本发明属于复方中药领域，具体涉及一种含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂及其制备方法。
背景技术：
三氧的化学式为o3，具有刺鼻的怪味，又称为臭氧。三氧是一种天然氧化剂，高纯度三氧对各种细菌、病毒、真菌等都具有杀灭作用，具有“绿色”杀菌的特点。出处：臭氧治疗历史、现状与未来，目前在欧洲，三氧主要应用于腰椎间盘突出及骨关节疾病的治疗、创伤及难治性溃疡(如糖尿病足)的治疗、癌症的辅助治疗、抗自由基防衰老、中风及病毒性肝炎等疾病的治疗，其临床疗效得到了充分肯定。
紫草，学名lithospermumerythrorhizon是紫草科紫草属植物，多年生草本植物。李时珍的本草纲目(中册)记载紫草性寒，味甘、咸，归心，肝经，具有止血凉血之功效，用于治疗血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、热病斑疹、湿疹、尿血、血淋、血痢、热结便秘、疮疡、丹毒、烧伤、恶疮、癣等。
橄榄油主要成份是油酸，属于ω-9mufa，并含有较高含量的α-生育酚，鲨烯、植物甾醇和酚类化合物。橄榄油富含丰富的单不饱和脂肪酸、维生素a、维生素b、维生素d、维生素e、维生素k及各种抗氧化物等营养物质，对人体有着很好的保健和美容功效。紫草和橄榄油制备的紫草油具有创面修复和消炎作用，能加快组织的再生和愈合速度，刺激性小，止痛效果好。紫草油不管是单独用药亦或是联合用药、辅助治疗，临床上运用范围不断扩大，在轻度烫伤、烧伤，创面修复、儿童湿疹、皮炎、药疹等皮肤类疾病均有应用基础。【摘录】《上海交通大学学报(医学版)》。
白芷：本品为伞形科植物angelicadahurica(fisch.exhoffm.)benth.ethook.f.或杭白芷angelicadahurica(fisch.exhoffm.)benth.ethook.f.var.formosana(boiss.)shanetyuan的干燥根。中国药典一部2015版收载白芷质硬，断面白色，粉性足，皮部密布棕色油点。祛风湿，活血排脓，生肌止痛及美白除斑功效。广泛用于治疗银屑病、白癜风、鼻炎、头痛、牙痛、鼻渊、肠风痔漏、赤白带下、痈疽疮疡、皮肤瘙痒。时珍国医国药收载现代药理学证明白芷具有镇痛、抗炎、抗高血压、抗凝血、抗微生物、抗病毒、抗癌、抗氧化等多种药理活性，其镇痛、抗炎活性现被临床广泛用于治疗偏头痛、银屑病、白癜风、鼻炎等疾病。
丁香油酚：丁香油酚是苯丙类化合物。它是一种无色至淡黄色油状液体从特别是在丁香油，肉豆蔻，肉桂，罗勒和月桂叶某些精油提取。
蜂蜡：味甘，淡，性平，归脾、胃、大肠经。有解毒、敛疮，生肌，止痛的功效。用于溃疡不敛、臁疮糜烂，外伤破溃，烧烫伤。【摘录】《首都食品与医药》。
凡士林：凡士林是一种烷系烃或饱和烃类半液态的混合物，也叫矿脂，由石油分馏后制得。其状态在常温时介于固体及液体之间，因不同用途而有棕、黄、白三种颜色。熔点为35～50℃(一般37～52℃)。辅料手册第6版记载，凡士林作为局部外用制剂，认为无刺激、无毒材料。可以保湿、修护肌肤，缓解肌肤干燥及因干燥导致的各种肌肤问题。
磷脂：磷脂为两性分子，一端为亲水的含氮或磷的头，另一端为疏水(亲油)的长烃基链。由于此原因，磷脂分子亲水端相互靠近，疏水端相互靠近，常与蛋白质、糖脂、胆固醇等其他分子共同构成脂双分子层，即细胞膜的结构。是细胞中所有膜状构造的主要成分。辅料手册第6版记载，磷脂作为外用制剂辅料几乎没有急毒性。
薄荷油(脑)：是植物所产生的高挥发性精油，其成分多为半萜、单萜及倍半萜，尤其在气候温暖时产量更高。是由中药薄荷植物中提取、精制而成的芳香物，易溶于水、醇、醚等溶剂中，具有清凉、止痛的作用。【摘录】《浙江中西医结合杂志》。
中国专利cn106177452公开了复方紫草臭氧油制备与应用，其通过压榨方式获得了复方紫草油，通入三氧后得到三氧化紫草油，压榨的提取方式有效率低且未说明其压榨后有效成分含量情况。获得的油状搽剂粘度低，不利于涂敷及患处停留时间短，会产生涂抹不均及药效低，患者顺应性差等问题；使用过程中损耗大，极易污染瓶壁。且所使用中药材均需经过炒干、粉碎、发酵、蒸热、压榨、过滤、脱水、脱色多个处理步骤，其工艺过于繁琐、有效成份在制备处理过程中不可避免存在损耗。
技术实现要素：
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种可以收敛创面、促进愈合、有效抗真菌并具有护肤功效的含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂。该软膏剂释放药物较快，无油腻感，易涂展，无刺激性，能吸收组织渗出物。此外，该软膏剂与现有技术相比，透皮性能好，没有依赖性，副作用小，方便携带和涂抹，提高了患者的顺应性。
本发明的另一目的在于提供上述含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂的制备方法。本发明将含有三氧化紫草油的复方中药制备成软膏剂，可以克服以往剂型的不足，提高三氧及有效成分给药的使用便利性，同时满足不同适应症的对应治疗，可实现良好的临床效果。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂，由以下重量份数的组分组成：
三氧化紫草油20份，白芷0.3份，丁香油酚0.2份，蜂蜡1.1份，凡士林2.3份，磷脂0.1份，薄荷油0.01份，遮光剂0.08份。
所述的白芷是经过微粉化处理，d90在10μm以下。
所述的遮光剂选自二氧化钛和氧化锌的一种或几种，优选氧化锌。
所述的含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将紫草加入到橄榄油中，完全浸泡后过滤，即得紫草油；
(2)将制得的紫草油通入不同浓度的三氧，即得三氧化紫草油；
(3)按处方量称取蜂蜡、凡士林和磷脂加热至40-60℃后均质乳化至均匀，得软膏基质；
(4)将处方量丁香油酚和薄荷油加入步骤(3)制得的软膏基质中，保持温度并均质乳化至均匀；
(5)将处方量微粉化处理后的白芷与遮光剂混合均匀后加入到步骤(4)制得的软膏中，保持温度并均质乳化至均匀；
(6)将处方量三氧化紫草油加入到步骤(5)制得的软膏中，搅拌至均匀，冷却后即得含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂。
所述的软膏剂分装后密封，在凉暗干燥处保存(25℃以下)。
优选的，步骤(1)所述的紫草和橄榄油的重量比为2:5。
优选的，步骤(2)所述三氧的浓度为1000-3000mcg/kg紫草油。
优选的，步骤(5)所述的微粉化处理后的白芷d90在10μm以下。
上述含有三氧化紫草油的复方中药膏剂，其临床应用如下：
(1)用于杀灭细菌及病原微生物时，通入三氧浓度为1000mcg/kg；
(2)用于治疗神经性皮炎、营养不良性溃疡、创口表面、烧伤、蚊虫叮咬及美容等目的时，通入三氧浓度为2500-3000mcg/kg，建议三氧气体治疗后(如三氧负压杯)使用；
(3)用于各种粘膜疾病时(口腔、生殖器、直肠)三氧浓度为2000mcg/kg。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明所使用的中药复方成份清晰，副作用明确，合理规避。白芷含有的香豆素类化合物具有一定的光毒性，在外用时需要避光使用。针对白芷的光敏毒性，本发明在处方中添加少量的二氧化钛或氧化锌之类避光剂，极大程度上降低光敏毒性的发生概率，有效避免光毒性副作用，增加本品安全性同时提供了白芷作为外用制剂的可行性。
此外，现有技术中大多数采用有机溶剂提取白芷的有效成分，但其有效成分通常不能完全提取，影响其完整药效的发挥。对此，本发明采用现代微粉化技术，使白芷微粉化，能够使白芷均匀分散于软膏，减少涂敷过程的颗粒感，利于成型，同时增大白芷的比表面积，有利于有效成分的吸收，还避免了白芷提取物中有机溶剂残留产生的毒副作用。
(2)本发明采用蜂蜡、磷脂和凡士林作为软膏基质，制备的软膏剂具有良好的透皮性能，易于涂敷，刺激性小，便于携带，有多种临床使用作用。本发明的制备工艺中采用高速剪切乳化的磷脂作为乳化剂制备软膏剂，保证软膏剂具有良好的均匀性，同时磷脂可改善药物的亲脂性和亲水性，利用其良好的生物相容性，亲和皮肤作用，促进药物吸收。
(3)本发明处方中采用丁香油酚和薄荷油作为促渗剂，以期改善有效成分透皮吸收，在处方中发挥着促渗、治疗的双重功能。薄荷油亦可掩盖软膏剂的不良气味，提高患者的顺应性。相比现有技术中常用软膏剂的制备中习惯性添加氮酮等化学合成类透皮促进剂，本发明采用的中药透皮促进剂丁香油酚和薄荷油，具有几乎没有副作用且气味芳香的特点。
(4)现有软膏剂组成中多数需要添加抑菌剂，本发明中利用三氧自身的杀菌性能制备成软膏剂，使其不需要添加防腐剂，减少刺激性且安全性好。
而且本发明在最终步骤中加入三氧化紫草油，采用机械搅拌至均匀，可极大程度上避免前期的均质处理过程导致三氧的损失，保证了其有效的三氧浓度。
(5)本发明采用现代微粉化技术处理白芷，制备了含有白芷的中药复方软膏剂，确保有效成份的最大化，制备工艺简单可行，缩短生产周期，节约生产成本。本发明其他辅料价廉易得，制备工艺可控、重现性好，为三氧化紫草油的复方中药软膏剂制备提供了可行性，具有良好的市场和应用前景。
(6)本发明根据不同临床应用采用了不同三氧化的紫草油制备的软膏剂，用于杀灭细菌及病原微生物时，通入三氧浓度为1000mcg/kg；用于治疗神经性皮炎、营养不良性溃疡、创口表面、烧伤、蚊虫叮咬及美容等目的时，通入三氧浓度为2500-3000mcg/kg，建议三氧气体治疗后(如三氧负压杯)使用；用于口腔、生殖器、直肠等粘膜炎症时，通入三氧浓度为2000mcg/kg。
附图说明
图1为本发明含有三氧化紫草油的复方中药膏剂释放度对时间的曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。
实施例1：白芷微粉化
制备方法如下：将洗净的白芷用热风循环烘箱，设置烘干温度60℃，干燥1小时后采用中药打粉机粉碎后过80目筛网，将白芷粉末采用气流粉碎机粉碎，粉碎气压为0.3mpa，收集微粉化白芷。将微粉化白芷采用激光粒度仪测定粒径分布，结果如表1。
表1微粉化白芷粒径分布
实施例2
一种含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂的制备步骤：
(1)将紫草以重量比2:5加入到橄榄油中，完全浸泡后过滤，即得紫草油，量取500g通入500mcg的三氧，即得三氧化紫草油，备用；
(2)称取蜂蜡27.5g、凡士林57.5g、磷脂2.5g加热至60℃后，采用高速剪切均质机8000rpm均质乳化15min，得软膏基质；
(3)将处方量丁香油酚5g、薄荷油0.25g加入上述软膏基质中，在60℃下均质乳化(高速剪切均质机10000rpm均质乳化10min)；
(4)称取实施例1的微粉化白芷7.5g与二氧化钛2g混合均匀后加入到上步软膏中，在60℃下均质乳化(高速剪切均质机10000rpm均质乳化10min)；
(5)加入上述备用的三氧化紫草油500g，500rpm机械搅拌15min，室温冷却后即得含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂，按每瓶30g分装，密封后放置冰箱冷藏。
实施例3
一种含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂的制备步骤：
(1)量取实施例2的紫草油500g通入1000mcg的三氧，即得三氧化紫草油，备用；
(2)称取蜂蜡27.5g、凡士林57.5g、磷脂2.5g加热至60℃后，采用高速剪切均质机6000rpm均质乳化25min，得软膏基质；
(3)将处方量丁香油酚5g、薄荷油0.25g加入上述软膏基质中，在40℃下均质乳化(高速剪切均质机10000rpm均质乳化5min)；
(4)称取实施例1的微粉化白芷7.5g与二氧化钛2g混合均匀后加入到上步软膏中，在40℃下均质乳化(高速剪切均质机10000rpm均质乳化5min)；
(5)加入上述备用的三氧化紫草油500g，600rpm机械搅拌10min，室温冷却后即得含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂，按每瓶30g分装，密封后于凉暗干燥处保存。
实施例4
一种含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂的制备步骤：
(1)取实施例2的紫草油500g通入1500mcg的三氧，即得三氧化紫草油，备用；
(2)称取蜂蜡27.5g、凡士林57.5g、磷脂2.5g加热至60℃后，采用高速剪切均质机8000rpm均质乳化15min，得软膏基质；
(3)将处方量丁香油酚5g、薄荷油0.25g加入上述软膏基质中，在60℃下均质乳化(高速剪切均质机9000rpm均质乳化10min)；
(4)称取实施例1的微粉化白芷7.5g与氧化锌2g混合均匀后加入到上步软膏中，在60℃下均质乳化(高速剪切均质机9000rpm均质乳化5min)；
(5)加入上述备用的三氧化紫草油500g，400rpm机械搅拌10min，室温冷却后即得含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂，按每瓶30g分装，密封后放置于冰箱冷藏保存。
体外有效性验证实验
释放度实验：本实验采用半透膜法测定释放度，将实施例2制得的含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂准确称量0.5g，涂抹于pvdf膜上，放置于扩散池上，以12ml0.9％氯化钠溶液为释放介质，温度为37℃，转速为700rpm，经10、20、30、45、60min时，取溶液适量，离心5min(14000rpm)，取上清液为供试品溶液。在有效成分左旋紫草素的最大吸收波长242nm测定吸收度,绘制标准曲线，并按各时间点吸光度计算出溶液中药物释放量，最后绘制释放度对时间的曲线图，结果如图1所示。
实验结果表明所述含有三氧化紫草油的复方中药软膏在30min的释放度是89％＞85％，符合药剂学中快速释放的要求。
伤口愈合实验：
健康的km种小鼠49只，雌雄各半，18-20g，购于广东省实验动物中心。
统计方法：数据处理运用spss19.0统计软件，计量资料采用t检验及多因素方差分析的方法进行统计学处理，非正态分布的计量资料采用秩和检验，计数资料采用χ2检验，检验水平α＝0.05。
实验方法：
软膏剂的组成为三氧化紫草油、白芷、丁香油酚、蜂蜡、凡士林、磷脂、薄荷油、遮光剂，组成比例和制备方法见实施例1-4。
实验前24小时，每只小鼠剪去背部毛，然后用40℃温热的脱毛剂涂在小鼠背部脊柱两侧区，脱毛面积5×5cm左右，5～10分钟后用清水洗净，观察24小时，确定脱毛部位无红肿、炎症、破损等异常情况。小鼠用异戊巴比妥钠注射麻醉，置于操作台上，75％乙醇消毒实验区皮肤。另将盛有水的钢精锅置于电炉上，并将20g砝码(底面直径22mm)置于锅内一同加热至沸，维持10分钟后，用钳子夹住砝码上端，迅速放在小鼠皮肤上5秒，并稍加压力，形成烫伤面积约为3.8cm2浅ii度烫伤模型。烫伤后局部皮肤呈瓷白色，皮肤显皱缩，局部皮肤有溃破，正常区域与烫伤部位清晰可见，烫伤4小时内皮下组织水肿明显，而正常皮肤色泽均匀，表明自然完整。每只小鼠均未出现呼吸困难、喷嚏、精神异常、大小便失禁等反应。将小鼠随机分为空白组、阳性对照组、治疗组，每组20只。空白组给予生理盐水处理；阳性对照组给予涂抹美宝湿润烧伤膏(汕头市美宝制药有限公司产品，批准文号：国药准字z20000004)处理，在烫伤部位涂抹给药2ml；治疗组给予涂抹实施例4制备的含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂处理，在烫伤部位涂抹给药2ml。各组每日涂抹2次，早晚各1次，连续给药15天，单笼饲养。每日观察创面愈合时间和创面愈合率。创面愈合判断标准：创面结痂脱落，创面完全上皮化。分别与造模立即5、10、15天用游标卡尺测量创面直径或纵长与横长，按圆形或椭圆面积计算公式计算创面面积，创面愈合率＝(用药前面积-用药后面积)/用药前面积。记录第15天各组小鼠创面愈合数，计算各组动物创面平均愈合天数(15d未愈合者按15d)计算。实验结果如表2所示。
表2伤口愈合实验结果
*p＜0.05，治疗组愈合率较阳性对照组愈合率差异有统计学意义。
●p＜0.05，治疗组愈合率较空白组愈合率差异有统计学意义。
▲p＜0.05，治疗组愈合率较阳性对照组平均愈合时间差异有统计学意义。
■p＜0.05，治疗组愈合率较空白组平均愈合时间差异有统计学意义。
体外抗真菌实验:
含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂的组成：三氧化紫草油、白芷、丁香油酚、蜂蜡、凡士林、磷脂、薄荷油、遮光剂，组成比例和制备方法见实施例1-2；chinesemedicineointmentscontainingozonizationofarnebiaoil(cooa)。
菌种：白色念珠菌2株、新型隐球菌2株、絮状表皮癣菌2株、红色毛癣菌2株、石膏样毛癣菌2株，购于中国科学院微生物所。
培养基：rpmi-1640培养基、沙保培养基(sda)、酮康唑乳膏(西安杨森制药有限公司，国药准字h20043172)
实验方法
根据nccls推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释抗真菌药敏试验参考方案》(m-38p)，测定所述含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂对10株临床常见真菌的最低抑菌浓度值(mic)。
药基的制备：沙保培养基经高压灭菌，rpmi-1640培养基经滤菌处理，无菌操作将酮康唑软膏和含有三氧化紫草油的复方中药软膏分别用rpmi-1640培养基倍比稀释，终浓度分别为30、15、7、3.5、1.75、0.875、0.4375μg/ml。
菌悬液的制备：将受试验的菌种接种于沙保培养基(sda)上，26℃培养15d，吸取灭菌0.9％nacl溶液2ml，冲洗表面的菌丝和孢子，将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板计数，浓度1×105—5×105cfu/ml之间，用rpmi-1640培养基稀释50倍至2倍终浓度。
将100μl的2倍终浓度的药液由第1孔至第7孔分别由高浓度到低浓度加入无菌的96孔板中，第8个孔为生长对照孔(仅加真菌)，第9个孔为空白对照孔(仅加培养基)。将调好的菌接种液100μl加入相应的微孔内，使每一梯度的抗菌药物和菌接种液均分别被1：1稀释到终浓度。癣菌26℃孵育7天，读取结果。用酶标分析仪在620nm处测各孔od值，与阳性对照孔比，以od值下降80％以上的最低浓度孔中的药物浓度为mic值。实验结果如表3所示。
表3两种软膏对5种临床常见癣种的mic值(μg/ml)
以上实验结果表明：含有三氧化紫草油的复方中药软膏剂(cooa)对白色念珠菌、新型隐球菌、絮状表皮癣菌、红色毛癣菌均有很强的抗真菌作用。cooa对新型隐球菌和红色毛癣菌的作用强度优于酮康唑；对白色念珠菌的作用强度与酮康唑相当；对絮状表皮癣菌和石膏样毛癣菌的抑制作用强度弱于酮康唑。
临床应用
取实施例2的软膏剂均匀涂敷患处，用于杀灭细菌及病原微生物；取实施例3的软膏剂均匀涂敷患处用于治疗口腔、生殖器、直肠的粘膜疾病；取实施例4的软膏剂均匀涂敷于患处用于治疗神经性皮炎、营养不良性溃疡、创口表面、烧伤、蚊虫叮咬及美容。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。