本发明属于植物活性物质的提取方法及应用领域，特别涉及一种红豆树种子提取物的制备方法及其在抗炎药物中的应用。
背景技术：
炎症是机体对病原体感染以及各种组织损伤等产生的一种防御反应，是最常见的基本病理生理过程。其复杂的进程既能抵抗外界感染和损伤，也会给宿主带来不同程度的伤害作用。近年研究发现，包括肿瘤、糖尿病、心血管疾病在内的绝大多数疾病的发生发展过程都存在炎症反应。
临床上最常用的小分子抗炎药物为地塞米松，其较大的副作用一直为人们所诟病。人们日益增长的物质需求迫切的需要新的、副作用小抗炎药物，而天然植物提取物以多成分、多靶点发挥药效而被人们广泛关注。
红豆树，ormosiahosiei隶属于豆科（leguminosae）红豆属(ormosia)，又称鄂西红豆，江阴红豆等。本课题组前期已突破该植物育种技术，并在中央财政林业推广项目支持下在福建地区种植红豆树3000多亩，植物资源丰富。然而，文献对于红豆树的药用价值鲜有报道，进一步的民间走访发现，其根、枝、叶和种子在民间均有药用，如眼部感染、风湿性关节炎等。
本发明针对红豆树种子(以下称“红豆”)提取物民间用药情况，围绕炎症展开研究，首次发现红豆树种子提取物具有显著抗炎作用；同时，红豆提取物通过进一步的制备，其体内外抗炎测试优于阳性对照药地塞米松。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种红豆树种子提取物的制备方法及其在抗炎药物中的应用。本发明的提取物制备方法操作简单，红豆药材粉末通过70wt%乙醇回流所得提取物hds-1即有抗炎活性，且与阳性对照药地塞米松活性相当；进一步通过d101大孔吸附树脂纯化，所得提取物hds-2活性显著提高，且优于地塞米松。
为实现上述目的，本发明所提供的技术方法如下：
一种红豆树种子提取物的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）取红豆树种子，经干燥后粉碎，过20目备用；
（2）取步骤（1）得到的红豆药材粉末1.0kg，加70wt%乙醇溶液10000ml，加热煮沸2小时，过滤得提取液；滤渣再加入8000ml70wt%乙醇溶液，再一次煮沸2小时，过滤，得提取液；合并两次提取液，减压浓缩至干得提取物，命名为hds-1；
（3）将步骤（2）所得提取物hds-1经大孔吸附树脂进一步纯化：量取d101大孔吸附树脂，乙醇湿法上柱后，用水洗脱至无醇味，备用；称取提取物hds-1，水溶解，上d101大孔吸附树脂柱，流速5ml/min，上样结束后，静态吸附2h，依次用3倍柱体积水洗脱除去杂质；30wt%乙醇4倍柱体积洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得干浸膏，命名为hds-2。
上述方法制得的红豆树种子提取物用于制备抗炎药物。
本发明的有益效果在于：本发明的提取物制备方法操作简单，红豆药材粉末通过70wt%乙醇回流所得提取物hds-1即有抗炎活性，且与阳性对照药地塞米松活性相当；进一步通过d101大孔吸附树脂纯化，所得提取物hds-2活性显著提高，且优于地塞米松。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
取红豆树种子，经干燥后粉碎，过20目；称取粉末1.0kg，加70wt%乙醇溶液10000ml，加热煮沸2小时，过滤得提取液；滤渣再加入8000ml70wt%乙醇溶液，再一次煮沸2小时，过滤，得提取液；合并两次乙醇溶液提取液，减压浓缩至干得提取物hds-1153g，得率为15.3%；所得提取物经大孔吸附树脂进一步纯化：量取d101大孔吸附树脂，乙醇湿法上柱后，用水洗脱至无醇味，备用；称取提取物hds-1，水溶解，上d101大孔吸附树脂柱，流速5ml/min，上样结束后，静态吸附2h，依次用3倍柱体积水洗脱除去杂质；30wt%乙醇4倍柱体积洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得干浸膏hds-282.5g，相当于药材量的8.25%。
体外抗炎活性：采用elisa法检测，通过对lps诱导的小鼠巨噬细胞raw264.7细胞no释放量的影响进行评价。
具体操作：小鼠单核巨噬细胞系raw264.7细胞在37℃，5%co2条件下，用含10%胎牛血清的rpmi1640培养基孵育培养，2天更换一次培养基，待细胞生长为对数期进行处理。对数生长期raw264.7细胞经细胞刮处理，离心（800rpm，4℃），调整细胞密度为2×10-5个/ml，接种于96孔细胞培养板，于37℃，5%co2条件培养12h后，撤去上清，加入含2%fbs的1640培养基孵育4-6h，备用。加入红豆提取物，孵育1h后，加入lps（1μg/ml），于37℃，5%co2条件条件下培养24h，取上清，按照试剂盒提供方法测定od值。
根据od值计算no的绝对浓度，并计算抑制率和ic50。
抑制率（%）=（c模型-c提取物）/c模型×100%（c为no的绝对浓度）
计算ic50时，使用graphpadprismversion6.0线性关系模块中dose-response-inhibition进行计算。
红豆提取物对lps诱导raw264.7细胞no含量的影响
实验结果表明，红豆提取物具有显著的抑制lps诱导的小鼠巨噬细胞raw254.7细胞no的产生，提示具有较好的抗炎活性，与阳性对照药地塞米松活性相当；经大孔吸附树脂分离纯化后，活性显著提高，hds-2体外抑制no活性是粗提取hds-1的约4倍，明显优于阳性对照药。
体内抗炎活性：采用小鼠耳肿胀法。
将96只18-22g雄性昆明种小鼠，按体重随机分为8组：模型组（生理盐水，5ml/kg），阳性对照药阿司匹林组（0.5g/kg），红豆提取物hds-1（1.0g/kg、0.5g/kg、0.1g/kg）高、中、低剂量组和hds-2（1.0g/kg、0.5g/kg、0.1g/kg）高、中、低剂量组。小鼠灌胃给药，给药容量均为10ml/kg，1次/d，连续给药3d，于末次给药1h后，将100%二甲苯0.05ml均匀涂抹于每只小鼠左耳廓两面致炎，右耳作对照，用直径8mm打孔器分别在左右耳的相同部位圆形耳片，称重，以两耳片的质量差作为耳肿胀度，计算肿胀抑制率。
耳肿胀度=左耳片质量-右耳片质量
耳肿胀抑制率=（模型组肿胀度-给药组肿胀度）/模型组肿胀度
红豆提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
与模型组比较*p<0.05，**p<0.01；与地塞米松组比较，#p<0.05，##p<0.01。
二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型是评价药物体内抗炎活性的常见模型。实验结果显示，hds-1与hds-2具有显著的体内抗炎活性，同等给药剂量下，hds-1肿胀抑制率优于阳性对照药地塞米松，hds-2活性是地塞米松的2倍。
体内外的抗炎活性试验均显示，hds-1和hds-2具有显著的抗炎活性，这也是首次发现红豆提取物具有抗炎活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。