具有450-490nm波长的LED-蓝光光源在骨肉瘤治疗中的应用的制作方法

本发明涉及450-490nm波长led-蓝光光源在骨肉瘤治疗中的应用。本发明属于光医学技术领域。

背景技术：

骨肉瘤是起源于骨间叶组织的原发性恶性骨肿瘤。其发病率约为原发性骨肿瘤的16.8％，而在原发性恶性骨肿瘤中占首位，约为40.5％。典型骨肉瘤多危及青少年，好发于男性，发病年龄多为10-25岁，6岁前及60岁之后少见；病死率极高。1970年以前标准治疗是截肢术，会造成残疾，易产生心理创伤，且5年生存率在15％左右。近年来，新辅助化疗的出现使骨肉瘤患者的存活率大大提高，但化疗药物的使用易产生多药耐药性，使疗效受限；保肢手术逐渐取代截肢手术，但手术治疗要求高，易产生重建效果不佳。因此，骨肉瘤仍是一种死亡率及致残率极高的肿瘤。所以急需一种安全有效的治疗手段。

光疗是近年来出现的一种新的治疗方法，目前已经有报道光疗可以引起多种生理功能和效应，本发明发明人从众多不同波长的led光源中筛选出450-490nm波长的led-蓝光，发现其对骨肉瘤细胞具有明显的抑制作用。进一步探究发现450-490nmled-蓝光具有抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移的特性。

本发明临床应用方便易行，降低治疗成本，能够减轻患者治疗痛苦，为骨肉瘤的治疗提供新思路。

技术实现要素：

本发明的目的是探究450-490nm波长led-蓝光光照骨肉瘤细胞对细胞生长、增殖、迁移、侵袭以及核损伤的影响，为骨肉瘤的治疗提供了新思路。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明通过离体培养结肠癌细胞系u2os，采用450-490nm波长的led-蓝光光源照射细胞，光照分组为0j/cm²，90j/cm²，180j/cm²，360j/cm²，720j/cm²和1440j/cm²。在光照24h后，应用台盼蓝染色，细胞计数和edu染色法检测450-490nmled-蓝光对骨肉瘤细胞生长增殖的影响；应用划痕实验检测细胞的迁移能力；应用transwell实验检测细胞的侵袭能力；应用γ-h2ax免疫荧光染色检测光照后细胞核损伤。实验结果表明，经过led-蓝光光照可有效抑制骨肉瘤细胞的生长、增殖，迁移和侵袭，并且诱导细胞核损伤。

因此，基于上述研究基础，本发明提出了具有450-490nm波长的led-蓝光光源在制备抑制骨肉瘤细胞生长和增殖的器械中的应用。以及

具有450-490nm波长的led-蓝光光源在制备抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭的器械中的应用。以及

具有450-490nm波长的led-蓝光光源在制备诱导骨肉瘤细胞细胞核损伤的器械中的应用。

其中，优选的，所述的肉瘤细胞为骨肉瘤细胞系u2os。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明通过具有450-490nm波长的led-蓝光照射就能够抑制骨肉瘤细胞的生长、增殖、迁移、侵袭以及诱导细胞核损伤，进而达到有效缓解和治疗骨肉瘤的目的。相较于传统治疗方法，本发明具有简单易行，医疗成本低，能够减轻患者治疗痛苦等优点。

附图说明

图1为450-490nmled-蓝光光照对u2os骨肉瘤细胞生长和增殖的影响；

在u2os骨肉瘤细胞中，应用led-蓝光分别光照0j/cm²，90j/cm²，180j/cm²，360j/cm²，720j/cm²和1440j/cm²，在光照后24h，进行台盼蓝染色，细胞计数。应用led-蓝光分别光照0j/cm²和360j/cm²，在光照后24h，进行edu染色，(a)显微镜下拍照；(b)活细胞总数；(c)死细胞百分率；(d)荧光显微镜下拍照；(e)edu阳性率；

图2为450-490nmled-蓝光光照对u2os骨肉瘤细胞迁移和侵袭的影响；

应用划痕实验，led-蓝光光照u2os骨肉瘤细胞分为光照0j/cm²和360j/cm²组，分别在光照后24h，48h和72h镜下观察并拍照检测细胞的迁移能力；应用transwell实验，分组同上，光照24h后进行结晶紫染色，检测细胞的侵袭能力；(a)显微镜下拍照；(b)细胞迁移距离的统计图；(c)transwell实验流程图；(d)镜下拍照；(e)结晶紫吸光度统计图；

图3为450-490nmled-蓝光光照诱导u2os细胞核损伤。

实验分为两组：led-蓝光光照0j/cm²组和360j/cm²组，24h后进行γ-h2ax免疫荧光染色，(a)荧光显微镜下拍照；(b)γ-h2ax阳性率统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例所涉及的材料及其来源：

1.主要试剂：台盼蓝试剂(biosharp公司)；edu染色试剂盒(ribobio公司)

2.主要仪器：countstar细胞计数仪；荧光倒置显微镜；倒置显微镜

实施例1：450-490nmled-蓝光光照抑制骨肉瘤细胞生长和增殖

1实验方法

1.1实验分组设计：

台盼蓝染色，细胞计数实验按照450-490nmled-蓝光光照强度分为以下六组:0j/cm²；90j/cm²；180j/cm²；360j/cm²，720j/cm²；1440j/cm²。分别照射同等细胞数量的u2os骨肉瘤细胞。edu染色实验分为以下两组：450-490nmled-蓝光光照0j/cm²组和光照360j/cm²组，分别照射同等细胞数量的u2os骨肉瘤细胞，光照后24h后进行edu免疫荧光染色，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2台盼蓝染色，细胞计数以及edu染色检测骨肉瘤细胞存活率

光照24h后，进行台盼蓝染色和细胞计数，分别统计活细胞数和死细胞率。按照led-蓝光光照功率实验分为两组：0j/cm²和360j/cm²，在光照后24h，进行edu染色，荧光显微镜下观察并拍照。

1.3数据处理

本发明的结果采用标准差±标准误来表示。用graphpadprism5.0进行作图，各组之间的相关性用t检验来衡量。

2观察结果

台盼蓝染色和细胞计数如图1a-c所示，从该结果可以看出，与0j/cm²光照组比，光照90j/cm²和180j/cm²组无明显变化，光照360j/cm²，720j/cm²和1440j/cm²组镜下细胞形态明显变圆变亮，并且死细胞率显著增加，活细胞数显著降低。

同时在u2os骨肉瘤细胞中，按照led-蓝光光照功率实验分为两组：0j/cm²和360j/cm²。光照24h后进行edu染色，统计光照前后骨肉瘤edu阳性比率。结果如图1d-e所示，从该结果可以看出，与0j/cm²光照组比，光照360j/cm²组edu阳性比率显著降低。

上述结果说明随着450-490nm波长led-蓝光光照强度的增强，骨肉瘤活细胞数明显降低，死细胞数和死细胞率明显升高。说明450-490nm波长led-蓝光光照能够抑制骨肉瘤细胞增殖。

实施例2：450-490nmled-蓝光光照抑制骨肉瘤细胞迁移

1实验方法

1.1实验分组设计：

实验分为2组：对照组(450-490nmled-蓝光光照0j/cm²)和450-490nmled-蓝光光照组(360j/cm²)，分别照射同等细胞数量的u2os骨肉瘤细胞，在光照后24h，48h和72h镜下观察并拍照记录细胞的迁移情况。

1.2划痕实验检测骨肉瘤细胞迁移能力

利用200μl枪头在u2os骨肉瘤细胞表面进行划痕，使划痕宽度尽量保持一致，分别在光照后24h，48h和72h显微镜下观察并拍照记录两侧细胞迁移情况。

1.3数据处理

本发明的结果采用标准差±标准误来表示。用graphpadprism5.0进行作图，各组之间的相关性用t检验来衡量。

2观察结果

划痕实验结果如图2a-b所示，与0j/cm²光照组比，360j/cm²光照组在光照24h后并细胞迁移距离无明显变化，随着时间推移，光照48h和72h后细胞迁移能力受到明显抑制。

实施例3：450-490nmled-蓝光光照抑制骨肉瘤细胞侵袭

1实验方法

1.1实验分组设计：

实验分为2组：对照组(450-490nmled-蓝光光照0j/cm²)和450-490nmled-蓝光光照组(360j/cm²)，分别照射同等细胞数量的u2os骨肉瘤细胞，在光照后24h检测细胞的侵袭情况。

1.2transwell实验检测骨肉瘤细胞侵袭能力

骨肉瘤细胞以2×10⁵个/ml的密度接种在上室，待细胞沉降后换为低血清的培养液，饥饿2h，下室换为正常完全培养液，光照24h后进行结晶紫染色并检测其吸光度。

1.3数据处理

本发明的结果采用标准差±标准误来表示。用graphpadprism5.0进行作图，各组之间的相关性用t检验来衡量。

2观察结果

如图2c-e所示，360j/cm²光照组颜色较0j/cm²光照组浅，且吸光度值显著降低。说明450-490nm波长led-蓝光光照能够抑制骨肉瘤细胞的侵袭。

实施例4：450-490nmled-蓝光光照诱导骨肉瘤细胞核损伤

1实验方法

1.1实验分组设计

实验分为2组：450-490nmled-蓝光光照0j/cm²组和光照360j/cm²组，分别照射同等细胞数量的u2os骨肉瘤细胞，光照后24h后进行γ-h2ax免疫荧光染色，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2γ-h2ax免疫荧光染色实验

u2os骨肉瘤细胞以相同的密度接种在孔板中，待细胞沉降后进行光照。24h后进行γ-h2ax免疫荧光染色，荧光显微镜下观察并拍照。

1.3数据处理

本发明的结果采用标准差±标准误来表示。用graphpadprism5.0进行作图，各组之间的相关性用t检验来衡量。

2观察结果

如图3所示，骨肉瘤细胞led-蓝光光照360j/cm²组骨肉瘤细胞的γ-h2ax的阳性率显著高于光照0j/cm²对照组。说明450-490nm波长led-蓝光光照能够诱导骨肉瘤细胞核损伤。