本发明涉及一种肾康丸对糖尿病肾病细胞外基质增殖的方法，具体地说是以一种肾康丸对糖尿病肾病细胞外基质增殖的方法。
背景技术：
目前公知的糖尿病肾病（diabeticnephropathy，dn）是糖尿病（diabetesmellitus，dm）全身性微血管并发症之一，也是导致dm患者死亡的重要原因。约40％的ⅰ型dm和5％～10％的ⅱ型dm患者可以发生dn。dm可由多种途径损害肾脏，并累及肾脏的所有结构，从肾小球、肾血管直到肾小管和肾间质，随着病情的进一步发展，可影响肾功能不可逆转，最终导致终末期肾功能衰竭。迄今为止，西医除强调控制血糖、血压外，对该病尚无特效药物。中药制剂肾康丸在临床用于治疗dn多年，具有确切的保护dm患者肾脏的作用。肾小球系膜细胞（mesangialcell，mc）的变化在肾脏疾病的发病中具有重要的作用。
技术实现要素：
研究对象：1、动物和细胞株wistar雄性大鼠，体质量190～230g，购于南方医科大学（原中国人民解放军第一军医大学）动物实验中心，合格证号：粤检证字第2004a031号；大鼠mc细胞株，购于武汉大学。2、受试药品和主要试剂肾康丸由黄芪、芡实、金樱子、玉米须、水蛭等组成，南方医科大学珠江医院药剂科生产，批号：20031214；开博通片由上海中美施贵宝药业有限公司生产，批号：0402032。rpmi1640干粉为美国gibco公司产品；小牛血清由杭州四季青生物工程研究所提供；四甲基偶氮唑蓝（mtt）、二甲基亚枫（dmso）、碘化丙啶（pi）染液、l谷氨酰胺和hepes均为美国sigma公司产品；丙酮酸钠为amresco公司产品；rna酶（rnase）为上海生工产品；fn双抗夹心酶联免疫吸附（elisa）试剂盒由美国diagnositca公司提供。3主要仪器co2培养箱由广东新绿洲生物技术研究所生产；xd101型倒置显微镜由南京江南光电股份有限公司提供；swlg1f超净台由苏州安泰空气技术有限公司生产；model∑960型酶标仪为meterechinc公司产品；facs20流式细胞仪为美国bectondiskson公司产品。4药物血清制备16只大鼠随机分为4组：正常血清组，开博通组，肾康丸高、低剂量组。开博通组，肾康丸高、低组分别按5mg/kg、2.4g/kg和1.2g/kg（按照人与大鼠体表面积换算，分别相当于成人37.5mg/d、24g/d、12g/d，即相当于成人临床用量的1倍、2倍和1倍）灌服相应药物混悬液，连续7d。正常血清组灌服等体积生理盐水。最后1次灌药（灌药前禁食不禁水12h）1h后，30g/l戊巴比妥（1.5ml/kg）腹腔麻醉，腹主动脉采血，3000r/min，离心10min，分离血清，56℃，30min水浴灭活，0.22μm微孔滤膜过滤，分装，-20℃保存。广州中医药大学学报2007年第24卷第6期肖炜，等.肾康丸对培养的大鼠系膜细胞增殖、细胞外基质分泌和细胞周期的影响。5mc的培养与分组mc加入含体积分数10%胎牛血清（fcs）的rpmi1640培养液（含200μg/ml青、链霉素及2.38g/lhepes），置于37℃、体积分数5%co2培养箱中培养，取4～8代mc进行实验。每次实验前细胞经消化，1000r/min离心5min，dhanks液洗涤，然后重悬细胞（1×105/ml）并用含体积分数1%fcs的rpmi1640培养液培养24h，以使所有细胞同步化。同步化后，将mc分为5组：高糖模型组（体积分数1％fcs、30mmol/lglurpmi1640培养液），正常血清组（体积分数5％正常大鼠血清、体积分数1％fcs、30mmol/lglurpmi1640培养液），开博通组（体积分数5％开搏通药物血清、体积分数1％fcs、30mmol/lglurpmi1640培养液）及肾康丸高、低剂量组（体积分数5％肾康丸高、低剂量药物血清、体积分数1％fcs、30mmol/lglurpmi1640培养液）。6mtt法检测mc增殖mc同步化及分组同1.5。各组mc加入相应药物血清及不同葡萄糖的培养液后，置96孔培养板培养，6孔重复，培养72h后，吸取上清液，待测fn含量。各孔细胞加入5mg/ml的mtt溶液20μl，37℃，继续孵育4h。终止培养，吸弃上清液，每孔加入200μldmso，振荡裂解10min，使结晶物充分溶解。酶标仪双波长测定各孔吸光度值（d），以d值间接反映mc在培养孔中的增殖密度（d值越低则说明mc的增殖越弱）。测定波长为570nm，参考波长为630nm，酶标仪所示d值为d570减去d630，以消除非特异性光吸收效应。7elisa法检测培养的mc上清fn含量上述培养的各孔mc上清，用双抗夹心酶联免疫吸附（elisa）法检测fn含量，按试剂盒说明书进行，根据标准品的标准曲线求出相应的含量。8流式细胞仪检测mc细胞周期mc同步化及分组同1.5。各组mc加入相应药物血清及不同葡萄糖的培养液后，置25cm2细胞培养瓶培养，3瓶重复。培养72h后，弃上清，2.5g/l胰酶消化，收集细胞，用磷酸盐缓冲液（pbs）洗涤2次，4℃、体积分数70%冷乙醇中固定。调整细胞浓度至1×105/ml，加入pi染料（其中pi50mg/l，tritonx10010mg/l，rnase酶20mg/l）对dna进行染色，避光孵育30min，流式细胞仪检测分析mc在各细胞周期（go/g1、s、g2/m）所占比例，每组检测5000个细胞。采用spss13.0软件进行统计分析。
结果；高糖模型组mc的d值和上清fn含量显著性高于低糖模型组（p＜0.01），表明高糖能促进mc增殖和fn分泌。与高糖模型组比较，开博通组，肾康丸高、低剂量组mc的d值和上清中fn含量均显著性降低（p＜0.05或p＜0.01），表明开搏通与肾康丸均能抑制高糖诱导的mc增殖和fn分泌。正常血清组与高糖模型组比较无显著性差异（p＜0.05），因此，正常大鼠血清无抑制mc增殖和分泌fn的作用。高糖组与低糖组相比g0/g1期细胞显著性减少，而s及g2/m期细胞显著性增加（p＜0.01）。与高糖组比较，开搏通、肾康丸高、低剂量组g0/g1期细胞显著性增加（p＜0.01），s及g2/m期细胞显著性减少（均p＜0.05或p＜0.01），表明开博通与肾康丸均能改善高糖导致的mc周期异常。正常血清组与高糖模型组比较无显著性差异（p＜0.05），因此，正常大鼠血清无改善mc细胞周期异常的作用。
发明目的：高血糖一直被认为是与dm各种并发症关系最为密切的因素之一，许多学者研究发现，高糖培养mc与dn大鼠存在着相同的病理过程。研究发现高糖模型（30mmol/l）组与低糖模型（10mmol/l）组比较，mc显著性增殖，fn分泌水平显著性增加，说明高糖能促进mc增殖及ecm分泌。肾康丸高、低剂量组均能抑制高糖诱导的mc增殖，减少fn分泌，为其在临床上治疗dn提供了实验依据。肾脏细胞的增殖调节最终发生在细胞周期水平上，细胞顺序完成一个细胞周期就完成一次增殖。根据细胞增殖情况，分化成熟的细胞可以分成3类：持续分裂细胞，终末分裂细胞和暂时休止细胞。mc属于最后一类。在分裂原刺激下，mc活化，离开休止期（g0）进入细胞周期的g1期。当细胞通过g1期后便进入合成dna的s期，此后便是g2和有丝分裂m期。其中只有g0/g1期时间变化较大，是细胞周期的关键和限速阶段。本研究发现，高糖组mc的g0/g1期的细胞比例显著性减少，而s期及g2/m期细胞比例显著性增加，说明高糖可以通过影响mc细胞周期，促进细胞增殖和分泌。肾康丸高、低剂量组g0/g1期的细胞比例均明显增加，s期及g2/m期细胞比例显著性减少，说明肾康丸可以通过改善高糖诱导的mc细胞周期变化，阻止mc进入增殖期，从而抑制mc增殖和ecm分泌。有研究显示肾康丸组方中一些中药具有抑制mc增殖的作用。如黄芪等提取液喷雾干燥粉末可以抑制高糖引起肾小球mc增殖，水蛭中的水蛭素能够显著下调凝血酶介导的mc增殖。此外，有人认为体内过多的葡萄糖是一种内生的甘浊之邪，根据五味理论，酸能克甘，因此酸味药物可以克制和消除体内的甘浊之邪，而其实验结果也表明酸味中药山楂对高糖培养下的mc有保护作用，为进一步探讨肾康丸治疗dn的作用机制，我们观察了肾康丸对体外高糖培养的mc增殖、纤维连接蛋白（fibronetin，fn）分泌和细胞周期的影响。
技术方案：将16只wistar雄性大鼠随机分为4组，即正常血清组，开搏通组（剂量为5ng/kg，肾康丸高、低剂量组剂量分别为2.4、1.2g/kg)，灌服相应药物7d，分离制备药物血清。将体外高糖（30mmol/lglu）培养的mc分为5组：高糖模型组(30mmol/lglu)，正常血清组(体积分数5%正常血清），开博通组（5%开博通血清）及肾康丸高、低剂量组（5%肾康丸高、低剂量血清），另设低糖（10mmol/lglu）模型组。培养72h后，采用四甲基偶氮噬盐（mtt）法测定各组细胞增殖，双抗夹心酶联免疫吸附（elisa）法检测上清纤维连接蛋白（fn）含量，流式细胞仪检测细胞周期。
发明有益效果：高糖培养的mc显著性增殖，上清fn含量显著性增加，并出现细胞周期异常，肾康丸能抑制mc增殖，减少fn分泌，并使go/g期细胞比例显著性增加，而与期及g2/m期细胞比例减少。肾康丸可通过调整mc细胞周期异常，进而抑制高糖诱导的mc增殖和ecm分泌。
最佳实施方式：运用药物治疗。