二甲双胍在逆转卵巢癌顺铂耐药性中的应用的制作方法

本发明涉及一种二甲双胍的新医药用途，具体涉及二甲双胍在逆转卵巢癌顺铂耐药性中的应用，属于药物领域。

背景技术

卵巢癌是女性生殖系统发病率居第3位的恶性肿瘤，其病死率居首位。目前治疗主要是首次的肿瘤细胞减灭术随后以铂类为主的联合化疗，80％的患者首次化疗效果显著，但大部分患者因化疗耐药、复发，最终死亡。卵巢癌的5年生存率仅为30％。化疗耐药是导致患者死亡的主要原因，也是当前困扰卵巢癌治疗的一大难题。因此寻找一种能够改善和逆转卵巢癌化疗耐药的药物已成为当前治疗卵巢癌的关键。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种二甲双胍的新用途，尤其是在顺铂耐药卵巢癌治疗中的应用，二甲双胍能够逆转卵巢癌顺铂耐药性。

二甲双胍可用于预防和/或治疗卵巢癌。

所述卵巢癌对顺铂具有耐药性。

二甲双胍还可用于制备具有如下1)-3)中任一种功能的产品：

1)抑制卵巢癌细胞的增殖；

2)加速卵巢癌细胞的凋亡；

3)延缓卵巢癌细胞的生长。

所述卵巢癌细胞对顺铂具有耐药性，具体可为cp70(a2780/ddp)细胞和c13k(ov2008/ddp)细胞。

本发明还进一步提供了二甲双胍在逆转卵巢癌耐药性中的应用。

所述应用中，所述二甲双胍与化疗药物联合应用，所述化疗药物为顺铂。

经本发明对化疗耐药卵巢癌裸鼠模型(卵巢癌细胞为cp70细胞和c13k细胞，化疗药物为顺铂)的实验表明，二甲双胍通过调整细胞周期(延缓细胞生长)、加速细胞凋亡、抑制细胞增殖等方式改变化疗耐药的卵巢癌细胞生长。经本发明的体内动物实验证明二甲双胍能有效抑制耐药卵巢癌动物模型皮下肿瘤生长速度，逆转顺铂耐药性。

附图说明

图1为不同浓度二甲双胍作用于顺铂耐药的卵巢癌细胞后细胞周期变化图，其中图1(a)为c13k细胞系细胞周期分布图，图1(b)为cp70细胞系细胞周期分布图。

图2为不同浓度二甲双胍作用于顺铂耐药的卵巢癌细胞系后细胞凋亡图，其中图2(a)为c13k细胞系细胞凋亡图，图2(b)为cp70细胞系细胞凋亡图，图2(a)和图2(b)中的左侧图为流式细胞仪检测细胞凋亡率明显增加(右下象限)，右侧图为凋亡率直观柱状图。

图3为二甲双胍作用顺铂耐药卵巢癌裸鼠模型30天后剥出肿瘤组织照片，其中图3(a)为顺铂耐药卵巢癌细胞系cp70，图3(b)为顺铂耐药卵巢癌细胞系c13k。

图4为二甲双胍作用顺铂耐药卵巢癌裸鼠模型30天后肿瘤体积变化图及肿瘤生长曲线图，其中图4(a)为顺铂耐药卵巢癌细胞系cp70，图4(b)为顺铂耐药卵巢癌细胞系c13k。

图5为二甲双胍作用顺铂耐药卵巢癌裸鼠模型30天后肿瘤组织tunel，其中图5(a)为顺铂耐药卵巢癌细胞系cp70，图5(b)为顺铂耐药卵巢癌细胞系c13k。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的pbs配方如下表1中所示：

表1磷酸盐缓冲液(pbs)的配制

0.22μm滤膜过滤除菌，于4℃保存备用。

实施例1、二甲双胍抑制顺铂耐药的卵巢癌细胞体外增殖

(1)检测不同浓度二甲双胍对顺铂耐药卵巢癌细胞系增殖的作用

顺铂耐药卵巢癌细胞系cp70和c13k分别以8×10³/孔和1×10⁴/孔的浓度接种于96孔板24h后(即细胞饥饿24h后，培养基为dmem/f12，购自sigma，产品目录号为d6241)，更换为含不同浓度的二甲双胍(购自sigma，产品目录号为d150969-5g)完全培养基(以未加二甲双胍为对照，二甲双胍浓度分别设定为0.01mmol/l、0.1mmol/l、1mmol/l和10mmol/l)，48小时后用brdu-elisa试剂盒(roche)(cellproliferationelisa，brdu(colorimetric)cat.no.11647229001)检测每种细胞增殖的变化(增殖率＝实验组(a450nm)/对照组(a450nm)×100％)。同时用mtt方法验证brdu技术的有效性。

实验重复3次，结果取平均值±标准差。

结果如表2中所示，可以看出，二甲双胍能够显著抑制卵巢癌顺铂耐药细胞系细胞生长，细胞耐药性保持良好。

表2：二甲双胍对ov2008/ddp(ci3k)和a2780/ddp(cp70)细胞系增殖的影响

实施例2、二甲双胍促进顺铂耐药卵巢癌细胞株凋亡

用annexinv/pi试剂盒(购自invitrogen公司)通过流式细胞仪检测，得到不同浓度二甲双胍处理(培养方法同实施例1中)后，结果如图2所示，可以看出，二甲双胍培养后卵巢癌耐药细胞系(c13k和cp70)凋亡发生的比例明显增高(右下象限)，且随二甲双胍浓度的增加而增高。

实施例3、二甲双胍改变顺铂耐药卵巢癌细胞的细胞周期

不同浓度二甲双胍培养卵巢癌耐药细胞株(c13k和cp70)24小时(培养方法同实施例1中)后，用流式细胞仪检测，结果如图1所示，可以看出，细胞周期g1期比例明显增加，表明细胞生长延缓。

实施例4、二甲双胍抑制顺铂耐药卵巢癌细胞体内生长，并逆转顺铂耐药

(1)建立裸鼠成瘤模型

①饲养条件及细胞系培养

实验选用4～6周龄的雌性balb/c裸鼠40只，北京维通利华实验动物技术有限公司提供(spf级，实验动物生产许可证号，scxk(京)2006-0008，体重为18～24g/只)。饲养由科澳协力饲养有限公司提供的spf级标准饲料(北京市实验动物质量合格证明编号，scxk(京)2005-0007)。实验期间所有动物置于同一室内，清洁级饲料饲养，由河南省九睿生物制药有限公司饲养，自由进食，饮水。

卵巢癌耐药细胞系c13k和cp70常规培养于37℃、5％co2、含10％胎牛血清的rpmi1640培养液中，并且培养液中加入0.2ng/ml顺铂维持其耐药性，隔夜更换细胞培养液。以上细胞系均为本实验室保存。

②动物实验药物

用pbs将水溶性药物二甲双胍配制为浓度10^-1m的二甲双胍储备液，4℃保存。

对照组给予等量的pbs做空白对照。

③实验方案

a)6～8周裸鼠40只，分别接种c13k或cp70，接种前测裸鼠体重。接种细胞密度5×10⁷/ml，接种前混匀，150μl细胞/裸鼠，接种于右侧腋下。

b)接种后随机分组，将移植瘤模型分为4组，从接种当天4组裸鼠分别给予：①对照组：100ulpbs/day，腹腔灌注；②二甲双胍组：250mg/kg/day，腹腔灌注；③顺铂组：从细胞接种第10天开始，200ug/kg/day，腹腔灌注，连续4天；④二甲双胍联合顺铂组：二甲双胍(250mg/kg/day，腹腔灌注)，顺铂(200ug/kg/day,腹腔灌注，从第10天开始，连续4天)。二甲双胍从接种细胞开始给药，30天后终止实验，裸鼠处死后，立即将肿瘤组织剥出。

④统计学方法

所有的数据都用均数±标准差表示，数据分析用spss13.0独立样本t检验，p<0.05视为有统计学意义。

(2)检测

①测量肿瘤大小

30天后终止试验，分别取出肿瘤组织，测量肿瘤的大小：计算肿瘤体积：v＝π/6(长×宽×高)，结果如图3所示，在卵巢癌耐药细胞系c13k或者cp70模型中二甲双胍组和联合用药组的肿瘤组织明显小于对照组(p<0.05)。

在连续给药的30天中，每3天检测小鼠的肿瘤体积，肿瘤体积的计算：体积＝1/2×肿瘤长径×短径²，实验重复3次，结果取平均值，结果如图4所示，可以看出，二甲双胍明显延缓了卵巢癌耐药细胞体内生长，二甲双胍联合顺铂组瘤体积明显小于顺铂组，表明二甲双胍可以抑制顺铂耐药卵巢癌细胞生长，并能逆转顺铂耐药卵巢癌细胞的耐药性(p<0.05)。

②检测瘤组织凋亡

30天后终止实验，分别取肿瘤组织，立即tunel法检测细胞凋亡情况。如图5所示，可以看出，在卵巢癌耐药细胞系c13k或者cp70模型中二甲双胍组和联合用药组的肿瘤组织凋亡率明显高于对照组，表明二甲双胍能够加速卵巢癌细胞的凋亡。