述聚合物选自聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物、胆酸-聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯-聚乳酸中的一种或多种；
所述疏水性药物选自紫杉醇、多烯紫杉醇、香豆素-6、顺铂、布洛芬、10-羟基喜树碱中的一种或多种；
所述有机溶剂选自丙酮、二氧六环、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃或n,n-二甲基甲酰胺。
在本发明的技术方案中，步骤2)为将载疏水性药物的聚合物纳米粒混悬于ph为7.5-12的弱碱性水溶液中，加入多巴胺盐酸盐，反应至完全，分离沉淀，得到聚多巴胺修饰的载疏水性药物的聚合物纳米粒。
在本发明的技术方案中，步骤3)为聚多巴胺修饰的载疏水性药物的聚合物纳米粒混悬于ph为7.5-12的弱碱性水溶液中，将主动靶向配体加入到上述溶液中，反应至完全，分离沉淀得到主动靶向配体和聚多巴胺修饰的载疏水性药物的聚合物纳米粒；
在本发明的技术方案中，主动靶向配体选自叶酸聚乙二醇氨基、半乳糖胺(gal)、一种多肽(arg-gly-asp,rgd)、核酸适体巯基(aptamer-sh)。
在本发明的技术方案中，步骤2、3)或4)中ph为7.5-12的弱碱性水溶液独立的选自pbs缓冲溶液、tris缓冲溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢纳水溶液或氢氧化钠水溶液中的一种；
优选地，ph为8-9，更优选为8.5。
本发明的另一个方面提供了前述的制备方法制备的双载药纳米粒。
本发明的再一个方面提供了一种双载药纳米粒，其包含以聚合物形成的纳米粒载体骨架，纳米粒载体骨架上负载疏水性药物，纳米粒载体骨架表面覆盖有聚多巴胺，聚多巴胺上黏附有主动靶向配体，聚多巴胺上的儿茶酚基团还结合有具有硼酸基团的药物；所述双载药纳米粒为ph响应的纳米粒，在酸性条件下释放药物。
在本发明的技术方案中，双载药纳米粒中的所述聚合物选自聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物、胆酸-聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯-聚乳酸中的一种或多种；
所述疏水性药物选自紫杉醇、多烯紫杉醇、香豆素-6、顺铂、布洛芬、10-羟基喜树碱中的一种或多种；
具有硼酸结构的药物选自硼替佐米；
主动靶向配体选自叶酸聚乙二醇氨基、半乳糖胺(gal)、一种多肽(arg-gly-asp,rgd)、核酸适体巯基(aptamer-sh)。
本发明的再一个方面提供了前述的双载药纳米粒子在制备抗肿瘤药物的应用。所述肿瘤选自乳腺癌、宫颈癌、肺腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌。
本发明的具体技术方案包括：
一种叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)载药纳米粒子的制备：按比例，称取100mg聚合物，2-10mg疏水性药物，溶于8-10ml有机溶剂中，在室温搅拌的条件下，逐滴加入到100ml的0.03％(w/v)的聚乙二醇维生素e琥珀酸酯水溶液中，继续室温搅拌10-15小时以挥发有机溶剂，15000-18000rpm离心15-30分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到载疏水性药物的聚合物纳米粒子，冷冻干燥后备用；
(2)聚多巴胺的修饰：按比例，称取50mg(1)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的ph＝7.5-12的弱碱性水溶液中，称取10-50mg多巴胺盐酸盐，在室温搅拌的条件下加入到上述溶液中，反应3-6小时后15000-18000rpm离心15-30分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到聚多巴胺修饰的载疏水性药物的聚合物纳米粒子，冷冻干燥后备用；
(3)靶向配体叶酸的修饰：按比例，称取50mg(2)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的ph＝7.5-12的弱碱性水溶液中，称取50-100mg肿瘤靶向配体叶酸聚乙二醇氨基，在室温搅拌的条件下加入到上述溶液中，反应3-6小时后15000-18000rpm离心15-30分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到叶酸和聚多巴胺修饰的载疏水性药物的聚合物纳米粒子，冷冻干燥后备用；
(4)双载药：按比例，称取50mg(3)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的ph为7.5-12的弱碱性水溶液中，称取4-8mg硼替佐米溶于200-300μl有机溶剂中，在室温搅拌的条件下，逐滴加入到上述纳米粒子的混悬液中，继续搅拌10-15小时以挥发有机溶剂，15000-18000rpm离心15-30分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子，冷冻干燥后备用。
聚合物选自聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物、胆酸-聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯-聚乳酸。
疏水性药物选自紫杉醇、多烯紫杉醇、香豆素-6、顺铂、布洛芬或10-羟基喜树碱。
有机溶剂选自丙酮、二氧六环、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃或n,n-二甲基甲酰胺。
弱碱水溶液选自pbs缓冲溶液、tris缓冲溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢纳水溶液或氢氧化钠水溶液。
上述方法制备的叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子。
上述叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子在制备抗肿瘤药物的应用。
本发明方法简单，适应性广，所制备的纳米粒子具有良好的生物相容性、生物可降解性以及多种肿瘤的靶向性，双载药以及ph响应特性使其具有良好的治疗效果，实验证明，可靶向乳腺癌，并对乳腺癌有治疗作用。
附图说明
图1为动态光散射测的实施例1制备的叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向纳米粒子ca-plga@pda-peg-fa/nps(载多烯紫杉醇)的粒度分布。
图2为实施例1制备的叶酸和聚多巴胺修饰的肿瘤靶向纳米粒子ca-plga@pda-peg-fa/nps(载多烯紫杉醇)的透射电子显微镜(tem)图谱。
图3为实施例1制备的载多烯紫杉醇的四种纳米粒子(ca-plga/nps、ca-plga@pda/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps)的x射线光电子能谱(xps)的全谱扫描图。
图4为实施例1制备的载多烯紫杉醇的纳米粒子(ca-plga/nps、ca-plga@pda/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps)的多烯紫杉醇的体外释放曲线。
图5为实施例1制备的的叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps(载多烯紫杉醇)的硼替佐米的体外释放曲线。
图6为实施例1制备的载多烯紫杉醇的纳米粒子(ca-plga@pda-peg/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps)与不载药的ca-plga@pda-peg-fa/nps纳米粒子(与载药纳米粒子相同浓度)在24小时和48小时内对mcf-7细胞的细胞活性实验结果，临床用的的多烯紫杉醇制剂
图7为治疗14天后各组肿瘤的照片。各组分别注射实施例1制备的载多烯紫杉醇ca-plga@pda-peg/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps，临床用的的多烯紫杉醇制剂
图8为肿瘤的体积随着治疗时间的变化图(t-test,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
图9为裸鼠的体重随着治疗时间的变化图。
图10为治疗14天后各组裸鼠的主要器官和肿瘤的组织切片图。1，2，3，4和5分别代表生理盐水，
图11为实施例2制备的载香豆素-6的纳米粒子处理mcf-7细胞0.5小时和2小时后的激光共聚焦显微镜(clsm)图片。1，2，3和4分别代表ca-plga@pda-peg/nps(载香豆素-6)、ca-plga@pda-peg-fa/nps(载香豆素-6)、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps(载香豆素-6)和ca-plga@pda-peg-fa/nps(载香豆素-6)+游离叶酸。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
胆酸-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(ca-plga)
聚乳酸(pla)
聚乙二醇氨基(nh2-peg)
叶酸聚乙二醇氨基(nh2-peg-fa)
紫杉醇(paclitaxel,ptx)
多烯紫杉醇(docetaxel,dtx)
硼替佐米(bortezomib,btz)
香豆素-6(coumarin-6，c6)
实施例1
一种叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子的制备方法及其在乳腺癌靶向治疗中的应用，包括如下步骤：
(1)载药纳米粒子的制备：按比例，称取100mg胆酸-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(ca-plga)，10mg多烯紫杉醇，溶于8ml丙酮中，在室温搅拌的条件下，逐滴加入到100ml的0.03％(w/v)的聚乙二醇维生素e琥珀酸酯水溶液中，继续室温搅拌12小时以挥发丙酮，18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到载多烯紫杉醇(docetaxel,dtx)的纳米粒子ca-plga/nps，冷冻干燥后备用；
(2)聚多巴胺的修饰：按比例，称取50mg(1)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取25mg多巴胺盐酸盐，在室温搅拌的条件下加入到上述溶液中，反应3小时后18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到聚多巴胺(polydopamine,pda)修饰的载多烯紫杉醇的纳米粒子ca-plga@pda/nps，冷冻干燥后备用；
(3)靶向配体叶酸的修饰：按比例，称取50mg(2)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取50mg肿瘤靶向配体叶酸聚乙二醇氨基(nh2-peg-fa)，在室温搅拌的条件下加入到上述溶液中，反应3小时后18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到叶酸和聚多巴胺修饰的载多烯紫杉醇的纳米粒子ca-plga@pda-peg-fa/nps，冷冻干燥后备用；
(4)双载药：按比例，称取50mg(3)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取6mg硼替佐米溶于200μl二甲基亚砜中，在室温搅拌的条件下，逐滴加入到上述纳米粒子的混悬液中，继续搅拌12小时以挥发二甲基亚砜，18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps(载多烯紫杉醇)，冷冻干燥后备用。
将步骤(3)中的nh2-peg-fa替换为nh2-peg可以得到聚乙二醇和聚多巴胺修饰的载多烯紫杉醇的纳米粒子ca-plga@pda-peg/nps。
步骤(1)、(2)、(3)、(4)中的纳米粒子的水合粒径(由动态光散射测量)分别为103.4nm、160.8nm、166.4nm、168.7nm，均在100-200nm之间且分布比较均匀，有利于肿瘤细胞的摄取；另外，上述四种纳米粒子的zete电位分别为-22.5mv、-18.4mv、-11.7mv、-11.2mv，绝对值均比较大，有利于纳米粒子在分散相中稳定存在。其中，图1为动态光散射测得的实施例1制备的纳米粒子ca-plga@pda-peg-fa/nps(载多烯紫杉醇)的粒径分布图，平均粒径大约为168.7nm且分布比较均匀；图2为实施例1制备的纳米粒子ca-plga@pda-peg-fa/nps(载多烯紫杉醇)的透射电镜结果，纳米粒子为具有核壳结构的光滑的球形结构，说明表面经过了聚多巴胺和叶酸的修饰，由此估计的粒径约为85nm且大小均一；两种方法测得的粒径差距较大的原因是纳米粒子在干燥过程中的收缩和塌陷。
实施例1制备的载多烯紫杉醇的四种纳米粒子(ca-plga/nps、ca-plga@pda/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps)的xps全谱扫描结果如图3所示。由图3可知，后三种纳米粒子的谱图均出现n1s峰，证明聚多巴胺的修饰；ca-plga@pda-peg-fa/nps的n1s峰强于ca-plga@pda/nps，证明叶酸的修饰；ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps出现b1s峰，证明硼替佐米的负载。
实施例1制备的载多烯紫杉醇的四种纳米粒子(ca-plga/nps、ca-plga@pda/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps)的多烯紫杉醇载药量分别为9.96％、9.78％、9.67％、9.01％，说明表面修饰对纳米粒子的载药量影响不大；另外，ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps的硼替佐米的载药量为9.18％。
如图4所示，透析法测定纳米粒子的多烯紫杉醇缓释曲线。步骤(1)、(2)、(3)制备的载多烯紫杉醇的纳米粒子ca-plga/nps、ca-plga@pda/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps分别称取5mg溶解于1ml的释放介质pbst溶液(pbs溶液，包含0.1％w/v的吐温-80，ph7.4)，转移到透析袋(mwco＝3500，上海生工)中并封口，再浸没在装有15ml释放介质pbst溶液的50ml离心管中，最后置于恒温水浴摇床上于37℃震荡。在一定的时间间隔从离心管中取出1ml溶液用于分析，再补充等量的新鲜溶液。取出的1ml溶液中加入1ml二乙醚萃取，弃去水相后通氮气挥发二乙醚，待二乙醚挥发完全，加入1ml流动相乙腈：水(50/50，v/v)经超声分散并由0.1μm滤膜过滤后，取20μl加入到hplc中进行测量。测量条件为：流动相为乙腈：水(50/50，v/v)；流动相速度为1.0ml/min；采用反相c-18柱子(150×4.6mm,5μm,c18,安捷伦)；检测波长为227nm。根据多烯紫杉醇的标准曲线绘制出其随时间变化的释放曲线如图4：三种纳米粒子均表现相同的释放模式，即第一个阶段的突释(前两天释放约50％)和第二个阶段的缓释(最终缓慢释放至80％左右)。
如图5所示，透析法测定实施例1制备的载多烯紫杉醇的纳米粒子ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps的硼替佐米的缓释曲线。具体过程与上述透析法相似，仅替换以下条件：分三个ph值(ph7.4，ph6.5，ph5.0)测定其释放曲线；流动相替换为乙腈：水(80/20，v/v)；检测波长为270nm。得到的硼替佐米释放曲线如图5所示，在ph7.4的条件下经过12小时金释放约25％；在ph6.5的条件下释放量少量增加；在ph5.0的条件下，两个小时硼替佐米释放超过50％，最终经过12小时释放量大约为80％。通过对比发现，在ph5.0的条件下硼替佐米的释放速度与释放量都大大提高，证明了硼替佐米释放的ph响应性。
如图6所示，用mtt法测定了纳米粒子在24小时和48小时对乳腺癌细胞mcf-7的细胞毒性。将mcf-7细胞以1×104细胞/孔的密度接种到96孔板上，培养过夜并贴壁后，分别用纳米粒子ca-plga@pda-peg-fa/nps(不载药)、
结果表明：ca-plga@pda-peg-fa/nps(不载药)在各个浓度均没有表现出细胞毒性，排除了药物载体的细胞毒性；其余多烯紫杉醇配方均表现出细胞毒性，其中三种载药纳米粒子的细胞毒性均大于临床用的多烯紫杉醇制剂
图7为治疗14天后各组肿瘤的照片。各组分别注射实施例1制备的三种载多烯紫杉醇的纳米粒子(ca-plga@pda-peg/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps)，另外一组注射生理盐水(saline)作为空白对照，一组注射临床用的多烯紫杉醇制剂
图8为肿瘤的体积随着治疗时间的变化图。当皮下注射mcf-7细胞的裸鼠的肿瘤长到50mm3时，将其随机分为五组(每组5只)分别腹腔注射载多烯紫杉醇的ca-plga@pda-peg/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps以及生理盐水和
如图10所示，显示了经过14天治疗的裸鼠的主要器官(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤的组织切片图。图中显示
实施例2
一种叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子的制备方法及其在乳腺癌靶向治疗中的应用，包括如下步骤：
(1)载药纳米粒子的制备：按比例，称取100mg胆酸-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(ca-plga)，2mg香豆素-6，溶于8ml丙酮中，在室温搅拌的条件下，逐滴加入到100ml的0.03％(w/v)的聚乙二醇维生素e琥珀酸酯水溶液中，继续室温搅拌12小时以挥发丙酮，18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到载香豆素-6(coumarin-6,c6)的纳米粒子ca-plga/nps，冷冻干燥后备用；
(2)聚多巴胺的修饰：按比例，称取50mg(1)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取25mg多巴胺盐酸盐，在室温搅拌的条件下加入到上述溶液中，反应3小时后18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到聚多巴胺(polydopamine,pda)修饰的载香豆素-6的纳米粒子ca-plga@pda/nps，冷冻干燥后备用；
(3)靶向配体叶酸的修饰：按比例，称取50mg(2)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取50mg肿瘤靶向配体叶酸聚乙二醇氨基(nh2-peg-fa)，在室温搅拌的条件下加入到上述溶液中，反应3小时后18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到叶酸和聚多巴胺修饰的载香豆素-6的纳米粒子ca-plga@pda-peg-fa/nps，冷冻干燥后备用；
(4)双载药：按比例，称取50mg(3)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取6mg硼替佐米溶于200μl二甲基亚砜中，在室温搅拌的条件下，逐滴加入到上述纳米粒子的混悬液中，继续搅拌12小时以挥发二甲基亚砜，18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps(载香豆素-6)，冷冻干燥后备用。
将步骤(3)中的nh2-peg-fa替换为nh2-peg可以得到聚乙二醇和聚多巴胺修饰的载香豆素-6的纳米粒子ca-plga@pda-peg/nps。
图11为用共聚焦显微镜观察mcf-7细胞对载香豆素-6的三种纳米粒子(ca-plga@pda-peg/nps、ca-plga@pda-peg-fa/nps、ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps)的摄取结果，另外还有一组同时加入ca-plga@pda-peg-fa/nps(载香豆素-6)和游离的叶酸用于证明叶酸介导的细胞内吞作用。将mcf-7细胞接种到玻底培养皿中，培养过夜并贴壁后，分别加入250μg/ml的载香豆素-6的纳米粒子，其中验证组为加入ca-plga@pda-peg-fa/nps(载香豆素-6)(125μg/ml)和游离叶酸(125μg/ml)。培养0.5小时和2小时后，用pbs将细胞洗涤3次，用4％的多聚甲醛溶液固定15分钟，用pbs将细胞洗涤3次，用dapi染细胞核10分钟，用pbs将细胞洗涤3次，之后用共聚焦显微镜观察细胞摄取情况。如图11所示，培养0.5小时细胞就已经开始摄取纳米粒子，培养2小时后细胞摄取的纳米粒子的荧光增强，其中细胞对载香豆素-6的ca-plga@pda-peg-fa/nps和ca-plga@pda-peg-fa+btz/nps的摄取量相差不大，荧光强度均明显强于载香豆素-6的ca-plga@pda-peg/nps，这说明叶酸介导的细胞内吞作用明显增加了细胞对纳米粒子的摄取，而且负载硼替佐米这一工艺没有影响其主动靶向作用。另外加入游离叶酸的验证组的荧光明显减弱，这进一步验证了叶酸介导的主动靶向作用。
实施例3
一种叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)载药纳米粒子的制备：按比例，称取100mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)，10mg紫杉醇，溶于10ml四氢呋喃中，在室温搅拌的条件下，逐滴加入到100ml的0.03％(w/v)的聚乙二醇维生素e琥珀酸酯水溶液中，继续室温搅拌12小时以挥发四氢呋喃，18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到载紫杉醇(paclitaxel,ptx)的纳米粒子plga/nps，冷冻干燥后备用；
(2)聚多巴胺的修饰：按比例，称取50mg(1)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取10mg多巴胺盐酸盐，在室温搅拌的条件下加入到上述溶液中，反应6小时后18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到聚多巴胺(polydopamine,pda)修饰的载紫杉醇的纳米粒子plga@pda/nps，冷冻干燥后备用；
(3)靶向配体叶酸的修饰：按比例，称取50mg(2)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取50mg肿瘤靶向配体叶酸聚乙二醇氨基(nh2-peg-fa)，在室温搅拌的条件下加入到上述溶液中，反应3小时后18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到叶酸和聚多巴胺修饰的载紫杉醇的纳米粒子plga@pda-peg-fa/nps，冷冻干燥后备用；
(4)双载药：按比例，称取50mg(3)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取4mg硼替佐米溶于200μl二甲基亚砜中，在室温搅拌的条件下，逐滴加入到上述纳米粒子的混悬液中，继续搅拌12小时以挥发二甲基亚砜，18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子plga@pda-peg-fa+btz/nps(载紫杉醇)，冷冻干燥后备用。
实验证明，用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)替代实施例1的胆酸-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(ca-plga)，得到的叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子plga@pda-peg-fa+btz/nps的表征数据与实施例1无实质性差别。
实施例4
一种叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)载药纳米粒子的制备：按比例，称取100mg聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(peg-plga)，10mg紫杉醇，溶于10ml四氢呋喃中，在室温搅拌的条件下，逐滴加入到100ml的0.03％(w/v)的聚乙二醇维生素e琥珀酸酯水溶液中，继续室温搅拌12小时以挥发四氢呋喃，18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到载紫杉醇(paclitaxel,ptx)的纳米粒子peg-plga/nps，冷冻干燥后备用；
(2)聚多巴胺的修饰：按比例，称取50mg(1)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取10mg多巴胺盐酸盐，在室温搅拌的条件下加入到上述溶液中，反应6小时后18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到聚多巴胺(polydopamine,pda)修饰的载紫杉醇的纳米粒子peg-plga@pda/nps，冷冻干燥后备用；
(3)靶向配体叶酸的修饰：按比例，称取50mg(2)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取50mg肿瘤靶向配体叶酸聚乙二醇氨基(nh2-peg-fa)，在室温搅拌的条件下加入到上述溶液中，反应3小时后18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到叶酸和聚多巴胺修饰的载紫杉醇的纳米粒子peg-plga@pda-peg-fa/nps，冷冻干燥后备用；
(4)双载药：按比例，称取50mg(3)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取4mg硼替佐米溶于200μl二甲基亚砜中，在室温搅拌的条件下，逐滴加入到上述纳米粒子的混悬液中，继续搅拌12小时以挥发二甲基亚砜，18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子peg-plga@pda-peg-fa+btz/nps(载紫杉醇)，冷冻干燥后备用。
实验证明，用聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(peg-plga)替代实施例1的胆酸-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(ca-plga)，得到的叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子peg-plga@pda-peg-fa+btz/nps的表征数据与实施例1无实质性差别。
实施例5
一种叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)载药纳米粒子的制备：按比例，称取100mg聚乳酸(pla)，10mg顺铂，溶于8ml二甲基亚砜中，在室温搅拌的条件下，逐滴加入到100ml的0.03％(w/v)的聚乙二醇维生素e琥珀酸酯水溶液中，继续室温搅拌12小时以挥发二甲基亚砜，18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到载顺铂的纳米粒子pla/nps，冷冻干燥后备用；
(2)聚多巴胺的修饰：按比例，称取50mg(1)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取50mg多巴胺盐酸盐，在室温搅拌的条件下加入到上述溶液中，反应3小时后18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到聚多巴胺(polydopamine,pda)修饰的载顺铂的纳米粒子pla@pda/nps，冷冻干燥后备用；
(3)靶向配体叶酸的修饰：按比例，称取50mg(2)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取100mg肿瘤靶向配体叶酸聚乙二醇氨基(nh2-peg-fa)，在室温搅拌的条件下加入到上述溶液中，反应3小时后18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到叶酸和聚多巴胺修饰的载顺铂的纳米粒子pla@pda-peg-fa/nps，冷冻干燥后备用；
(4)双载药：按比例，称取50mg(3)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取8mg硼替佐米溶于300μl二甲基亚砜中，在室温搅拌的条件下，逐滴加入到上述纳米粒子的混悬液中，继续搅拌12小时以挥发二甲基亚砜，18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子pla@pda-peg-fa+btz/nps(载顺铂)，冷冻干燥后备用。
实验证明，用聚乳酸(pla)替代实施例1的胆酸-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(ca-plga)，得到的叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子pla@pda-peg-fa+btz/nps的表征数据与实施例1无实质性差别。
实施例6
一种叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)载药纳米粒子的制备：按比例，称取100mg聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯-聚乳酸(tpgs-pla)，10mg顺铂，溶于8ml二甲基亚砜中，在室温搅拌的条件下，逐滴加入到100ml的0.03％(w/v)的聚乙二醇维生素e琥珀酸酯水溶液中，继续室温搅拌12小时以挥发二甲基亚砜，18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到载顺铂的纳米粒子tpgs-pla/nps，冷冻干燥后备用；
(2)聚多巴胺的修饰：按比例，称取50mg(1)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取50mg多巴胺盐酸盐，在室温搅拌的条件下加入到上述溶液中，反应3小时后18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到聚多巴胺(polydopamine,pda)修饰的载顺铂的纳米粒子tpgs-pla@pda/nps，冷冻干燥后备用；
(3)靶向配体叶酸的修饰：按比例，称取50mg(2)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取100mg肿瘤靶向配体叶酸聚乙二醇氨基(nh2-peg-fa)，在室温搅拌的条件下加入到上述溶液中，反应3小时后18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到叶酸和聚多巴胺修饰的载顺铂的纳米粒子tpgs-pla@pda-peg-fa/nps，冷冻干燥后备用；
(4)双载药：按比例，称取50mg(3)中所制备的纳米粒子重悬于50ml的10mm，ph＝8.5的tris缓冲液中，称取8mg硼替佐米溶于300μl二甲基亚砜中，在室温搅拌的条件下，逐滴加入到上述纳米粒子的混悬液中，继续搅拌12小时以挥发二甲基亚砜，18000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用去离子水洗涤3次，得到叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子tpgs-pla@pda-peg-fa+btz/nps(载顺铂)，冷冻干燥后备用。
实验证明，用聚乙二醇1000维生素e琥珀酸酯-聚乳酸(tpgs-pla)替代实施例1的胆酸-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(ca-plga)，得到的叶酸和聚多巴胺修饰的ph响应的肿瘤靶向双载药纳米粒子tpgs-pla@pda-peg-fa+btz/nps的表征数据与实施例1无实质性差别。
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