龙眼叶提取物及其制备方法与应用与流程

本发明涉及植物提取物的制备及应用技术领域，具体涉及龙眼叶提取物及其制备方法，还涉及龙眼叶提取物的应用。

背景技术：

随着人们生活水平的不断提高以及饮食结构的变化，糖尿病患者逐年增多，糖尿病已经成为继心血管疾病和肿瘤后威胁人类的“第三号杀手”，所以预防和治疗糖尿病已成为全球性的问题。糖尿病是一种以高血糖为主要特征的代谢紊乱性疾病，其发病过程中最先出现的症状一般是餐后高血糖，即糖尿病的早期征兆，尤其是ⅱ型糖尿病病人，餐后高血糖不仅极易诱发各种并发症，还会极大的提高糖尿病的死亡率。因此，降低餐后血糖是预防糖尿病、减少并发症和降低死亡率的重要举措之一。血糖主要来源于食物中的糖类和碳水化合物，其在α-葡萄糖苷酶的作用下被催化水解成单糖，可被小肠吸收。α-葡萄糖苷酶是糖代谢过程中的关键酶，控制α-葡萄糖苷酶的作用能有效阻止食物中的糖类和碳水化合物转化成单糖而被吸收，进而降低血糖水平。α-葡萄糖苷酶抑制剂主要通过抑制α-葡萄糖苷酶活性，延缓葡萄糖在体内的吸收，降低血糖。因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂是目前用于临床的口服降糖药，目前临床上的此类药物有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。现有的α-葡萄糖苷酶抑制剂种类较少，并存在一定的胃肠道不良反应，甚至会引起某些严重的副作用，因此，更安全有效的天然α-葡萄糖苷酶抑制剂有待研究开发。

龙眼叶，是一味具有广西民族特色的中药材，最早记载于《滇南本草图说》。为著名的亚热带水果--龙眼(dimocarpuslonganlour.)树的叶子或嫩芽。其性味甘、淡、平，具有发表清热、利湿解毒等主要功效。主要用于治疗感冒发热、疟疾、疔疮、湿疹等。龙眼原产于我国南部和越南北部的南亚热带区域，在我国已有2000多年栽培历史。我国龙眼栽培面积和产量均居世界首位。我国南方龙眼叶资源蕴藏量丰富，每年龙眼被摘之后，果农对树木进行截枝，大量的树叶被抛弃或燃烧，造成资源浪费和环境污染。龙眼叶主要含有鞣质、酚酸类、黄酮类及挥发油等成分。虽然已有研究表明，龙眼叶具有明显的降血糖，抗氧化等药理作用，但国内外关于龙眼叶降血糖作用的研究报道较少，发明曾对其降糖作用进行过研究。目前国内对龙眼叶的研究报道不多，主要集中在黄酮类成分的提取方面，未见针对其降血糖有效部位或提取物进行提取分离方法。因此，如何将龙眼叶中发挥降血糖作用的活性成分提取出来，以充分利用我国丰富的龙眼叶资源，研究开发出更多的天然α-葡萄糖苷酶抑制剂，是需要认真解决的技术问题。

以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种从龙眼叶中提取制备具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的提取物及其制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种龙眼叶提取物，该提取物具有抑制α-葡萄糖苷酶活性。

进一步的，以上所述的龙眼叶提取物，为龙眼叶经粉碎后用乙醇超声提取，乙醇提取液减压回收乙醇后浓缩成浸膏，加水将浸膏混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取得到的乙酸乙酯提取物；及用乙酸乙酯萃取后，再用正丁醇萃取得到的正丁醇提取物。

更进一步的，以上所述的龙眼叶提取物，最佳优选为乙酸乙酯提取物。

更进一步的，以上所述的龙眼叶提取物，所述乙醇浓度为50％乙醇至无水乙醇。

一种以上所述的龙眼叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

s1.取干燥龙眼叶，粉碎后用乙醇超声提取，提取液减压回收乙醇后得浸膏；

s2.将浸膏加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取液；

s3.将乙酸乙酯萃取液回收溶剂，得到乙酸乙酯提取物。

以上所述的龙眼叶提取物的制备方法，还包括以下步骤：

s4.步骤s2中“依次用石油醚、乙酸乙酯萃取”后留下的水层，再用正丁醇萃取，得正丁醇萃取液；

s5.将正丁醇萃取液回收溶剂，得到正丁醇提取物。

进一步的，以上所述的龙眼叶提取物的制备方法，步骤s1项下所述乙醇浓度为50％乙醇至无水乙醇。

更进一步的，以上所述的龙眼叶提取物的制备方法，步骤s1项下用乙醇超声提取为依次用95％乙醇、50％乙醇超声提取。

以上所述的龙眼叶在降血糖方面的应用，所述乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物在制备预防或治疗糖尿病的保健品或药物方面的应用。

以上所述的龙眼叶在降血糖方面的应用，所述乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物在制备具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的保健品或药物方面的应用。

本发明的有益效果在于：

1、本发明所用的原材料为龙眼的叶或嫩芽，现有技术中大量的龙眼叶被废弃或燃烧，造成资源浪费和环境污染，本发明变废为宝，原材料来源丰富，价格低廉。

2、本发明通过现代化提取分离方法，结合大量药理实验筛选，优选得到具有很好的抑制α-葡萄糖苷酶活性的提取物，该提取物活性强，药效好，质量安全可控。

3、本发明提供的具有抑α-葡萄糖苷酶活性的龙眼叶提取物可制备成药物或保健品，能方便临床应用。同时本发明提供的龙眼叶提取物的制备方法，操作简单易行，制备所得提取收率高，可操作性强，适合工业化大生产。

附图说明

图1为pnp标准曲线。

图2为不同提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性比较。

图3为不同提取物浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，但不限制本发明的保护范围和应用范围：一、龙眼叶提取物的制备

实施例1

龙眼叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

s1.取干燥龙眼叶10kg，粉碎后依次用95％乙醇和50％乙醇超声提取，过滤，合并提取液，减压回收乙醇后浓缩成浸膏；

s2.取浸膏加水混悬，依次用石油醚(60-90℃)、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，最后剩下水液，得各溶剂相应提取液；

s3.分别取各部位提取液，减压回收溶剂，浓缩，干燥，得到龙眼叶石油醚提取物，龙眼叶乙酸乙酯提取物，龙眼叶正丁醇提取物，龙眼叶水提取物。

实施例2

龙眼叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

s1.取干燥龙眼叶10kg，粉碎后用无水乙醇超声提取，提取液减压回收乙醇后得浸膏；

s2.取乙醇浸膏加水混悬，依次用石油醚(60-90℃)、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，得乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液；

s3.分别取乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液减压回收溶剂，浓缩，干燥，得到龙眼叶乙酸乙酯提取物，龙眼叶正丁醇提取物。

实施例3

龙眼叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

s1.取干燥龙眼叶10kg，粉碎后用75％乙醇超声提取，过滤，提取液减压回收乙醇后得浸膏；

s2.取浸膏加水混悬，依次用石油醚(30-60℃)、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，得乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液；

s3.分别取乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液减压回收溶剂，浓缩，干燥，得到龙眼叶乙酸乙酯提取物，龙眼叶正丁醇提取物。

实施例4

龙眼叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

s1.取干燥龙眼叶10kg，粉碎后用50％乙醇超声提取，过滤，提取液减压回收乙醇后得浸膏；

s2.取浸膏加水混悬，依次用石油醚(90-120℃)、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，得乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液；

s3.分别取乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液减压回收溶剂，浓缩，干燥，得到龙眼叶乙酸乙酯提取物，龙眼叶正丁醇提取物。

实施例5

龙眼叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

s1.取干燥龙眼叶10kg，粉碎后用40％乙醇超声提取，过滤，提取液减压回收乙醇后得浸膏；

s2.取浸膏加水混悬，依次用石油醚(60-90℃)、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，得乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液；

s3.分别取乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液减压回收溶剂，浓缩，干燥，得到龙眼叶乙酸乙酯提取物，龙眼叶正丁醇提取物。

二、龙眼叶抑制α-葡萄糖苷酶活性提取物的筛选研究实验

1仪器与材料

infinitem200pro酶标仪；lrh-250-s恒温恒湿培养箱(韶关市泰宏医疗器械有限公司)；kq-500da超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；hws-24电热恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司)；bsa224s电子天平；96微孔板；各种移液器及枪头；α-葡萄糖苷酶(g5003-100unsigma公司，批号slbs9070)；对硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg，sigma公司，批号bcbr9743v)；对硝基苯酚(pnp，天津市大茂化学试剂厂，批号：20170301)；还原型谷胱甘肽(gsh，sigma公司，批号213e053)；阿卡波糖(acarbose，拜耳公司，批号bj33686)；二甲亚砜(dmso)、无水碳酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾均为分析纯。

2方法

2.1样品

取本发明实施例1的龙眼叶石油醚提取物，龙眼叶乙酸乙酯提取物，龙眼叶正丁醇提取物，龙眼叶水提取物，作为样品。

2.2α-葡萄糖苷酶活性研究

将龙眼叶各提取物用dmso溶解，并储存于4℃冰箱中，活性检测在96微孔板上进行，反应体系如下：取ph6.8的磷酸钾缓冲液50μl，分别加入gsh10μl，样品10μl，0.57u/mlα-葡萄糖苷酶5μl，37℃恒温反应15min，加入浓度为20mmol/lpnpg20μl，37℃恒温反应15min，再加入浓度为0.2mol/l的naco3溶液40μl，于400nm波长下测定od值，每个样品平行测定5次。以阿卡波糖为阳性对照，按下式计算抑制率：

酶活性抑制率(％)＝[a空白-(a样品-a背景)]/a空白×100

注：a空白:无样品加入反应的吸光值；a样品:加入样品反应的吸光值；a背景:无酶液加入的吸光值。计算抑制率，并用spss22.0软件求出相应ic50值。

2.3标准曲线的绘制

根据采用的反应体系，用磷酸钾缓冲液(ph6.8)配置1000μmol/lpnp，分别稀释成400μmol/l、300μmol/l、200μmol/l、100μmol/l、80μmol/l、40μmol/l、20μmol/l、0μmol/l。分别取9种不同浓度的pnp溶液各160μl，加入0.2mol/lnaco3溶液80μl，混匀，在400nm波长下测定od值，测3组取平均值。以od值为纵坐标，pnp浓度为横坐标，做标准曲线。

3结果

3.1标准曲线的绘制

pnp标准工作曲线的回归方程为y＝0.0072x+0.0989，r²＝0.9995，说明pnp在0μmol/l～1000μmol/l与od值呈现良好的线性关系。结果见图1。

3.2龙眼叶不同提取物的活性比较

由表1可知，在同一浓度下(0.5mg/ml)，以阿卡波糖为阳性对照，α-葡萄糖苷酶抑制活性结果显示，龙眼叶乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物抑制率分别达到69.98％(ic50＝29.9mg/l)、67.02％(ic50＝41mg/l)，均高于阳性对照药阿卡波糖64.58％(ic50＝73.8mg/l)。龙眼叶不同极性提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性从大到小依次为乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>阿卡波糖>石油醚提取物>水提取物。结果见表1和图2。

表1不同提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性(n＝5)

3.3龙眼叶不同提取物不同质量浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

龙眼叶不同提取物不同质量浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响结果表明，4个不同提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性与浓度呈正量效关系，即剂量依赖性，抑制活性随浓度提高而增强，其中乙酸乙酯提取物的浓度在0.1～1mg/ml是呈直线增加，当浓度增加到一定时，浓度只有很小变化。在实验浓度范围内，阿卡波糖的抑制率也随浓度的增加而增加，而龙眼叶乙酸乙酯提取物及正丁醇提取物在此范围内抑制率均比阳性对照抑制率高。结果见表2和图3。

表2龙眼叶不同提取物不同浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响(n＝5)

通过实验可知，在龙眼叶的不同极性提取物中，乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性较强，均比阿卡波糖的抑制作用要强。

三、本发明实施例对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

在龙眼叶抑制α-葡萄糖苷酶活性提取物的筛选研究实验的基础上，对本发明实施例1-5所得的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性进行了比较研究。

1仪器与材料

同龙眼叶抑制α-葡萄糖苷酶活性提取物的筛选研究实验

2方法

2.1样品

取本发明实施例1-5的龙眼叶乙酸乙酯提取物，龙眼叶正丁醇提取物，作为样品。

2.2α-葡萄糖苷酶活性研究

同龙眼叶抑制α-葡萄糖苷酶活性提取物的筛选研究实验。

2.3标准曲线的绘制

同龙眼叶抑制α-葡萄糖苷酶活性提取物的筛选研究实验。

3结果

3.1标准曲线的绘制

见龙眼叶抑制α-葡萄糖苷酶活性提取物的筛选研究实验。

3.2实施例1-5中提取物的对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响比较

由表3可知，在同一浓度下(0.5mg/ml)，以阿卡波糖为阳性对照，α-葡萄糖苷酶抑制活性结果显示，实施例1-4的乙酸乙酯提取物抑制率分别达到69.98％(ic50＝29.9mg/l)、67.53％(ic50＝37.7mg/l)、68.18％(ic50＝30.3mg/l)、66.92％(ic50＝50.1mg/l)，均高于阳性对照药阿卡波糖64.58％(ic50＝73.8mg/l)，而实施例5的乙酸乙酯提取物抑制率为63.42％(ic50＝79.2mg/l)，低于阳性对照药阿卡波糖。结果见表3。

表3各实施例中乙酸乙酯提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性(n＝5)

由表4可知，在同一浓度下(0.5mg/ml)，以阿卡波糖为阳性对照，α-葡萄糖苷酶抑制活性结果显示，实施例1-4的正丁醇提取物抑制率分别达到67.02％(ic50＝41.0mg/l)、66.06％(ic50＝51.0mg/l)、66.87％(ic50＝44.5mg/l)、65.83％(ic50＝61.3mg/l)，均高于阳性对照药阿卡波糖64.58％(ic50＝73.8mg/l)，而实施例5的正丁醇提取物抑制率为62.15％(ic50＝85.3mg/l)，低于阳性对照药阿卡波糖。结果见表4。

表4各实施例中正丁醇提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性(n＝5)

由以上结果可知，本发明实施例1-4的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性均较强，均比阿卡波糖的抑制作用要强，而实施例5的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性均较低于阿卡波糖，说明40％乙醇提取的提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性均较低，而50％或以上乙醇提取的提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性均较高，故本发明选择50％或以上的乙醇提取。