本发明公开了一种祛除黄褐斑组合物及应用、复合制剂及该复合制剂的制备方法，适用于医药和化妆品领域。
背景技术：
黄褐斑是一种常见的面部色素沉着性疾病，是一种有色皮肤尤其是亚洲人高发的色斑，其致病的原因尚未完全阐明，其发病的机制主要包括色素沉着、血管反应性增强、血管微循环障碍、炎症反应及皮肤屏障功能受损等。针对黄褐斑的分型，何黎等提出了血管型(v)、色素型(m)、混合型的分类，混合型黄褐斑又包括色素优势型(m＞v)及血管优势型(v＞m)。
根据黄褐斑的分型，针对色素型黄褐斑，目前常用的外复合制剂主要从抑制酪氨酸酶活性和黑色素细胞活性来解决色素沉着问题，如氢醌、壬二酸等,化学合成原料具有一定的刺激性及细胞毒性；针对血管型黄褐斑，主要通过改善血管微循环联合抗炎处理，报道较多的改善血管微循环的包括三七、丹参等，效果较为单一；针对混合型，现有技术也体现了多种机制配合使用的制剂，列举如下：
现有技术1：侯伟、黄晓凤等人的《淡斑美白精华液改善黄褐斑的临床观察》中使用经典美白成分熊果苷抑制酪氨酸酶活性，淡化并减少黑素形成；三七皂苷改善血管微循环；烟酰胺减少黑素小体转移，提高角质层蛋白含量；马齿苋进行抗炎、抗过敏。本论文未明确指出其辅助性治疗的是哪种分型的黄褐斑症状。
现有技术2：专利申请号为201510559435.4,名称为一种含滇山茶叶提取物的复合美白组合物、制剂及其制备方法的发明专利申请中使用滇山茶叶提取物、构树提取物和火棘果提取物等作为活性成分进行美白祛斑、美化肌肤，但是其只突出了美白，而未从根本上缓解和长效治疗黄褐斑。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供祛除黄褐斑组合物，其用烟酰胺抑制黑色素形成，凝血酸抑制黑色素聚集并在抑制血管扩张的同时进行抗炎，用滇山茶花醇提取物抑制黑色素形成并在抑制组胺的释放的同时进行缓解刺激，用三七总皂苷改善血管微循环，提高皮肤耐受性，四种成分进行合理配比后，可以很好地缓解或长效治疗色素型及色素优势型(m＞v)黄褐斑，同时四种成分可以在所使用溶剂中有效共溶。本发明还提供了该组合物在面膜或膏霜中的应用。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供祛除黄褐斑复合制剂，其添加的祛除黄褐斑组合物能够实现烟酰胺、凝血酸、三七总皂苷和滇山茶花醇提取物的有效共溶，从而共同作用缓解或长效治疗色素型及色素优势型(m＞v)黄褐斑，从治疗效果而言，明显优于现有技术，而且安全温和无刺激性，保证过敏体质患者也能使用，同时该复合制剂稳定性好，在室温条件下保存时，不会发生分相。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种祛除黄褐斑复合制剂的制备方法。
本发明提供的一种技术方案为：一种祛除黄褐斑组合物，按照质量份数包括40～48份烟酰胺、15.5～18.6份凝血酸、1.0～1.2份滇山茶花醇提取物和1.0～1.2份三七总皂苷，以及用于同时溶解烟酰胺、凝血酸、滇山茶花醇提取物和三七总皂苷的溶剂。
进一步的，该祛除黄褐斑组合物中烟酰胺、凝血酸、滇山茶花醇提取物和三七总皂苷的质量之比为40:15.5:1：1。
本发明提供的另外一种技术方案是：一种祛除黄褐斑复合制剂，包括水相物料、油相物料、祛除黄褐斑组合物以及低温物料，祛除黄褐斑组合物，按照质量份数包括40～48份烟酰胺、15.5～18.6份凝血酸、1.0～1.2份滇山茶花醇提取物和1.0～1.2份三七总皂苷，以及用于同时溶解烟酰胺、凝血酸、滇山茶花醇提取物和三七总皂苷的溶剂。
进一步的，按照各组分在该祛除黄褐斑复合制剂中的质量份数；
所述水相物料包括0.15～0.2份丙烯酸(酯)类/c10-30醇丙烯酸酯交联聚合物、1.5～2.0份聚二甲基硅氧烷、42～80份去离子水、3.0～3.5份甘油、0.05～0.1份黄原胶和0.05～0.1份卡波姆；
所述油相物料包括1.0～2.0份鲸蜡硬脂醇聚醚-25、0.5～1.0份异硬脂醇、0.5～1.0份鲸蜡硬脂醇、0.5～1.0份油菜甾醇类、2.0～3.0份异硬脂醇异硬脂酸酯和0.01～0.02份青刺果油；
所述低温物料包括0.5～0.7份苯氧乙醇、0.2～0.5份1,2-己二醇和0.08～0.12份氨甲基丙醇；
以及5.75-6.90份所述祛除黄褐斑组合物。
本发明提供的另外一种技术方案是：祛除黄褐斑复合制剂的制备方法，包括乳化步骤和加入低温物料步骤；
乳化步骤中，在65～70℃下，通过搅拌使部分水相物料与全部油相物料混合后，再加入余量的水相物料，并在真空条件下进行均质搅拌，得到用于溶解低温物料所需的乳液；
低温物料加入步骤中，将祛除黄褐斑组合物及低温物料依次加入所述乳液；
祛除黄褐斑组合物，按照质量份数包括40～48份烟酰胺、15.5～18.6份凝血酸、1.0～1.2份滇山茶花醇提取物和1.0～1.2份三七总皂苷，以及用于同时溶解烟酰胺、凝血酸、滇山茶花醇提取物和三七总皂苷的溶剂。
进一步的，所述水相物料是通过下列步骤配制的：
第一预混料配制步骤：用聚二甲基硅氧烷润湿分散丙烯酸(酯)类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物至均相，得到第一预混料；
第二预混料配制步骤：用甘油润湿分散黄原胶至均相，得到第二预混料；
水相物料配制步骤：使卡波姆在去离子水中溶胀，并通过搅拌使卡波姆溶解在去离子水中后，在去离子水中投入第一预混料并继续搅拌直至均相，然后在80～85℃下加入第二预混料，并继续搅拌直至均相，得到所述水相物料；
所述油相物料是通过下列步骤配制的：
第三预混料配制步骤：在80-85℃下用异硬脂醇异硬脂酸酯和异硬脂醇的混合液，溶解油菜甾醇类，直至均相得到第三预混料；
油相物料配料步骤：将鲸蜡硬脂醇加入鲸蜡硬脂醇聚醚-25后，在75-80℃下向鲸蜡硬脂醇聚醚-25中加入第三预混料及青刺果油，并搅拌直至均相，得到所述油相物料；
所述加入低温物料步骤包括下列步骤：
在40～45℃下，向所述乳液中，依次加入祛除黄褐斑组合物、苯氧乙醇、1,2-己二醇，并搅拌直至均相；
中和步骤：向所述乳液中加入氨甲基丙醇对所述乳液进行中和，使所述乳液的ph值在5.0-7.0之间。
再进一步的，经过氨甲基丙醇中和的所述乳液过200目筛网，得到祛除黄褐斑复合制剂。
祛除黄褐斑组合物在制备面膜或膏霜中的应用。
本发明的祛除黄褐斑组合物的技术方案，按照质量份数按照质量份数包括40～48份烟酰胺、15.5～18.6份凝血酸、1.0～1.2份滇山茶花醇提取物、1.0～1.2份三七总皂苷，以及用于同时溶解烟酰胺、凝血酸、滇山茶花醇提取物和三七总皂苷的溶剂。其技术效果是：其通过四种成分进行合理配比后，可以很好地缓解或长效治疗色素型及色素优势型(m＞v)黄褐斑。相应地，本发明祛除黄褐斑复合制剂也能实现上述技术效果。本发明还提供了祛除黄褐斑复合制剂的制备方法，以及祛除黄褐斑组合物在面膜或膏霜中的应用。
具体实施方式
本发明的发明人为了能更好地对本发明的技术方案进行理解，下面通过具体地实施例进行详细地说明：
本发明的祛除黄褐斑组合物，按照质量份数包括40～48份烟酰胺、15.5～18.6份凝血酸、1.0～1.2份滇山茶花醇提取物、1.0～1.2份三七总皂苷，以及用于同时溶解烟酰胺、凝血酸、滇山茶花提取物和三七总皂苷的溶剂，溶剂为水或1,3-丁二醇。烟酰胺、凝血酸、滇山茶花醇提取物、三七总皂苷在溶剂中的浓度为饱和浓度。其用烟酰胺抑制黑色素形成，凝血酸抑制黑色素聚集并在抑制血管扩张的同时进行抗炎，用滇山茶花醇提取物抑制黑色素形成并在抑制组胺的释放的同时进行抗炎抗刺激，用三七总皂苷改善血管微循环，四种成分进行合理配比后，可以很好地缓解或长效治疗色素型及色素优势型(m＞v)黄褐斑。同时因为没有刺激性成分，因此也适合过敏体质患者的使用。
本发明的祛除黄褐斑组合物中，烟酰胺、凝血酸、滇山茶花醇提取物和三七总皂苷的最佳质量之比为40:15.5:1：1。
该祛除黄褐斑复合制剂是由水相物料、油相物料、祛除黄褐斑组合物以及低温物料组成的。
按照各组分在该祛除黄褐斑复合制剂中的质量份数；
所述水相物料包括0.15～0.2份丙烯酸(酯)类/c10-30醇丙烯酸酯交联聚合物、1.5～2.0份聚二甲基硅氧烷、42～80份去离子水、3.0～3.5份甘油、0.05～0.1份黄原胶和0.05～0.1份卡波姆；
所述油相物料包括1.0～2.0份鲸蜡硬脂醇聚醚-25；0.5～1.0份异硬脂醇；0.5～1.0份鲸蜡硬脂醇；0.5～1.0份油菜甾醇类和2.0～3.0份异硬脂醇异硬脂酸酯；0.01～0.02份青刺果油；
该祛除黄褐斑复合制剂中包括5.75-6.90份祛除黄褐斑组合物。
所述低温物料包括0.5～0.7份苯氧乙醇、0.2～0.5份1,2-己二醇和0.08～0.12份氨甲基丙醇。
其中苯氧乙醇、1,2-己二醇和氨甲基丙醇等都对由水相物料和油相物料配制而成的乳液起到了稳定的作用，保证该祛除黄褐斑复合制剂的稳定性，保证复合制剂在室温条件下保存时，不会发生分相。
该祛除黄褐斑复合制剂的制备方法，包括下列步骤：
第一预混料配制步骤：用聚二甲基硅氧烷润湿分散丙烯酸(酯)类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物至均相，得到第一预混料；
第二预混料配制步骤：用甘油润湿分散黄原胶至均相，得到第二预混料；
水相物料配制步骤：在室温下，使卡波姆在去离子水中溶胀，并通过搅拌使卡波姆溶解在去离子水中后，在去离子水中投入第一预混料并继续搅拌直至均相，然后在80～85℃下加入第二预混料，并继续搅拌直至均相，得到所述水相物料；
所述油相物料是通过下列步骤配制的：
第三预混料配制步骤：在80-85℃下用异硬脂醇异硬脂酸酯和异硬脂醇的混合液，溶解油菜甾醇类，直至均相得到第三预混料；
油相物料配料步骤：将鲸蜡硬脂醇加入鲸蜡硬脂醇聚醚-25后，在75-80℃下向鲸蜡硬脂醇聚醚-25中加入第三预混料及青刺果油，并搅拌直至均相，得到所述油相物料；
乳化制步骤：通过搅拌使50％.vol～60％.vol的水相物料与全部油相物料混合后，再加入余量的水相物料，并在真空条件下进行均质搅拌，得到用于溶解低温物料所需的乳液；
所述加入低温物料步骤包括下列步骤：
在40～45℃下，向所述乳液中，依次加入祛除黄褐斑的组合物、苯氧乙醇、1,2-己二醇，并搅拌直至均相；
中和步骤：向所述乳液中加入氨甲基丙醇对所述乳液进行中和，使所述乳液的ph值在5.0-7.0之间。
下面通过若干实施例进行说明，各组分在实施例1～实施例5中的含量如表1所示：实施例1～实施例5中所有物料总的质量分数为100份。
上述原料中：去离子水采用和泰公司的型号为dw100的去离子水制备仪器制备；卡波姆选用lubrizol公司生产，商品名为carbopolultrez30polymer；甘油选用p&gchemical公司生产，商品名为moonkglycerin；黄原胶由罗地亚公司生产,商品名为rhodicareh；聚二甲基硅氧烷由道康宁公司生产，商品名为pm×200-350cst；异硬脂醇由禾大公司生产；鲸蜡硬脂醇和鲸蜡硬脂醇聚醚-25由宝洁公司生产；异硬脂醇异硬脂酸酯由公司生产；油菜甾醇类由basf公司生产；氨甲基丙醇由dow公司生产；苯氧乙醇由舒美公司生产，商品名为s&mpheno×yethanol；1,2-己二醇由德之馨公司生产，祛除黄褐斑组合物由申请人自制。
表1祛除黄褐斑组合物实施例1～5的组成
稳定性考察测试：
祛除黄褐斑组合物稳定性
表2祛除黄褐斑组合物稳定性
对祛除黄褐斑组合物进行稳定性测试，测试时间为120天，测试条件为25℃、-15℃、49℃。
测试结果显示：本发明的一种祛除黄褐斑组合物具有良好的稳定性。
祛除黄褐斑复合制剂稳定性
表3祛除黄褐斑复合制剂实施例1～5的稳定性
对祛除黄褐斑复合制剂的实施例1-5的进行稳定性考察测试，依次在-15℃，5℃，40℃、49℃和光照条件下，分别测试30天，60天及90天，观察祛除黄褐斑复合制剂的分相情况，观测结果如表2所示：
表2中，实施例1-5的祛除黄褐斑复合制剂在25℃，40℃的条件下，90天均未发生分相；在49℃的条件下，30天的稳定性测试结果均通过，60天未发生分相，在光照条件下，15天的未发生分相。
功效性评价：
抑制酪氨酸酶活性实验1
为验证组合物的酪氨酸酶抑制功效，将试验分为3组。
试验组：烟酰胺、凝血酸、滇山茶花醇提取物、三七总皂苷质量配比为40:15.5:1：1，并在溶剂，即去离子水中实现饱和浓度的共溶；
对照组1：100％三七总皂苷；
对照组2：烟酰胺、凝血酸、滇山茶花醇提取物配比为40:15.5:1；
阳性对照组：100％熊果苷；
阴性对照组:正常培养的b16细胞；
实验方法：
1.细胞增殖率的测定(cck8法)
培养小鼠黑色素瘤b16细胞，待细胞生长到对数期，用0.25％胰酶消化，调整细胞浓度为5×105个/ml，接种于96孔板中，每孔100ul。置于培养箱中培养24h后，弃上清液，添加含药培养基，样品终浓度分别为300、150、75ul/ml，对照组不加药物，代之以相应的溶媒。孵育72h后，弃上清液，用pbs洗涤2次，加入100ul/孔新鲜培养基和10ul/孔cck-8溶液，放回细胞培养箱中，1小时后，测量a450。每组3个复孔，实验重复3次。
细胞增殖率％＝(药物组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100。
2.细胞内酪氨酸酶活力测定
培养小鼠黑色素瘤b16细胞，待细胞生长到对数期，用0.25％胰酶消化，调整细胞浓度为5×105个/ml，接种于24孔板中，每孔1ml。置于培养箱中培养24h后，弃上清液，添加含药培养基，样品终浓度分别为10ul/ml、5ul/ml；药物作用3天后，弃去上清液，用ph7.0的pbs冲洗两遍，每孔加180ul含1％triton×-100的pbs。冰浴中超声破碎震荡5min溶解细胞，经37℃预温后每孔加入2mg/ml的l-dopa20ul，37℃孵育60min，将反应溶液吸入96孔板中，100ul/孔，每个标本2复孔，测量450nm各孔吸光度值。
酪氨酸酶合成抑制率％＝(1一药物组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100。
实验结果如表4、表5所示：
表4细胞增殖率(％)
表5酪氨酸酶合成抑制率(％)
上述测试结果表明：本发明的一种祛除黄褐斑的组合物具有很好的安全性，表4中实验组及熊果苷的数据表明，本发明组合物的细胞毒性明显优于现有技术中广泛使用的熊果苷。同时表5中对照组1及对照组2的数据表明，本发明的组合物效果明显。对照组1本身不具备抑制酪氨酸酶的活性，甚至呈现相反的效果，而按照本组合物的比例互溶后组合物的效果明显优于对照组2。因此，本发明不仅仅是单纯地按照功效将几种活性物的进行叠加，是经过科学的配伍筛选而来。同时表5中，试验组与熊果苷组随浓度的增高酪氨酸酶抑制率均升高，但结合表4熊果苷浓度升高后细胞增值率的下降，有可能熊果苷高浓度的酪氨酸酶抑制效果是通过杀死一部分细胞得来的。因此，本发明的一种祛除黄褐斑的组合物抑制酪氨酸酶活性的效果明显优于现有技术中广泛使用的熊果苷。
抑制酪氨酸酶活性实验2
为验证本发明的组合物优于现有技术1(发明人前期技术)提到的活性物组合，通过与淡斑美白精华液涉及到组合物进行细胞实验安全性及功效性的比较。
试验组：烟酰胺、凝血酸、滇山茶花醇提取物、三七总皂苷质量配比为40:15.5:1：1，并在溶剂，即去离子水中实现饱和浓度的共溶；
对照组：熊果苷、烟酰胺、三七总皂苷、马齿苋提取物配比为:5:3:0.10:0.012
阳性对照组：100％熊果苷；
阴性对照组:正常培养的b16细胞；
实验方法：
1.细胞增殖率的测定(cck8法)
培养小鼠黑色素瘤b16细胞，待细胞生长到对数期，用0.25％胰酶消化，调整细胞浓度为5×105个/ml，接种于96孔板中，每孔100ul。置于培养箱中培养24h后，弃上清液，添加含药培养基，样品终浓度分别为300、150、75ul/ml，对照组不加药物，代之以相应的溶媒。孵育72h后，弃上清液，用pbs洗涤2次，加入100ul/孔新鲜培养基和10ul/孔cck-8溶液，放回细胞培养箱中，1小时后，测量a450。每组3个复孔，实验重复3次。
细胞增殖率％＝(药物组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100。
2.细胞内酪氨酸酶活力测定
培养小鼠黑色素瘤b16细胞，待细胞生长到对数期，用0.25％胰酶消化，调整细胞浓度为5×105个/ml，接种于24孔板中，每孔1ml。置于培养箱中培养24h后，弃上清液，添加含药培养基，样品终浓度分别为10ul/ml、5ul/ml；药物作用3天后，弃去上清液，用ph7.0的pbs冲洗两遍，每孔加180ul含1％tritonx-100的pbs。冰浴中超声破碎震荡5min溶解细胞，经37℃预温后每孔加入2mg/ml的l-dopa20ul，37℃孵育60min，将反应溶液吸入96孔板中，100ul/孔，每个标本2复孔，测量450nm各孔吸光度值。
酪氨酸酶合成抑制率％＝(1一药物组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100。
实验结果如表6、表7所示：
表6细胞增殖率(％)
表7酪氨酸酶合成抑制率(％)
上述测试结果表述：表6的试验数据再次表明本发明的一种祛除黄褐斑的组合物具有很好的安全性，本发明组合物的细胞毒性明显优于现有技术中广泛使用的熊果苷。同时表6的实验数据表明，本发明的一种祛除黄褐斑的组合物细胞毒性优于现有技术1提到的活性物组合，即安全性要更好。表6的试验数据表明，本发明的一种祛除黄褐斑的组合物功效优于现有技术1涉及的活性物组合，同时通过对照组与熊果苷的对比验证了高浓度的熊果苷对于酪氨酸酶的抑制来自于一部分b16细胞的死亡。因此，本发明的一种祛除黄褐斑的组合物具有良好的安全性和功效性，且效果明显优于现有技术。
临床祛斑评价实验：
针对色素型(m型)、色素优势型(m＞v型)黄褐斑的人群进行临床观察试验，试验设计如下：
黄褐斑入组情况：色素型(m型)5个志愿者，色素优势型(m＞v型)5个志愿者。每个患者左右脸颊分别使用实施例1或对照药物氢醌，每个患者在入组时及治疗2个月后分别利用皮肤生理功能测试仪及分光测色仪，评价使用前后皮损部位皮肤生理功能及皮肤颜色的变化。
临床观察试验结果如下：
表8黄褐斑色素型(m)观察结果
*表示p＜0.05
色素型患者(m)治疗2月后，与治疗前相比，实施例1及氢醌组均可显著增加皮肤水分(p＜0.05)；实施例1可显著减少患者的水流失并降低皮肤ph值(p＜0.05)，氢醌组水流失及ph值没有统计学差异(p＞0.05)。分光测色检测结果显示：实施例1及氢醌组使用后皮损的亮度均有显著提高(p＜0.05)且实施例1效果优于氢醌。实施例1可降低皮肤黄色值，但无统计学差异(p＞0.05)而氢醌组皮肤黄色值显著降低(p＜0.05)，这与氢醌具有显著的美白效果有关，但氢醌亦会引起皮肤刺激及接触性皮炎。
色素优势型患者(m＞v)治疗2月后，与治疗前相比，实施例1可显著减少患者的水流失(p＜0.05)，氢醌组则没有统计学差异(p＞0.05)。分光测色检测结果显示实施例1及氢醌组使用后皮损的亮度均有显著提高(p＜0.05)，且实施例1效果优于氢醌组，实施例1及氢醌组使用后皮肤黄色值均显著降低(p＜0.05)，差异有统计学意义。
表9黄褐斑色素型(m)观察结果
*表示p＜0.05
因此，本发明的祛除黄褐斑复合制剂可减退色素型及色素优势型黄褐斑患者色斑、提亮肤色，并可同时改善患者皮肤的生理功能，其效果几乎优于传统药物氢醌，可以很好的应用于祛斑市场，减少激素类药物的使用，更加安全温和。
本发明的祛除黄褐斑组合物还可用于面膜和膏霜等。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。