本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种具有快速止血作用的牦牛皮胶原蛋白海绵及其制备方法和应用。
背景技术：
胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，分布于机体的各个器官，是生物体内含量最多、最丰富的蛋白质，约占体内蛋白质总量的25％～30％。胶原蛋白含有大量极性基团，具有表面活性和很好的相容性。胶原蛋白独特的三股螺旋结构，赋予其良好的生物相容性、生物可降解性、低抗原性等特性。此外，胶原分子能够激活内源性凝血途径，且含有的羟基脯氨酸又是一种起修复作用的氨基酸，当胶原与血小板作用后，能快速引起后继的与血液聚集相关联的一系列过程的进行，从而迅速凝血，达到止血效果；同时，胶原蛋白能促进成纤维细胞的增殖和分化，诱导成核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的聚集，促进毛细血管生长，进而加速组织再生和创面愈合。因此，胶原蛋白已在医药、生物组织工程等方面展现出极大潜力。
明胶是胶原的温和断裂降解产物，是分子量分布很宽的多肽分子混合物，分子量一般在几万至十几万。明胶为亲水性胶体，是一种两性电解质。明胶分子结构上有大量的羟基，另外还有许多羧基和氨基；明胶含有内氨酸、甘氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸等人体所需的18种氨基酸，但明胶属于营养不完全蛋白质，缺乏某些必需氨基酸，尤其是色氨酸。明胶易溶于温水，其溶解度与凝固温度相差很小，易受水份、温度、湿度的影响而变质。正因为明胶的凝胶性、固水性、粘合性和溶解性等多种特性，使其医药行业有广泛的用途。
现有的止血胶原蛋白海绵多用牛跟腱为原料进行提取胶原蛋白或明胶后，结合其他高分子生物材料、高分子聚合物或制备技术进行胶原蛋白海绵的制备，品种单一，因此开发效果更佳的多样的止血胶原蛋白海绵具有重要的意义。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的首要目的在于提供一种具有快速止血作用的牦牛皮胶原蛋白海绵，该胶原蛋白海绵能加速出血部位的止血速度，并且在组织愈合的同时逐渐降解，降解产物通过促进细胞增殖等作用，起到促进创伤修复的作用。
本发明的另一目的在于提供上述具有快速止血作用的牦牛皮胶原蛋白海绵的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述具有快速止血作用的牦牛皮胶原蛋白海绵的应用。
为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案如下：
一种具有快速止血作用的牦牛皮胶原蛋白海绵，其特征在于，所述具有快速止血作用的牦牛皮胶原蛋白海绵是由牦牛皮胶原蛋白及牦牛皮明胶构成；
进一步，所述具有快速止血作用的牦牛皮胶原蛋白海绵是由混合溶液冷冻干燥或直接干燥得到的具有三维多孔结构的支架；
进一步，所述具有快速止血作用的牦牛皮胶原蛋白海绵是由混合溶液冷冻干燥或直接干燥得到的具有三维多孔结构的支架，所述支架具备以下特点：质量≥5mg/cm3，拉力≥65g/cm2，吸水量不小于吸水前自身重量的17倍，总蛋白含量≥总重量的65％(m/m)，厚度为1～6毫米。
一种具有快速止血作用的牦牛皮胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将新鲜的青藏高原牦牛wildyak的牦牛皮清洗干净，然后剔除牦牛毛，剪成长5～8cm、宽5～8cm小块，并除去表层和皮下组织层，得到的牦牛皮真皮层小块；
(2)i型胶原制备：步骤(1)得到的牦牛皮真皮层小块进一步切碎，长1～3mm，宽1～3mm。0.5mol·l-1醋酸溶液，料液比1:10～30，牦牛皮:胃蛋白酶重量比100:1.0～2.5。低温搅拌提取16～36h，过滤、盐析、纯化，冷冻干燥后备用；
(3)明胶制备：步骤(1)得到的牦牛皮真皮层小块直接进行水提，得到提取液，该提取液利用具有一定大小孔径的微孔滤膜过滤后，得到上下层不同分子量范围的提取液，将所述上层提取液浓缩，冷冻干燥后备用；
(4)将步骤(2)和步骤(3)所得的样品按照质量比1:1～4混合后加蒸馏水低温溶解，浓缩料液比至1:0.6～0.2；
(5)将步骤(4)所得的浓缩溶液真空或离心脱气后倒入磨具，将模具于-80℃冷冻4～8h后冷冻干燥，得到所述的快速止血牦牛皮胶原蛋白海绵。
优选的，步骤(2)所述的加nacl进行盐析，nacl最终浓度至3～5mol/l，之后的反复盐析用梯度2.5～0.9mol/l逐级盐析；
优选的，步骤(3)所述牦牛皮提取的明胶的分子量10～180kda；
优选的，步骤(3)所述水提的条件是指料液比为1：10～20，温度为65～100℃，提取次数1～4次，每次3～8小时；
优选的，步骤(3)所述的微孔滤膜是指滤过分子量为10kda孔径的滤膜至孔径为0.1μm的滤膜；
优选的，步骤(3)(4)所述的浓缩的条件是低温常压浓缩，温度30～40℃或压力为0.09mpa，真空度为500～600mmhg的加压浓缩；
优选的，步骤(2)(3)(5)所述的冷冻干燥是在-10～-80℃冷冻4～8h，然后在真空、冷阱温度-60℃下冷冻干燥16～20h；
优选的，步骤(3)所述的冷冻干燥是在-20～-80℃冷冻5～7h，然后在真空、冷阱温度-60℃下冷冻干燥16～20h。
所述一种具有快速止血作用的牦牛皮胶原蛋白海绵在外表皮出血的止血，内脏组织大量出血的止血，神经外科，骨科，妇科及普外科手术中止血和创伤修复应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
1.本发明以青藏高原牦牛的皮为原料，利用牦牛生长于高寒地区，牦牛皮的无污染性，及其所提取胶原/明胶相比其他来源明胶的高变性温度(参见表1)的可能原因——胶原蛋白氨基酸序列的特殊性，开发新的胶原蛋白海绵的制备原材料，提高牦牛皮的附加值。
2.本发明提取方法中所用提取溶剂为纯水，后期仅低温冷冻及冷冻干燥，提取制备方法成本低。
3.本发明快速止血胶原蛋白海绵使用操作方便，膜强度高；柔韧性好。可根据使用要求的不同，选择合适强度的支架材料。
4.本发明快速止血胶原蛋白海绵用途广泛，能够快速止血，保护伤口、促进愈合，以及用于神经外科，骨科，妇科，普外科，手术室等临床医学其他领域。
5.本发明原料中截取高分子量的牦牛皮明胶，因为不同分子量明胶对血小板聚集的促进作用不一致，高分子量范围的明胶止血效果更明显。
6.本发明具有快速止血作用的牦牛皮胶原蛋白海绵能加速出血部位的止血速度，并且在组织愈合的同时逐渐降解，降解产物通过促进细胞增殖等作用，起到促进创伤修复的作用。
表1不同酶解时间牦牛皮胶样品的dsc值(
不同的上标代表有统计差异，p<0.05。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.制备牦牛皮胶原蛋白海绵
(1)新鲜的青藏高原牦牛wildyak的牦牛皮清洗干净，用5％的naoh溶液浸泡48h后剔除牦牛毛，用蒸馏水清洗3次至中性，剪成长5～7cm、宽5～7cm小块，并除去表皮和皮下组织层，得到真皮层；
(2)i型胶原制备：步骤(1)得到的牦牛皮真皮层小块进一步切碎，长1～2mm，宽1～2mm。0.5mol/l醋酸溶液，料液比1:15，牦牛皮:胃蛋白酶重量比100:1.0。低温搅拌提取16h，过滤后，滤液中加入nacl进行盐析，nacl最终浓度至4mol/l，搅拌10h，低温离心，将沉淀溶于0.5mol/l冰醋酸中，再逐级用2.5，1.8和0.9mol/l的nacl反复盐析、酸溶，最后得到胶原粗提液；将粗提液装入100kda孔径的透析袋中，用0.04mol/l的醋酸溶液透析16h，再用蒸馏水透析16h，4h晃动透析袋一次，得到纯化物后，冷冻干燥备用；
(3)明胶制备：步骤(1)得到的牦牛皮真皮层小块直接进行水提，料液比为1:15，温度为80℃，提取次数3次，每次5小时，三次提取液混合，该提取液利用0.1μm滤膜过滤后，将上层提取液在压力为0.09mpa，真空度为550mmhg的条件下浓缩至1:0.2，冷冻干燥备用；
(4)将步骤(2)和步骤(3)所得的样品按照质量比1:1混合后加蒸馏水低温溶解，浓缩料液比至1:0.2；
(5)将所得的浓缩溶液真空脱气后倒入磨具，将模具于-20℃冷冻6h后在真空、冷肼温度-60℃下冷冻干燥16h，即得到快速止血牦牛皮胶原蛋白海绵。
所制备的快速止血牦牛皮胶原海绵厚度约为3～5毫米，钴60辐射灭菌后备用。
2.牦牛皮胶原蛋白海绵快速止血和修复创伤的效果实验：以小鼠剪尾出血为模型，将直径为0.4毫米，厚3～5毫米的原片状牦牛皮胶原蛋白海绵贴附到刚剪尾出血的小鼠尾巴处，鼠尾停止出血时间小于10s，比空白鼠尾停止出血的时间缩短了25s左右。用胶原蛋白海绵止血的小鼠尾部1周左右，相比未用胶原蛋白海绵止血的小鼠尾部，伤口处有类似新生毛囊的生成，上皮组织有生长趋势，创面和周围皮肤接近，创面颜色较淡，较平整，表面被表皮细胞层覆盖。
实施例2
1.制备牦牛皮胶原蛋白海绵
(1)新鲜的青藏高原牦牛wildyak的牦牛皮清洗干净，用10％的naoh溶液浸泡12h后剔除牦牛毛，用蒸馏水清洗5次至中性，剪成长6～8cm、宽6～8cm小块，并除去表皮和皮下组织层，得到真皮层；
(2)i型胶原制备：步骤(1)得到的牦牛皮真皮层小块进一步切碎，长2～3mm，宽2～3mm。0.5mol·l-1醋酸溶液，料液比1:20，牦牛皮:胃蛋白酶重量比100:1.5。低温搅拌提取24h，过滤后，滤液中加入nacl进行盐析，nacl最终浓度至5mol/l，搅拌12h，低温离心，将沉淀溶于0.5mol/l冰醋酸中，再逐级用2.1，1.5和1.0mol/l的nacl反复盐析、酸溶，最后得到胶原粗提液；将粗提液而装入100kda孔径的透析袋中，用0.08mol/l的醋酸溶液透析24h，再用蒸馏水透析24h，6h晃动透析袋一次，得到纯化物后，冷冻干燥备用；
(3)明胶制备：步骤(1)得到的牦牛皮真皮层小块直接进行水提，料液比为1:20，温度为90℃，提取次数3次，每次6小时，三次提取液混合，该提取液利用0.1μm滤膜过滤后，将上层提取液在压力为0.09mpa，真空度为600mmhg的条件下浓缩至1:0.4，冷冻干燥备用；
(4)将步骤(2)和步骤(3)所得的样品按照质量比1:3混合后加蒸馏水低温溶解，浓缩料液比至1:0.3；
(5)将所得的浓缩溶液真空脱气后倒入磨具，将模具于-80℃冷冻5h后在真空、冷肼温度-60℃冷冻干燥14h，即得到快速止血牦牛皮胶原海绵。
所制备的快速止血牦牛皮胶原海绵厚度约为2～4毫米，钴60辐射灭菌后备用。
2.牦牛皮胶原蛋白海绵快速止血和修复创伤的效果实验：以小鼠剪尾出血为模型，将直径为0.4毫米，厚2～4毫米的原片状牦牛皮胶原蛋白海绵贴附到兔子耳部中央动脉创面，兔耳创面的止血时间在80～92s之间，比空白物理按压止血时间缩短140s左右。2周后，胶原蛋白海绵止血的兔子耳部创伤面较平整，颜色较淡，接近周边皮肤。
实施例3
1.制备牦牛皮胶原蛋白海绵
(1)新鲜的青藏高原牦牛wildyak的牦牛皮清洗干净，用8％的naoh溶液浸泡36h后剔除牦牛毛，用蒸馏水清洗4次至中性，剪成长5～6cm、宽5～6cm小块，并除去表皮和皮下组织层，得到真皮层；
(2)i型胶原制备：步骤(1)得到的牦牛皮真皮层小块进一步切碎，长1～2mm，宽1～2mm。0.5mol/l醋酸溶液，料液比1:30，牦牛皮:胃蛋白酶重量比100:2。低温搅拌提取24h，过滤后，滤液中加入nacl进行盐析，nacl最终浓度至3mol/l，搅拌10h，低温离心，将沉淀溶于0.5mol/l冰醋酸中，再逐级用2.0，1.4和0.9mol/l的nacl反复盐析、酸溶，最后得到胶原粗提液；将粗提液装入100kda孔径的透析袋中，用0.1mol/l的醋酸溶液透析24h，再用蒸馏水透析24h，4h晃动透析袋一次，得到纯化物后，冷冻干燥备用；
(3)明胶制备：步骤(1)得到的牦牛皮真皮层小块直接进行水提，料液比为1:20，温度为90℃，提取次数2次，每次8小时，两次提取液混合，该提取液利用15kda孔径的滤膜过滤后，将上层提取液在压力为0.09mpa，真空度为600mmhg的条件下浓缩至1:0.2，冷冻干燥备用；
(4)将步骤(2)和步骤(3)所得的样品按照质量比1:1混合后加蒸馏水低温溶解，浓缩料液比至1:0.4；
(5)将所得的浓缩溶液真空脱气后倒入磨具，将模具于-80℃冷冻6h后在真空、冷肼温度-60℃冷冻干燥16h，即得到快速止血牦牛皮胶原海绵。
所制备的快速止血牦牛皮胶原海绵厚度约为1～3毫米，钴60辐射灭菌后备用。
2.牦牛皮胶原蛋白海绵作为组织工程材料的效果实验：胶原蛋白海绵与人皮肤表皮成纤维细胞共同培养，成纤维细胞可以正常生长，细胞形态正常，且随着时间的退役，细胞与胶原海绵共培养物中的部分胶原蛋白变细，细胞数量增加，海绵的空隙越来越小。
实施例4
1.制备牦牛皮胶原蛋白海绵
(1)新鲜的青藏高原牦牛wildyak的牦牛皮清洗干净，用10％的naoh溶液浸泡24h后剔除牦牛毛，用蒸馏水清洗5次至中性，剪成长7～8cm、宽7～8cm小块，并除去表皮和皮下组织层，得到真皮层；
(2)i型胶原制备：步骤(1)得到的牦牛皮真皮层小块进一步切碎，长2～3mm，宽2～3mm。0.5mol/l醋酸溶液，料液比1:25，牦牛皮:胃蛋白酶重量比100:2.5。低温搅拌提取36h，过滤后，滤液中加入nacl进行盐析，nacl最终浓度至3.5mol/l，搅拌12h，低温离心，将沉淀溶于0.5mol/l冰醋酸中，再逐级用2.5，1.6和1.1mol/l的nacl反复盐析、酸溶，最后得到胶原粗提液；将粗提液装入100kda孔径的透析袋中，用0.08mol/l的醋酸溶液透析36h，再用蒸馏水透析36h，6h晃动透析袋一次，得到纯化物后，冷冻干燥备用；
(3)明胶制备：步骤(1)得到的牦牛皮真皮层小块直接进行水提，料液比为1:30，温度为85℃，提取次数4次，每次5小时，四次提取液混合，该提取液利用15kda孔径的滤膜过滤后，将上层提取液在压力为0.09mpa，真空度为580mmhg的条件下浓缩至1:0.5，冷冻干燥备用；
(4)将步骤(2)和步骤(3)所得的样品按照质量比1:4混合后加蒸馏水低温溶解，浓缩料液比至1:0.4；
(5)将所得的浓缩溶液真空脱气后倒入磨具，将模具于-50℃冷冻8h后在真空、冷阱温度-60℃下冷冻干燥18h，即得到快速止血牦牛皮胶原海绵。
所制备的快速止血牦牛皮胶原海绵厚度约为2～4毫米，钴60辐射灭菌后备用。
2.牦牛皮胶原蛋白海绵作为组织工程材料的效果实验：胶原蛋白海绵与人皮肤表皮成纤维细胞共同培养，成纤维细胞可以正常生长，且随着时间的推移，细胞数量增加，海绵的空隙越来越小。用ao/eb荧光染色法检测后，发现培养24h时，细胞的代谢活性没有受到严重影响，且基本无细胞凋亡。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。