一种恒河猴糖尿病肾病模型的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种恒河猴糖尿病肾病模型的制备方法，包括如下步骤：（1）将剂量为80～100mg/kg的链脲菌素施用于恒河猴；（2）血糖浓度升至11.1mmol/l后，餐前施用胰岛素，使恒河猴血糖浓度为10-20mmol/L。本发明在糖尿病恒河猴的基础上，采用血糖控制的方式，成功地诱导恒河猴糖尿病肾病模型。
【专利说明】一种恒河猴糖尿病肾病模型的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及恒河猴糖尿病肾病模型的制备方法。
【背景技术】
[0002]糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)的发病率呈快速增长的趋势。据报道我国现约有9200万DM和1.48亿DM前期患者，成为继美国之后的第二个糖尿病发病大国。随着病情的逐渐发展加重，这些患者中约有30-40%的I型糖尿病患者和约20%的2型糖尿病患者伴随严重的肾功能损害-糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy, DN)。
[0003]DN是糖尿病患者最严重的慢性并发症之一，也是糖尿病患者最主要的死亡原因。一旦DN患者出现了显著的临床症状，此时可选择的药物较少，且药物的治疗效果较差，病情往往呈进行性发展直至末期肾衰，给患者家庭和社会带来巨大的经济负担。因此深入研究DN的发病机制及早期诊断方法，在此基础上探索延缓或逆转疾病进程的有效措施，是目前医学研究的热点和难点问题。
[0004]动物模型是研究人类重大疾病的基础，建立与人类高度近似的DN动物模型，将会在研究其发病机理、早期诊断和干预治疗等方面取得事半功倍的效果。非人灵长类动物作为人类的近亲，在遗传基因方面约96%以上同源，其形态结构、生理机能和生化代谢均同人类非常相似，建立一种非人灵长类动物DN模型对研究DN的发生发展、早期诊断和新药研发等具有重要的科学意义和经济价值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供恒河猴糖尿病肾病模型的制备方法。
[0006]本发明恒河猴糖尿病肾病模型的制备方法，包括如下步骤:
[0007](I)将剂量为80?100mg/kg的链脲菌素施用于恒河猴；
[0008](2)血糖浓度升至11.lmmol/1后，餐前施用胰岛素，使恒河猴血糖浓度为10-20mmol/Lo
[0009]本发明恒河猴糖尿病肾病模型的制备方法，包括如下步骤:
[0010](I)将剂量为80?100mg/kg的链脲菌素施用于恒河猴；
[0011](2)血糖浓度升闻至11.lmmol/1后，词喂闻脂词料，每天词喂2次，词喂量为
0.3-0.4kg/次.只，并在餐前施用胰岛素，使恒河猴血糖浓度为10-20mmol/L，所述饲料包含如下重量配比的原料:标准猴饲料78份、动物油脂15份、糖5份、胆固醇2份。
[0012]标准猴饲料，是指《中华人名共和国国家标准GB14924.8-2001》规定的猴配合饲料。
[0013]动物油脂，是指来源于动物的脂肪，如:牛油、羊油、猪油。
[0014]步骤(I)中，所述的施用方式是静脉注射。
[0015]步骤(2)中，所述的施用方式是皮下注射。
[0016]步骤(2)中，所述动物油脂是猪油；所述糖是蔗糖。[0017]本发明恒河猴糖尿病肾病模型的高脂饲料，它包含如下重量配比的原料:标准猴饲料78份、动物油脂15份、糖5份、胆固醇2份。
[0018]所述动物油脂是猪油；所述糖是蔗糖。
[0019]本发明前述方法制备的动物模型在筛选治疗恒河猴糖尿病肾病的药物中的用途。
[0020]本发明筛选治疗恒河猴糖尿病肾病模型的药物的方法，它包括如下步骤:
[0021]a、按照前述方法，建立恒河猴糖尿病肾病模型；
[0022]b、将候选药物施用于动物模型；
[0023]c、用动物模型评价潜在的治疗恒河猴糖尿病肾病的药物。
[0024]本发明造模方法可以诱导恒河猴出现肾脏损伤、微量蛋白尿等糖尿病肾病的临床症状，给药方法简单，可重复性强。
[0025]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
`[0026]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1血糖控制情况；[0028]图2肾功能检测结果；[0029]图3致纤维化基因改变情况；[0030]图4肾血流动力学参数和血流灌注系数；[0031]图5肾脏B超检查的血流分布和频谱；[0032]图6肾组织病理改变；[0033]图7肾组织免疫荧光。【具体实施方式】[0034]实施例1本发明恒河猴糖尿病肾病征模型的制备[0035]I实验材料和仪器[0036]1.1供试品基本信息[0037]IL-1 β 抗体:abeam[0038]TNF-a 抗体:abeam[0039]TGF- β I 抗体:Bioworld[0040]CTGF 抗体:abeam[0041]Collagen IV 抗体:abeam[0042]Fibronection 抗体:Bioworld[0043]MCP-1 抗体:ebioscience[0044]CD68 (KPl)抗体:abeam[0045]eNOS 抗体:abeam[0046]动物组织总RNA提取试剂盒:天根[0047]iScript?cDNA 合成试剂盒:B10_RAD
[0048]iQ? SYBR? Green Supermix:BIO-RAD
[0049]1.2试验所需主要仪器、器械
[0050]血糖检测仪:罗康全活力型血糖检测仪，罗康全活力型血糖试纸
[0051]全自动血液生化分析仪(瑞士Roche COBAS Integra400Plus,编号 MEB-02-01)
[0052]BIO-RAD CFX96 荧光定量 PCR 仪
[0053]BIO-RAD S200PCR 仪
[0054]LEICA DM4000B 荧光显微镜
[0055]Olympus BX51 光学显微镜
[0056]穿刺针，穿刺枪:BARD
[0057]彩超；Iu22philips
[0058]眼底荧光造影:Topcon TRC.50DX (日本拓普康公司生产)
[0059]1.3实验动物
[0060]1.3.1实验系统
[0061]恒河猴14只，体重3.5?5.5kg，拟由四川成都平安动物繁育研究基地(生产许可证号:SCXK(川)2004 - 013)引进。入室前一周进行结核菌素、寄生虫、沙门氏菌、致贺氏菌检查。
[0062]1.4动物饲养管理
[0063]1.4.1检疫/环境适应
[0064]入室恒河猴试验前先适应环境并检疫一周，选择健康雄性动物作为受试动物，检疫内容:是否与订购时要求的质量指标一致；体温、摄食量、血生化、电解质；动物一般状态；动物体重是否达到试验要求体重的范围。
[0065]1.4.2动物饲养
[0066]恒河猴饲养于国家成都中药安全性评价中心普通动物房(实验动物房使用许可证号:SYXK (JH) 2003 - 030)、恒河猴每只用不锈钢鼠笼分笼饲养，饲养条件符合国标GB14925-2001，室温21±5°C (日温差≤4° C)，相对湿度55± 15%，12小时明暗交替，换气次数8?10次/小时。
[0067]1.4.3动物标识方法
[0068]恒河猴由胸牌·及笼上标签共同标记
[0069]1.5实验分组
[0070]分组包括正常组(3只)，实验组A (STZ糖尿病造模后，通过每天餐前15分钟皮下注射胰岛素，控制血糖〈10mmol/l，3只)，实验组B (STZ糖尿病造模后，通过每天餐前15分钟皮下注射胰岛素，控制血糖于10-20mmol/l，5只)，实验组C (STZ糖尿病造模后，通过每天餐前15分钟皮下注射胰岛素，控制血糖于10-20mmol/l，并饲喂高脂饲料，3只)。
[0071]饲料配方:
[0072]实验组A、B:猴标准猴饲料一商业化的猴颗粒饲料(购自四川省医学科学院动物研究所，配方与《中华人名共和国国家标准GB14924.8-2001》规定的猴配合饲料相同)。
[0073]实验组C:高脂饲料:15%精炼猪油(市售)，5%蔗糖(市售)，2%胆固醇(市售)，78%猴标准猴饲料。[0074]饲喂方式:每天饲喂2次，饲喂量为0.3-0.4kg/次.只。
[0075]2实验方法
[0076]2.1动物一般状况观察
[0077]观察动物外观体征(包括动物的毛发、眼和粘膜)、行为活动、精神状况、腺体分泌、呼吸、饮食、排泄物、注射局部等情况，检测动物体重、血压及摄食量。
[0078]2.2造模方法
[0079]实验组A、B:
[0080]给药前动物禁食禁饮12h以上，静脉输注生理盐水IOOml扩容后，再推注配制好的STZ(80mg/kg)；
[0081]给予常规猴饲料喂养，每天饲喂2次，饲喂量为0.3-0.4kg/次.只；
[0082]检测动物空腹血糖(FBG)，FBG连续2天高于11.lmmol/1后，通过每天餐前15分钟皮下注射胰岛素，控制血糖浓度。
[0083]实验组C:
[0084]给药前动物禁食禁饮12h以上，静脉输注生理盐水IOOml扩容后，再推注配制好的STZ(80mg/kg)；
[0085]给予常规猴饲料喂养，每天饲喂2次，饲喂量为0.3-0.4kg/次.只；
.[0086]检测动物空腹血糖(FBG), FBG连续2天高于11.lmmol/1后，通过每天餐前15分钟皮下注射胰岛素，控制血糖浓度，同时给与高脂饲料喂养，每天饲喂2次，饲喂量为
0.3-0.4kg/次.只。
[0087]2.3血液学检查
[0088]检测指标:红细胞计数(RBC，电容法)、血红蛋白(HGB，HiCN法)、红细胞容积(HCT，电容积分法)、平均红细胞容积(MCV，计算)、平均红细胞血红蛋白(MCH，计算)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC，计算)、网织红细胞计数(RET，荧光染色法)、白细胞计数(WBC，激光法)及分类(中性粒细胞NEU、淋巴细胞LYM、单核细胞MONO、嗜酸性粒细胞E0S、嗜碱性粒细胞BASO,激光法)、血小板计数(PLT，电容法)、网织红细胞(RET，流氏+荧光染色法)、凝血酶原时间(PT，发色底物法)、活化部分凝血酶时间(APTT，发色底物法)。天门冬氨酸氨基转移酶(AST，IFCC P-5’ -P法)、丙氨酸氨基转移酶(ALT，IFCC P_5’ -P法)、Y -谷氨酰转移酶(GGT，L- Y -谷氨酰-3-羧基-对硝基苯胺法)、肌酸磷酸激酶(CK，HK-G6PD法)、碱性磷酸酶(ALP，4-NPP 法)、乳酸脱氢酶(LDH, IFCC 法)、尿素氮(Urea, Urease-GLDH-Kinetic 法)、总蛋白(TP，Biuret 法)、白蛋白(ALB，BCG 法)、血糖(GLU，GLK-G6PDH 法)、总胆红素(TBIL，Diazo法)、肌酐(Crea，JAFF法)、总胆固醇(CHOL，CHOD-P法)、甘油三酯(TG，GPO-PAP法)、钠离子浓度(Na+，离子选择电极法)、钾离子浓度(K+，离子选择电极法)、氯离子浓度(Cl-，离子选择电极法)等。
[0089]检测时间--给STZ第1，4，周各测一次，以后每I?2月测一次。
[0090]方法:自恒河猴后腿大隐静脉采血检测。血液学检查用血以EDTA抗凝，凝血时间用血以枸橼酸钠抗凝。
[0091]2.4 空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG)及餐后血糖(Postprandial bloodglucose, PBG)检测
[0092]检测时间:每周2次检测FBG (上午9点，空腹1?后)及PBG (进食后此)。[0093]检测方法:取手指或脚趾末梢血，用罗氏血糖仪检测。
[0094]2.5静脉葡萄糖耐量实验(IVGTT )
[0095]静脉给予50%的葡萄糖注射液(0.5g/kg体重)，在推注后0，1，3，5，10，30，60和120分钟测定血糖水平，同时检查葡萄糖注射后0，I，3，5，30分钟血样中的胰岛素水平(RIAor ELISA)
[0096]2.6空腹糖化血红蛋白、血清胰岛素及C肽(C-p印tide，C-P)水平检测
[0097]检测时间:每隔4周取血清检测。
[0098]检测方法:放射免疫法(RIA)试剂盒，酶联免疫检测法(ELISA)
[0099]2.7胰岛素治疗
[0100]空腹和餐后血糖监控，根据血糖水平调整糖尿病猴皮下注射胰岛素的种类、剂型及用量。24小时血糖监控观察治疗效果，确定最优方案。定期行血常规及生化检查。
[0101]2.8眼底检查
[0102]检测时间:给药前及给药后观察期结束时。
[0103]测定方法:恒河猴经盐酸氯胺酮麻醉(肌肉注射，15mg/kg)，美多丽散瞳(滴眼，I滴/眼)，以双目间接检眼镜进行检查，所有影像学评估均在全麻状态下进行(动物麻醉方法参考恒河猴手术麻醉S0P)。用眼底镜观察视神经乳头的形状、大小、色泽，边缘是否清晰；黄斑部有无水肿、出血、渗出及色素紊乱；视网膜有无水肿、渗出、出血、剥离及新生血管等。
[0104]2.9肾B超和肾血管造影
[0105]彩超观察肾脏形态和血流灌注分析血流动力学指标和血流灌注系数。造影剂SonoVue (Bracco SpA, Milan, Italy)通过大隐静脉注射 Iml (5mg/ml),然后以 2ml 生理盐水冲洗。之后再做左肾，中间间隔不小于10分钟，中途加以flash爆破。
[0106]2.1OB超引导下肾穿刺活检术
[0107]恒河猴肌注氯胺酮和安泰麻醉后去俯卧位，备皮消毒后铺巾，穿刺点选择左肾上极或下极，避开血管和肾盂。BARD肾穿刺针穿刺抽吸术，分别放入10%多聚甲醛和RNAlatter的EP管保存。所有固定组织进行HE、Masson、PAS常规染色，免疫荧光染色(CTGF、eNOS、IL-1 β、IV型胶原、纤连蛋白FN、TGF_0、MCP_1、TNF-α、⑶68)于显微镜下观察病理组织学变化。RNA latter保存组织提取RNA逆转录后用荧光定量PCR检测smad2、smad3、smad4、smad7、act in、NF- κ b 基因表达。
[0108]2.11液相芯片检测
[0109]取不同病程的血浆，检测因子(IL-1、IL-6、MCP-1、TNF-a、IL-17、IL-18)
[0110]2.12尿液检测
[0111]恒河猴放入代谢笼中，收集晨尿和24小时尿，检测尿常规，尿白蛋白和肌酐。
[0112]3实验结果
[0113]3.1血糖控制情况
[0114]如图1所示，各实验组的血糖均保持在预先规定的范围内。
[0115]3.2肾功能检测
[0116]如图2所示，尿液检查示实验组B和C在第36个月开始出现了微量蛋白尿(MAU)，并且，随着病程推移有增加趋势。血生化显示42个月ABC三组血肌酐和尿素氮和正常组相比有明显差异。[0117]3.3肾脏B超检查的血流分布和频谱
[0118]如图5所示，早期肾血管床阻力增加，从而使肾内血流发生改变，随着病情加重，动脉硬化的血管壁弹性减低，管腔狭窄，外周血管阻力增高，肾血流灌注减少，使肾血流呈低流，高阻状态，其中，B组和C组的的病理改变非常明显，C组最为明显。
[0119]3.4肾血流动力学参数和血流灌注系数
[0120]如图4所示，与对照组相比，ABC三组血流动力学参数阻力指数(RI)增加，舒张末期最低流速(EDV)降低，血流灌注系数曲线下面积(AUC)降低，C组与对照组的差异最大，B组其次，A组差异最小。
[0121]3.5肾组织病理改变
[0122]如图6所示，与正常组相比A组无明显改变，BC组炎性细胞侵润、系膜细胞增生、基底膜增厚、胶原和糖原的沉积，C组更加显著。
[0123]3.6肾组织免疫荧光
[0124]如图7所示，肾组织免疫荧光显示实验组B C与正常组和实验A组相比CTGF、eN0S、IL-l、IV型胶原、纤连蛋白(FN)、TGF_i3表达增加，并且在实验组C更加显著，同时实验组C还出现MCPl和TNF- α表达。
[0125]3.7致纤维化基因改变
[0126]如图3所示，Real-time PCR显示实验组B和C在第24个月开始出现Smad2和Smad3mRNA表达，实验组C更显著，并且在第42个月出现Smad7和NF- κ b mRNA表达增加。
.[0127]3.8眼科检查
[0128]除一只(05539)有双眼白内障未能检查外，其余双外眼无异常，结膜无充血水肿，角膜透明，前房无异常，瞳孔中度散大(均已滴用散瞳剂)。晶体透明，玻璃体无浑浊。眼底:双眼豹纹状眼底，视神经乳头色淡红，C/D=0.3-0.7，A:V=1:2，可见筛孔和血管波动。未见出血、渗出、微血管瘤及水肿,黄斑中心凹反光清。
[0129]综上，实验组A未出现糖尿病肾病的相关症状，实验组B和C出现了糖尿病肾病的典型临床症状:
[0130]1、实验组B和C在第36个月开始出现了微量蛋白尿(MAU)并且随着病程推移有增加趋势；
[0131]2、肾组织HE、Masson、PAS染色显示:实验组A无病变，实验组B和C肾脏从第24个月开始出现炎性细胞侵润、系膜细胞增生、基底膜增厚、胶原和糖原的沉积，并且发现实验组C在第42个月出现局部肾小球硬化。同时期肾组织免疫荧光显示实验组B C于正常组和实验A组相比CTGF、eNOS、IL-1、IV型胶原、纤连蛋白(FN)、TGF-β表达增加，并且在实验组C更加显著，同时实验组C还出现MCPl和TNF-α表达；
[0132]3、Real-time PCR显示:实验组B和C在第24个月开始出现Smad2和Smad3mRNA表达，实验组C更显著，并且在第42个月出现Smad7和NF- κ b mRNA表达增加；
[0133]4、肾血管造影显示，实验组B和C的血流灌注系数AUC和流动力学参数阻力指数RI显著增加，舒张末期最低流速EDV降低(P〈0.05)，动脉硬化的血管壁弹性减低，管腔狭窄，外周血管阻力增高，肾血流灌注减少，使肾血流呈低流、高阻状态；
[0134]本发明通过长期控制糖尿病恒河猴的血糖浓度范围为10-20mmol/L，使得糖尿病恒河猴出现肾组织炎性细胞侵润、系膜细胞增生、基底膜增厚、胶原和糖原的沉积、肾脏损伤、微量蛋白尿等糖尿病肾病的典型临床症状，说明本发明恒河猴糖尿病肾病造模成功。
[0135]本发明通过长期控制糖尿病恒河猴的血糖浓度范围为10-20mmol/L，结合长期高脂肪摄入的方式，使得糖尿病恒河猴的各种糖尿病肾病典型症状比单独控制血糖的方式更为显著，说明二者联合处理的方式更优。
[0136]实施例2用本发明模型筛选治疗糖尿病肾病的药物
[0137]a、按照实施例1方法建立的恒河猴糖尿病肾病模型；
[0138]b、将候选药物施用于动物模型；
[0139]C、观察候选药物对代谢综合征的各种指标的影响情况，评价潜在的治疗糖尿病肾病疾病的药物。
[0140]综上，本发明造模方法通过长期控制血糖的方式，诱导恒河猴出现糖尿病肾病的临床症状，另外，长期血糖控制与高脂摄入联合的方式也可以诱导恒河猴出现糖尿病肾病的临床症状，并且症状更为显著，说明本发明两种方式均可以有效建立恒河猴糖尿病肾病模型。
【权利要求】
1.一种恒河猴糖尿病肾病模型的制备方法，其特征在于:包括如下步骤:(1)将剂量为80?100mg/kg的链脲菌素施用于恒河猴；(2)血糖浓度升至11.1 mmol/1后，餐前施用胰岛素,使恒河猴血糖浓度为10_20mmol/L0
2.—种恒河猴糖尿病肾病模型的制备方法，其特征在于:包括如下步骤:(1)将剂量为80?100mg/kg的链脲菌素施用于恒河猴；(2)血糖浓度升高至11.lmmol/1后，饲喂高脂饲料，每天饲喂2次，饲喂量为0.3-0.4kg/次.只，并在餐前施用胰岛素，使恒河猴血糖浓度为10-20mmol/L，所述饲料包含如下重量配比的原料:标准猴饲料78份、动物油脂15份、糖5份、胆固醇2份。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于:步骤(I)中，所述的施用方式是静脉注射。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，所述的施用方式是皮下注射。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，所述动物油脂是猪油；所述糖是蔗糖。
6.一种建立恒河猴糖尿病肾病模型的饲料，其特征在于:它包含如下重量配比的原料:标准猴饲料78份、动物油脂15份、糖5份、胆固醇2份。
7.根据权利要求6所述的饲料，其特征在于:所述动物油脂是猪油；所述糖是蔗糖。
8.权利要求1?4任意一项所述方法制备的动物模型在筛选治疗恒河猴糖尿病肾病的药物中的用途。
9.一种筛选治疗恒河猴糖尿病肾病模型的药物的方法，其特征在于:它包括如下步骤:a、按照权利要求1?4任意一项所述方法，建立恒河猴糖尿病肾病模型；b、将候选药物施用于动物模型；C、用动物模型评价潜在的治疗恒河猴糖尿病肾病的药物。
【文档编号】A61K49/00GK103432572SQ201310250003
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年6月21日 优先权日:2013年6月21日
【发明者】陆燕蓉, 程惊秋, 陈又南, 刘敬平, 刘芳, 杨立川, 王莉, 李宏霞, 张 杰, 王丹, 何斯荣, 王成世, 史梅梅, 袁玉佳, 赵久茗 申请人:四川大学华西医院, 四川康城生物科技有限公司