一种狂犬病疫苗佐剂、疫苗组合物及其应用的制作方法

本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种狂犬病疫苗佐剂、疫苗组合物及其应用。

背景技术：

狂犬病是由狂犬病毒所致的急性传染病，人兽共患。临床表现为特有的恐水、怕风、咽肌痉挛、进行性瘫痪等，因恐水症状比较突出，故又名恐水症。目前，对于狂犬病还没有有效的治疗手段，人患狂犬病后的死亡率几近100％，接种狂犬病疫苗是在暴露于狂犬病毒后唯一的可行办法。然而，现阶段的商品化狂犬病疫苗都是灭活病毒疫苗，灭活病毒疫苗本身的免疫原性低，免疫周期长，制造成本高，疫苗价格昂贵等都成为了灭活狂犬病疫苗面临的难题。解决这一问题的最好办法就是疫苗佐剂。疫苗佐剂本身无抗原性，能非特异地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答，以及增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，添加疫苗佐剂能够使疫苗诱导机体产生更强的免疫应答，提高抗体滴度，增强细胞因子的分泌水平。

但是，在传统佐剂中，目前只有铝佐剂被应用于人用疫苗。但铝佐剂免疫机体主要诱导体液免疫应答，并不适用任何疫苗，免疫佐剂尤其是新型细胞免疫佐剂的研究就显得尤为迫切。目前有将肠毒素例如大肠杆菌来源的lt(cn1164191a；cn101560247a；cn103626878a等)或金黄色葡萄球菌来源的se(cn101297967a；靳彦文等，超抗原sea增强小鼠对hbvdna疫苗的免疫反应，《生物工程学报》，2005，21(5):681-685；苏文等，重组sea增强h5亚型禽流感灭活疫苗对肉鸡的免疫效果研究，《中国预防兽医学报》，2012，34(5):393-396；王丽婵等，重组金黄色葡萄球菌肠毒素a协同增强破伤风类毒素的免疫原性研究，《中国医药生物技术》，2013，8(3):188-191；周晓芬等，重组金黄色葡萄球菌肠毒素b对禽流感灭活苗的佐剂作用研究，《湖北农业科学》，2015(17):4245-4249)作为疫苗佐剂。然而，lt例如ltb虽可以用于口服，但对热不稳定，有文献报道，lt在68℃且30min的条件下会失活。在se中，由于sea、seb抗原反应较好，被用于佐剂的研究。然而，这两种肠毒素的毒性反应大，使其进一步的使用受到了限制。se家族中的sec、特别是sec2毒性反应小，但相对于研究较多的sea和seb，其免疫原性较差，故业内普遍认为其开发为佐剂的前景不佳。本申请人通过研究发现，当sec2与口蹄疫疫苗联合免疫小鼠时，可在被免疫小鼠血清中检测到较高的抗体效价水平(cn105983096a)，首次发现sec2可作为口蹄疫疫苗的佐剂，但机理未明，sec2作为佐剂的功效能否延及到其它疫苗尚不清楚。在本申请人随后的进一步研究中发现，其不确定性之一在于，sec2和疫苗本身药代、药效学方面的差异，因此sec2和疫苗未必能达到协同效果。

综上，开发具有更好免疫保护效果且低毒安全的用于狂犬病疫苗的新型佐剂，以及疫苗与佐剂联用的组合物具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是当前狂犬病疫苗免疫原性低、免疫周期长，辅以疫苗佐剂可提高免疫原性、缩短免疫周期，然而现有的疫苗佐剂如ltb不耐热、易失活且效果不佳，金黄色葡萄球菌来源的sea和seb毒性大。针对该问题，本发明提供了一种狂犬病疫苗佐剂，以及狂犬病疫苗与佐剂的疫苗组合物。

本发明通过以下技术方案解决了上述问题：

本发明采取的技术方案之一，提供了一种狂犬病疫苗佐剂，所述的狂犬病疫苗佐剂包含活性成分金黄色葡萄球菌肠毒素c2(sec2)。

术语“佐剂”是改变其他药剂功效的药学或免疫学试剂或组合物，在广义上是指自身不提供免疫，但能够增加共同施用的抗原的免疫原性的广谱物质。佐剂可以添加到疫苗中，通过增加免疫应答来增加抗体的数量和持久的保护，从而最大限度地减少注射的外来物质。佐剂也可用于提高疫苗的效力，通过帮助改变对特定类型的免疫系统细胞的免疫反应，例如，根据疫苗的目的，通过激活t细胞而不是分泌抗体的b细胞。因此，佐剂可以有利地调节细胞因子表达/分泌、抗原呈递、免疫应答的类型等。在本发明中，该术语的情形是指作为免疫原和/或其他药物活性化合物的载体或辅助物质的化合物或组合物。

其中上述“抗原”典型地是指可以由免疫系统识别并能够例如通过形成作为适应性免疫应答的一部分的抗体或抗原特异性t-细胞来触发抗原特异性免疫反应的物质。抗原根据性质分为两类：完全抗原和不完全抗原。完全抗原(completeantigen)简称抗原，是一类既有免疫原性，又有免疫反应性的物质，如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素和肠毒素等。不完全抗原即半抗原(hapten)是只具有免疫反应性，而无免疫原性的物质，如绝大多数多糖(如肺炎球菌的荚膜多糖)、荚膜多糖的水解产物和所有的类脂等。

在本发明一较佳实施例中，金黄色葡萄球菌肠毒素sec2作为唯一活性成分。当然也可以将sec2和其他促进狂犬病疫苗功效的佐剂活性成分合用，制成联合作用或复合活性成分的佐剂。其他佐剂活性成分可从现有各类佐剂中进行筛选：例如可以包括镇痛佐剂；无机化合物佐剂，例如氢氧化铝等；矿物油例如石蜡等；细菌抗原例如灭活的百日咳杆菌、牛分枝杆菌和类毒素等；非细菌性有机物例如角鲨烯等；传送系统例如洗涤剂(quila)等；来自皂树、大豆和远志等的植物皂苷；细胞因子例如il-1、il-2和il-12等；用于结合的弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等；食品基油例如佐剂65等。

本发明采取的技术方案之一，提供了sec2作为活性成分在制备狂犬病疫苗的佐剂中的应用。

较佳地，sec2作为唯一活性成分。

本发明采取的技术方案之一，提供了一种疫苗组合物，其包含狂犬病疫苗和sec2。

优选地，所述的狂犬病疫苗为减毒或灭活病毒疫苗；和/或，所述的sec2为sec2全长蛋白。

更优选地，所述狂犬病灭活病毒疫苗选用目前临床上常用的vero细胞狂犬病疫苗。所述sec2为纯化的全长sec2蛋白。

进一步更优选地，所述vero细胞狂犬病疫苗为用狂犬病病毒l巴斯德固定毒pv2061毒株接种vero细胞培养后，收获病毒液，经浓缩、灭活制得；和/或，所述纯化的sec2蛋白为重组sec2蛋白。

优选地，为取得较佳的协同作用效果，所述的狂犬病疫苗和sec2的用量比为(0.032-0.8)iu:(3-30)μg。

更优选地，狂犬病疫苗和sec2的用量比为0.08iu:30μg。

根据本发明，本发明的佐剂和疫苗组合物可以包含促进所述佐剂或疫苗组合物的施用和组分摄入的其他非活性组分，例如辅料。所述辅料可以是适当的载体或赋形剂、用于支持任意免疫应答的另外的佐剂、抗菌剂和/或抗病毒剂。还可以包含在本发明的疫苗组合物中的其他添加剂是乳化剂、湿润剂、着色剂、赋味剂、药用载体、片剂形成剂、稳定剂、抗氧化剂和防腐剂。

本发明的佐剂或疫苗组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道或经由植入型储库(implantedreservoir)施用。术语肠胃外用于本文中时包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内、颅内、经皮、皮内、肺内、腹膜内、心内、动脉内和舌下注射或灌输技术。特别优选地是皮内和肌内注射。本发明药物组合物的无菌注射形式可以是水性或油性混悬液。这些混悬液可以使用适当的分散剂或湿润剂和混悬剂按照本领域已知的技术配制。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

(1)本发明利用金黄色葡萄球菌肠毒素c2作为狂犬病疫苗佐剂，具有热稳定和毒性小等优点。

(2)本发明所用的疫苗佐剂和疫苗组合物，能显著地提高抗原免疫后的抗体滴度和细胞因子il-4和ifn-γ的分泌水平，明显提升接种疫苗后的攻毒保护率，并可有效地增强狂犬病疫苗的免疫应答效果。

(3)本发明的疫苗佐剂和疫苗组合物，使用方便、便于运输、工艺简单、成本低且易于推广。

附图说明

图1为本发明实施例4中，终浓度为2iu/ml刺激免疫后小鼠的脾淋巴细胞的增殖，以mts染色法检测增殖(横坐标为分组，纵坐标为刺激指数)。

图2为本发明实施例5中，elispot法检测第二次免疫14天后各实验组小鼠血清中细胞因子ifn-γ和il-4的分泌水平的显微镜照片图

图3为本发明实施例5中，elispot法检测第二次免疫14天后各实验组小鼠血清中细胞因子ifn-γ和il-4的分泌水平的计数图(横坐标为分组，纵坐标为细胞因子个数)。

图4为本发明实施例6中，elisa法检测免疫后各实验组小鼠血清中特异性抗体滴度水平(横坐标为各采血时间点，分别为第一次免疫后的第0天，7天和14天，纵坐标为血清中抗体滴度水平)。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1：制备金黄色葡萄球菌肠毒素c2

金黄色葡萄球菌肠毒素c2纯品全长蛋白制备方法可参照现有技术(例如徐明恺,张成刚,周亚凤,张先恩.2005.金黄色葡萄球菌肠毒素c2的基因克隆、表达及其生物学活性.生物化学与生物物理进展(sci).32(3):275-281)。具体方法如下：

1.菌株构建：

1)sec2全基因的合成

针对该基因序列，委托上海生工生物工程有限公司进行全基因dna合成sec2编码基因的全序列(ncbi登录号ay450554)。

2)pcr扩增sec2基因

委托上海生工生物工程有限公司合成pcr引物如下：

上游引物p1：5’-ttcgaattcgagagtcaaccagacccta-3’；

下游引物p2：5’-cctctcgagttatccattctttgttgta-3’；以合成的编码sec2的dna为模板，进行pcr扩增。pcr反应体系如下：

pcr扩增程序如下：

94℃变性7min；

94℃1min，45℃1min，72℃2min，5个循环；

再94℃45s，55℃45s，72℃2min，25个循环；

最后72℃延伸10min，4℃保存。

3)sec2表达载体构建：pcr扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收(天根生化科技(北京)有限公司)约720bp的片段，回收产物以ecori(takara公司)，xhoi(takara公司)双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒再次回收约720bp的片段；将pet-28a表达载体质粒(novagen公司)，同样经ecori、xhoi双酶切消化，胶回收试剂盒回收约5000bp的片段；将两个片段混合，摩尔比为750:5000＝3:1，以t4dna连接酶(takara公司)在16℃下连接过夜。

4)sec2宿主菌株的构建：连接产物以常规钙转化方法(转化操作按f.奥斯伯，r.布伦特，r.e.金斯顿，d.d.穆尔，j.g.塞德曼，j.a.史密斯，k.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》，美国纽约johnwiley&sons出版社，1995年第三版，p39-40)，转化e.colibl21(de3)感受态细胞(novagen公司)，挑取转化子送交上海生工生物工程有限公司，经sanger末端终止法测序鉴定正确。

2.菌株的表达和超声破碎

将上述sec2表达宿主菌株在无菌操作条件下接种到lb液体培养基(含工作浓度为60μg/ml的卡那霉素)中培养，使菌株复壮。然后挑选培养基中茁壮的部分菌落接种到新的lb培养基(含工作浓度的卡那霉素)中培养，重复复壮步骤2-3次。将获得的菌落接种于lb液体培养基(含工作浓度的卡那霉素)，37℃摇床中220rpm震荡培养15小时；按1:100比例的接种量转接，继续震荡培养至菌液od600约为0.6时加入终浓度为1mmol/ml的iptg，并于30℃下诱导蛋白质表达4小时后，菌液于4,000rpm离心20分钟收集菌体。菌体用平衡缓冲液(10mmimidazole，500mmnacl，50mmnah2po4,ph8.0)重悬，在冰水浴中超声(设备型号：英国mse公司，soniprep150)破碎至菌液清亮(7s超声破碎，7s停歇，75个循环，重复三次)，破碎产物于4℃、10,000rpm离心40分钟，收集上清液。

3.sec2的纯化

sec2用亲和层析方法纯化，其具体步骤为：

1)按常规方法装填ni亲和层析柱，其中ni亲和层析柱材料(nisepharose6ff)购自美国ge公司。

2)用平衡缓冲液，将层析柱平衡10个柱体积；

3)将破碎离心后的上清液样品上样层析柱；

4)用平衡缓冲液，冲洗10个柱体积，直至基线。

5)用洗脱缓冲液(除咪唑浓度外，其他成份与平衡缓冲液相同)，设置咪唑浓度梯度为从10mm至200mm，进行线性梯度洗脱，收集洗脱峰；

6)洗脱峰成份于pbs磷酸缓冲液中透析除盐，获得纯化后的sec2蛋白。

4.sec2浓度测定

按照试剂盒说明书测定蛋白浓度：

1)稀释bsa标准品：用与待测蛋白样品相一致的磷酸缓冲液pbs，配方为每1升pbs含8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4，ph7.4，倍比稀释bsa标准品；

2)分别将每个25μl的待测样品(原液或稀释液)与每个25μl稀释好的bsa标准品添加于96孔板的微孔中；

3)各孔中加入200μl的bca工作液，充分混匀；

4)盖上96孔板盖，37℃孵育30分钟；

5)冷却至室温；

6)用酶标仪(ck-2300，美国biotech公司)测定562nm处的吸光值；

绘制标准曲线，计算样品中的蛋白质浓度。

实施例2：sec2免疫balb/c小鼠

36只小鼠(4-6周龄雌性spf级balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司)分为4组，每组9只，分别为sec2给药组、狂犬病疫苗给药组、sec2+狂犬病疫苗给药组、和pbs阴性对照组。间隔一周免疫两次，腹腔注射，注射剂量为500μl/只。配伍疫苗中sec2剂量为30μg/只，狂犬病疫苗剂量为4μl疫苗原液/只(vero狂犬病疫苗，浓度为20iu/ml，辽宁成大生物有限公司)。

实施例3：采集血清

第一次免疫后的第0天、7天和14天，以小鼠内眦采血，血液样品先置于4℃中静置30分钟，以4℃4000rpm离心20分钟分离血清，血清保存于-70℃用于elisa检测抗体滴度。

实施例4：检测受免疫小鼠脾细胞的特异性刺激指数

检测免疫后小鼠脾细胞特异性刺激指数采用mts法检测(mts购自promega公司)。在96孔板上分别设空白孔(只含培养基不加细胞)、阳性对照孔(含细胞和终浓度为5μg/ml的cona为刺激物)、阴性对照孔(只含细胞不加刺激物)和待测样品孔(含细胞和终浓度为1/10体积的疫苗原液，即2iu/ml)。每孔含细胞量为5×10⁵个细胞，终体积为每孔100μl，37℃温育48小时，在培养的最后4小时，每孔加20μlmts避光继续温育，4小时后酶标仪490nm处读数，计算刺激指数。每孔重复三次。

刺激指数如图1所示。单独使用狂犬病疫苗免疫后，受试小鼠的脾细胞的刺激指数为1.28；而狂犬病疫苗复合sec2佐剂免疫后，受试小鼠的脾细胞的刺激指数提升至为2.27，相比于不加佐剂组提升了77.34％(p<0.05)。

实施例5：检测脾细胞中细胞因子il-4和ifn-γ的分泌

检测细胞因子采用elispot法检测(小鼠的细胞因子il-4和ifn-γ的elisa检测试剂盒购自ebioscience公司)。在预包被抗原的96孔pvdf膜板上分别设空白孔(不加细胞)、阳性对照孔(加10μlpma为刺激物)、阴性对照孔(不加刺激物)和待测样品孔(加10μl疫苗原液为刺激物)。

1.预包被板的活化：每孔加入200μlrpmi-1640培养基，室温静置10分钟后弃去培养基；

2.加入细胞悬液：将调整好浓度的细胞悬液加入各实验孔，每孔最终为5×105个细胞；

3.加入刺激物：10μl/well，具体如下：阳性对照孔：加入10μlpma工作液。阴性对照孔：不加刺激物。实验孔：加入10μl疫苗原液。加入rpmi-1640培养基，使每孔的最终体积为100μl；

4.孵育：每孔重复三次，所有样品和刺激物加完后，盖好板盖。放入37℃，5％co2培养箱培养24小时；

5.裂解细胞：倾倒孔内细胞培养基。加预冷的去离子水，200μl/well，4℃冰箱放置10分钟低渗裂解细胞；

6.洗板：倾倒孔内液体，每孔加入200μl的washingbuffer进行洗板，重复洗涤5次。每次停留60秒。最后一次洗涤后，弃去washingbuffer并在吸水纸上扣干；

7.检测抗体孵育：将稀释好的生物素标记的抗体工作液加入各实验孔，100μl/well。37℃孵育1小时；

8.洗板：重复步骤6；

9.酶联亲和素孵育：将稀释好的酶标亲和素工作液加入各实验孔，100μl/well。37℃孵育1小时；

10.洗板：重复步骤6；

11.显色：将现配的aec显色液工作液加入各实验孔，100μl/well。室温避光静置25分钟；

12.终止显色：倾倒孔内液体，揭开板底座，用去离子水洗涤正反面及底座5遍，终止显色。将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座；

13.在显微镜下进行elispot板斑点计数。

小鼠脾细胞分泌il-4和ifn-γ量如图2及图3所示。单独使用狂犬病疫苗免疫后，受试小鼠脾细胞中ifn-γ和il-4的斑点形成细胞(spotformingcell,sfc)数分别为78和72(如图2所示)；而狂犬病疫苗复合sec2佐剂免疫后，受试小鼠脾细胞中ifn-γ和il-4的sfc数分别提升为140.33和167.33，分别提升了79.48％(p<0.05)和131.94％(p<0.01)。

实施例6：检测血清中抗体滴度

elisa法(所有相关用品购自bethyl公司)检测抗体滴度

1.用coatingbuffer将疫苗原液(浓度为20iμ/ml)稀释32倍后根据需要的孔数，每孔加100μl，4℃过夜孵育；

2.甩干板内液体，加300μlwashingbuffer，静置1分钟后甩干，重复3次；

3.每孔加200μlblockingbuffer，37℃孵育30min；

4.重复步骤2；

5.将实验组血清按照1:100、1:200、1:400…1:12800的方式倍比稀释后每孔加入100μl，每孔重复三次，37℃孵育60min；

6.重复步骤2；

7.将结合有hrp的羊抗鼠igg-fab稀释10000倍，每孔加入100μl，37℃孵育60min；

8.重复步骤2；

9.每孔加入100μltmb，孵育15min；

10.每孔加入100μlstopsolution，酶标仪450nm处读数。

小鼠抗体滴度如图4所示。单独使用狂犬病疫苗免疫后，受试小鼠血清中的igg抗体滴度分别为7.89log2(7天)和10.22log2(14天)；而狂犬病疫苗复合sec2佐剂免疫后，受试小鼠血清中igg抗体滴度分别提升至8.89log2(7天，p<0.05)和13.77log2(14天，p<0.01)。

实施例7：检测致死剂量病毒攻击下小鼠的存活率

306只小鼠(4-6周龄雌性spf级balb/c小鼠)分为17组，每组18只，分别为sec2给药组、狂犬病疫苗给药组(低中高剂量)、sec2+狂犬病疫苗给药组(低中高剂量组合)、ltb+狂犬病疫苗给药组(低中高剂量)、和pbs阴性对照组。间隔一周免疫两次，腹腔注射，注射剂量为500μl/只。配伍疫苗中sec2剂量分别为3、10和30μg/只(即低、中、高剂量)，ltb剂量为30μg/只(购自sigma)，狂犬病灭活病毒剂量为1:25、1:125及1:625稀释度疫苗原液/只(疫苗原液浓度为20iu/ml)。于第二次免疫后7天，使用剂量为31.62ld50/0.03ml的cvs滴鼻攻毒，并于攻毒后两周统计小鼠存活情况。实验重复三次。

表1小鼠攻毒实验结果

小鼠攻毒实验结果如表1所示。由对照组数据可见，单独免疫sec2后小鼠存活率为0±0％，说明sec2本身不存在抗狂犬病病毒的能力。由疫苗组数据可见，免疫高剂量的疫苗(1/25疫苗)后，小剂量的添加sec2基本不影响小鼠的存活率，在高剂量sec2添加时才极大增加了小鼠的存活率(疫苗组13vs.疫苗组1)；免疫中、低剂量的疫苗(1/125疫苗、1/625疫苗)后，添加sec2能明显提升小鼠的存活率。同时，在相同浓度下，添加ltb的效果不如sec2的效果明显(疫苗组4～6vs.疫苗组13～15)。表中*表示与同剂量的疫苗组无佐剂组相比具有统计学差异，p<0.05；**表示与同剂量的疫苗组无佐剂组相比具有统计学差异，p<0.01；#表示与同剂量的疫苗ltb佐剂组相比具有统计学差异，p<0.05。