包埋GDNF的多核-单壳微球缓释系统的制备方法与流程

本发明属于高分子复合材料制备方法技术领域，具体涉及一种包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统的制备方法。

背景技术：

周围神经(peripheralnerve)自脑和脊髓发出，支配全身的肢体和器官，在中枢神经和相应的功能区域间发挥着传递神经信号的桥梁作用，包括12对脑神经和31对脊神经。在脊椎类动物的周围神经系统(peripheralnervoussystem，pns)中，轴突自神经元的胞体发出，内部含大量的微丝和微管，多数轴突被以雪旺细胞为主要成分的髓鞘(myelinsheath)包裹，起到一定的绝缘作用，保证了轴突高速传导电信号的功能；相邻雪旺细胞间的轴突裸露在外，称为郎飞结(nodeofranvier)。周围神经系统的神经纤维较之中枢神经系统(centralnervoussystem，cns)而言具有一定的再生能力，这也是区分周围神经系统和中枢神经系统的显著特征之一。

周围神经组织在各种致伤因素的作用下发生一系列病理生理学变化。周围神经受损后，远端轴突及其髓鞘发生变性、崩解和被巨噬细胞吞噬的现象，称为瓦勒氏变性；其中雪旺细胞分裂增殖后形成bungner带，具有引导再生轴突生长的作用，同时分泌多种神经营养因子包括：胶质细胞源性神经营养因子(glialcell-derivedneurotrophicfactor，gdnf)、神经生长因子(nervegrowthfactor，ngf)等，加快促进轴突再生和髓鞘形成；近端轴突发出轴芽，再由间充质细胞组成的间隙中向远端滑行，并逐渐长入远端的bungner带，随后向靶器官生长并形成突触连接，同时雪旺细胞使轴突髓鞘化，完成周围神经的再生过程。尽管周围神经损伤后具有一定的自我修复能力，但大量研究已证实这种自我修复能力非常有限，要想取得更好的神经再生修复效果，往往需要人为干预。

周围神经损伤后的神经再生是动态修复过程。激活神经元的内在生长能力并提供良好的再生微环境至关重要。激活并维持神经细胞的生物活性是早期修复神经损伤的重要前提。神经细胞在神经再生的过程中既可促进再生轴突生长，又可分泌大量的神经营养因子，为神经再生提供有效的微环境，从而促进周围神经再生。有学者提出“神经再生室”微环境的概念，即神经损伤后的近、远端以及间隙形成了具有促神经纤维再生的细胞、细胞外基质及神经营养物质等成分。在局部细胞成分中，增生的雪旺细胞可诱导神经再生，并为再生神经起到桥梁作用。基底膜内皮细胞有利于局部微血管的重建，从而尽早恢复神经再生和修复所依赖的血液循环。适量的巨噬细胞和成纤维细胞能促进局部损伤的修复和愈合。而随神经营养因子的发现，更加丰富了人们对再生微环境的认识。神经营养因子可逆向运输至神经元，起到维持神经营养的作用，并促进神经的修复和再生。然而，在周围神经再生的过程中，内在神经营养因子有限，半衰期短且易受到再生微环境的影响而失去生物活性，因此提供外源性的神经营养因子是必要的。有研究表明：局部提供外源性的神经营养因子能够保障再生轴突的幼芽到达远侧神经残端所需要的营养，促进早期健康的髓鞘形成，并对神经功能的恢复起到重要作用。

随着生物技术的发展，一系列具有神经营养作用的因子被逐一发现。按分子结构、受体类型等不同，将神经营养因子分为神经营养素家族和其他神经营养因子两大类；前者主要包括神经生长因子(nervegrowthfactor，ngf)、脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor，bdnf)、神经营养素-3，4，5，6，7(nt-3，4，5，6，7)，后者主要包括胶质细胞源性神经营养因子(glialcell-derivedneurotrophicfactor，gdnf)和睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophicfactor，cntf)。gdnf是从大鼠b49胶质细胞株中提纯的一个二硫键同源二聚体蛋白质，属于tgf-β超家族中的一个亚族，相对分子量约为32～42ku，存在n末端的糖基化，并含有分泌所需的信号序列。gdnf在全身包括神经组织在内的各种组织中均有表达，且在组织发育的不同阶段及神经组织损伤后再生过程中的不同阶段也有不同的表达水平。最初研究发现：gdnf具有维持中脑多巴胺能神经元生物活性的能力，而多巴胺能神经元受损后可诱发帕金森疾病。随后许多研究已经证实：gdnf是运动神经元最有力的营养因子之一，不管在体外还是体内的实验中，gdnf均能提高胚胎运动神经元的存活及分化，减少运动神经元的凋亡，具有明显的神经营养作用。gdnf还能支持感觉神经元的生长，促进鸡胚背根神经节的部分神经元存活，也可防止大鼠轴突离断后感觉神经元的死亡。除此以外，gdnf对神经退行性疾病具有潜在治疗作用，不仅可调控感觉神经元和运动神经元的生物活性，还可促进轴突再生，减少反应性增多的星形细胞及巨噬细胞的数量。

鉴于gdnf的上述优点，一些学者尝试应用外源性的gdnf修复周围神经缺损，取得了一定的神经修复效果。patel等学者将层粘连蛋白-1和5μggdnf复合于壳聚糖神经支架，修复大鼠10mm坐骨神经缺损模型，移植12周后，与自体神经移植组相比，gdnf移植组可减少大鼠腓肠肌萎缩，恢复腓肠肌的运动功能，提高步态运动指数，在一定程度上恢复大鼠移植侧的肢体感觉功能；li等学者将gdnf基因修饰的雪旺细胞结合于硅树脂导管，修复大鼠10mm坐骨神经缺损模型，实验结果表明：与对照组相比，上述导管组可显著提高神经传导速度，增加再生神经的数量、密度及髓鞘厚度；fine等学者将gdnf复合人工神经导管，修复大鼠15mm坐骨神经缺损模型，实验结果表明：与复合ngf导管组相比，gdnf导管组可显著增加有髓轴突的数量和再生轴突的总数。然而，神经营养因子的生物半衰期短，易失去生物活性，这些生物学特点要求必须持续给予营养因子才能达到维持治疗的效果。tannermaat等学者利用病毒载体成功诱导ngf和gdnf高表达，对大鼠坐骨神经缺损部位进行修复，实验结果发现：营养因子的高表达持续至4周。但令人遗憾的是，上述两种缓释方法均不能显著增加逆行示踪标记的运动神经元数量，过度表达gdnf可减少轴突的再生数量。因此，寻找一种有效的蛋白药物缓释载体至关重要，这种载体不仅需要具有保护蛋白药物的生物活性免受外界环境破坏的能力，还需要具有提高蛋白药物生物利用率的能力。

微球缓释系统是一种保护并延长神经营养因子生物活性的有效载体，很多生物活性药物无法直接使用或直接使用后效果不理想，尤其是多肽、蛋白质等生物大分子，在输送的过程中应用受限，需用一种或几种载体材料来包埋药物。根据药物的活性、亲水与否、半衰期长短，并通过合理设计微球的大小、表面性质、膜壁特点、药物缓释性能等来达到在合适的时间和地点，以所需的速度释放出药物，被称为药物输送系统。有多种材料可用来制备药物缓释载体，寻找理想的载体材料一直是众多学者研究的热点。传统的缓释载体材料包括胶原、明胶及水凝胶等，但远未达到临床上药物治疗和组织修复的要求。

近年来，随着高分子人工材料的迅速发展，越来越多的学者将其用于药物的靶向治疗和医学组织工程领域。这些高分子人工材料主要包括：聚乳酸(polylactide，pla)、聚乙醇酸(polyglycolide，pga)及聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(poly(lactide-co-glycolide)，plga)等。其中，plga是最受关注的一种人工材料，已经获得美国食品与药物管理局批准，在临床得到广泛应用。应用plga制备的微球具有以下优点：(1)有可控的药物缓释动力学，缓释药物的时间从数天至数月不等；(2)plga具有良好的生物相容性和完全的生物可降解性；(3)通过注射器可将包埋蛋白药物的plga微球注射到需要给药的部位。

目前可通过多种方法制备plga微球，主要有溶剂蒸发法、溶剂去除法、喷雾干燥法及凝聚加工法等，其中双层乳液法(water-in-oil-in-water，w/o/w)是一种最有效的plga微球制备方法。尽管plga微球具有良好的生物性能，然而内在的一些性质限制了在周围神经损伤修复中的广泛应用。应用这种方法制备的plga微球具有很高的“突释量”，可快速将包埋的蛋白药物释放到周围环境中。药物“突释量”即包埋的蛋白药物在24h后的释放量，主要与蛋白药物从plga聚合体基质内快速扩散和有效的载药率相关。过高的“突释量”不仅可降低蛋白药物的有效作用时间，从治疗和经济学方面降低药效，还可导致缓释的蛋白药物接近或者超过中毒剂量。

现阶段主要有两种方法可降低plga微球的“突释量”。第一种方法是改进制备工艺，如：利用表面涂覆技术可阻止药物快速从plga聚合体基质内扩散到周围环境中。pekarek等学者将组织纤溶酶原激活剂包埋在plga微球中，并在微球表面涂覆薄层壳聚糖材料，这种方法可显著降低plga微球的“突释量”，进一步提高溶栓的效果；freitas等学者利用一种静态微混合器，采用一步法制备工艺，在不使用表面活性剂的情况下制备出一种表面涂覆薄层聚合电解质的壳聚糖，这有利于具有生物活性配体的共价连接。wang等学者采用逐层沉淀技术，在plga微球表面间断涂覆约1μm厚的丝蛋白层，这种技术不仅可使plga微球的降解速度减慢，还可使包埋的蛋白缓释率降低。第二种方法是通过改变多聚物的成分，提高蛋白药物与多聚体的互溶性。许多研究者通过使用稳定剂的方法来提高蛋白药物与多聚体的互溶性，预防蛋白药物变性。kamiya等学者利用多种人工聚合电解质来调节蛋白药物从离子络合物缓释的动力学性质，研究结果显示：聚合电解质的性质在很大程度上可以控制蛋白药物的缓释率。lee等学者采用双层乳化法，将以离子络合物形式结合的溶菌酶-软骨素硫酸盐混合物包埋于plga微球，实验结果表明：从plga微球内缓释的溶菌酶接近零级动力学，这主要与软骨素硫酸盐的含量有关。其次，plga微球在降解的过程中产生大量的酸性降解产物，如：乳酸、羟乙酸等，不仅使包埋的蛋白药物发生变性、凝聚及化学降解，还可以降低周围微环境的ph值，从而产生很多负面效应，限制周围神经的再生。

通过对上述文献的回顾，结合在前期研发的壳聚糖缓释微球制备工艺，拟利用壳聚糖的弱碱性特点，在制备包埋gdnf的plga微球基础之上，研发一种包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统的制备方法，制备出的系统能中和plga微球的酸性降解产物，改善酸性微环境，给受损神经局部提供良好的再生环境。

本发明所采用的技术方案是，包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、将gdnf溶液、多库酯钠及人血清白蛋白溶于蒸馏水中制备出内水相w1；将plga溶于二氯甲烷中制备油相o1；将聚山梨醇酯80与水的混合制备出外层水相w2；将内水相w1分散于油相o1中，经超声分散后制备出初乳液w1/o1；将初乳液w1/o1与外层水相w2混合，经超声分散后制备出双层终乳液w1/o1/w2；对双层终乳液进行搅拌，待完全固化后得到包埋gdnf的plga微球；

步骤2、将经步骤1制备出的包埋gdnf的plga微球依次进行冲洗、离心及冰冻干燥处理；

步骤3、利用壳聚糖粉末和冰醋酸水溶液制备壳聚糖溶液；将经步骤2处理后得到的包埋gdnf的plga微球溶解于水中配制成plga微球水溶液；将plga微球水溶液添加到壳聚糖溶液中制备出水相w；将液体石蜡油与表面活性剂混合制备出油相o；将水相w与油相o混合制备出水/油乳浊液w/o；将三聚磷酸钠溶液与水/油乳浊液w/o混合制备出乳浊液；对乳浊液清洗，得到包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统。

本发明的特点还在于：

步骤1具体按照以下步骤实施：

步骤1.1、于2℃～4℃条件下，将60μl～100μlgdnf溶液、100mg～120mg多库酯钠及7mg～8mg人血清白蛋白共同溶解于0.5ml蒸馏水中，制备出内水相w1；

将0.6g～1.0gplga溶于6ml二氯甲烷中，制备出油相o1；

将0.6mg聚山梨醇酯80与60ml～70ml水的混合均匀，制备出外层水相w2；

步骤1.2、经步骤1.1后，将内水相w1分散于油相o1中，用超声细胞粉碎机超声分散10s～15s，之后暂停10s～15s；再重复这一过程两次，得到初乳液w1/o1；

步骤1.3、将经步骤1.2得到的初乳液w1/o1添加到步骤1.1中制备的外层水相w2中，用超声细胞粉碎机超声分散10s～15s，之后暂停10s～15s，重复这一过程两次，制备出双层终乳液w1/o1/w2；

步骤1.4、将经步骤1.3制备得到的双层终乳液采用磁力搅拌器均匀搅拌2h～3h，充分蒸发有机溶剂后完全固化，得到包埋gdnf的plga微球。

步骤1.1中的lgdnf溶液，其浓度为0.1mg/ml。

步骤1.2中：超声细胞粉碎机的输出功率为100w～150w，工作频率为15khz～20khz；步骤1.3中：超声细胞粉碎机的输出功率为300w～500w，工作频率为20khz～40khz。

步骤1.4中：磁力搅拌器的搅拌速度为500rmp/min～800rmp/min。

步骤2中：冲洗时采用的是水，水的温度为18℃～20℃，冲洗3～4次。

步骤2中冰冻干燥的过程如下：

先将plga微球先放置于-20℃冰箱中过夜，然后放置于真空干燥机内24h～36h，即得到干燥的plga微球。

步骤3具体按照以下步骤实施：

步骤3.1、经步骤2后，于2℃～4℃条件下，将100mg～120mg壳聚糖粉末溶解于10ml～12ml冰醋酸水溶液中，制备出壳聚糖溶液；

将经步骤2处理后得到的包埋gdnf的plga微球溶解于水中配制成2ml～4ml的plga微球水溶液，其中包埋gdnf的plga微球含量为36mg；

步骤3.2、将步骤3.1中制备出的plga微球水溶液添加到壳聚糖溶液中，搅拌均匀后制备出水相w；

将100ml～120ml液体石蜡油与表面活性剂span80依次注入容器内，采用机械搅拌均匀，搅拌速度控制为300rmp/min～500rmp/min，制备得到油相o；

步骤3.3、经步骤3.2后，于4℃条件下，将水相w逐滴加入油相o中，并机械搅拌1h～2h，机械搅拌的速度为1000rmp/min～1200rmp/min，制备出水/油乳浊液w/o；

步骤3.4、将20ml～25ml的三聚磷酸钠溶液逐滴添加到经步骤3.3制备出的水/油乳浊液w/o中，机械搅拌1h～2h，机械搅拌的速度为1000rmp/min～1200rmp/min，制备出乳浊液；

步骤3.5、将经步骤3.4制备出的乳浊液依次用石油醚、异丙醇以及双蒸水清洗，得到包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统。

步骤3.4中，三聚磷酸钠溶液的体积百分比浓度为3％～10％。

步骤3.5中：用石油醚清洗的次数为3～4次；用异丙醇清洗的次数为3～4次；用双蒸水清洗的次数为3～4次；冰冻干燥的条件为：-60～-80℃，100mtorr～120mtorr、6h～12h。

本发明的有益效果在于：

(1)利用本发明的制备方法能制备出包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统，该系统能中和plga微球的酸性降解产物，改善酸性微环境，给受损神经局部提供良好的再生环境，该系统还能降低plga微球的“突释量”，持续可控性缓慢释放具有生物活性的gdnf；

(2)本发明的制备方法，为临床应用gdnf，或将其复合于组织工程支架修复周围神经损伤，提供一种新的思路和治疗策略，具有重要的临床意义。

附图说明

图1是利用本发明的制备方法制备出的包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统的扫描电镜图；

图2是利用本发明的制备方法制备出的包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统的ph值检测示意图；

图3是利用本发明的制备方法制备出的包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统的缓释率检测示意图；

图4是利用本发明的制备方法制备出的包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统的体外pc12细胞生物活性检测示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明详细说明。

本发明包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、将gdnf溶液、多库酯钠及人血清白蛋白溶于蒸馏水中制备出内水相w1；将plga溶于二氯甲烷中制备油相o1；将聚山梨醇酯80与水的混合制备出外层水相w2；将内水相w1分散于油相o1中，经超声分散后制备出初乳液w1/o1；将初乳液w1/o1与外层水相w2混合，经超声分散后制备出双层终乳液w1/o1/w2；对双层终乳液进行搅拌，待完全固化后得到包埋gdnf的plga微球，具体按照以下步骤实施：

步骤1.1、于2℃～4℃条件下，将60μl～100μlgdnf溶液(浓度为0.1mg/ml)、100mg～120mg多库酯钠及7mg～8mg人血清白蛋白共同溶解于0.5ml蒸馏水中，制备出内水相w1；

将0.6g～1.0gplga溶于6ml二氯甲烷中，制备出油相o1；

将0.6mg聚山梨醇酯80与60ml～70ml水的混合均匀，制备出外层水相w2；

步骤1.2、经步骤1.1后，将内水相w1分散于油相o1中，用超声细胞粉碎机超声分散10s～15s，之后暂停10s～15s；再重复这一过程两次，得到初乳液w1/o1；

其中，超声细胞粉碎机的输出功率为100w～150w，工作频率为15khz～20khz；

步骤1.3、将经步骤1.2得到的初乳液w1/o1添加到步骤1.1中制备的外层水相w2中，用超声细胞粉碎机超声分散10s～15s，之后暂停10s～15s，重复这一过程两次，制备出双层终乳液w1/o1/w2；

其中，超声细胞粉碎机的输出功率为300w～500w，工作频率为20khz～40khz；

步骤1.4、将经步骤1.3制备得到的双层终乳液采用磁力搅拌器均匀搅拌2h～3h，充分蒸发有机溶剂后完全固化，得到包埋gdnf的plga微球；

其中，磁力搅拌器的搅拌速度为500rmp/min～800rmp/min。

步骤2、将经步骤1制备出的包埋gdnf的plga微球依次进行冲洗、离心及冰冻干燥处理，再储存于冰箱内；

其中，冲洗时采用的是水，水的温度为18℃～20℃，冲洗3～4次；

采用离心机进行离心处理，其目的在于：充分清洗有机溶剂，使plga微球沉淀，便于分离；

冰冻干燥的过程如下：

先将plga微球先放置于-20℃冰箱中过夜，然后放置于真空干燥机内24h～36h，即得到干燥的plga微球；

存储时冰箱内的温度控制为4℃。

步骤3、利用壳聚糖粉末和冰醋酸水溶液制备壳聚糖溶液；将经步骤2处理后得到的包埋gdnf的plga微球溶解于水中配制成plga微球水溶液；将plga微球水溶液添加到壳聚糖溶液中制备出水相w；将液体石蜡油与表面活性剂混合制备出油相o；将水相w与油相o混合制备出水/油乳浊液w/o；将三聚磷酸钠溶液与水/油乳浊液w/o混合制备出乳浊液；对乳浊液清洗，得到包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统，具体按照以下步骤实施：

步骤3.1、经步骤2后，于2℃～4℃条件下，将100mg～120mg壳聚糖粉末溶解于10ml～12ml冰醋酸水溶液中，制备出壳聚糖溶液；

将经步骤2处理后得到的包埋gdnf的plga微球溶解于水中配制成2ml～4ml的plga微球水溶液，其中包埋gdnf的plga微球含量为36mg；

步骤3.2、将步骤3.1中制备出的plga微球水溶液添加到壳聚糖溶液中，搅拌均匀后制备出水相w；

将100ml～120ml液体石蜡油与表面活性剂span80依次注入容器内(三口烧瓶内)，采用机械搅拌均匀，搅拌速度控制为300rmp/min～500rmp/min，制备得到油相o；

步骤3.3、经步骤3.2后，于4℃条件下，将水相w逐滴加入油相o中，并机械搅拌1h～2h，制备出水/油乳浊液w/o；

其中，机械搅拌的速度为1000rmp/min～1200rmp/min；

步骤3.4、将20ml～25ml的三聚磷酸钠(stpp)溶液逐滴添加到经步骤3.3制备出的水/油乳浊液w/o中，机械搅拌1h～2h，制备出乳浊液；

其中，三聚磷酸钠(stpp)溶液的体积百分比浓度为3％～10％；

机械搅拌的速度为1000rmp/min～1200rmp/min；

步骤3.5、将经步骤3.4制备出的乳浊液依次用石油醚、异丙醇以及双蒸水清洗，得到包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统，并将其冰冻干燥后储存于冰箱中；

用石油醚清洗的次数为3～4次；

用异丙醇清洗的次数为3～4次；

用双蒸水清洗的次数为3～4次；

冰冻干燥的条件为：-60～-80℃，100mtorr～120mtorr、6h～12h；

冰箱内的温度为4℃。

实验验证：

(一)扫描电镜检测：

为了评估制备出的包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统的表面形态特征，对其进行扫描电镜检测；

检测方法如下：将冰冻干燥的包埋gdnf的多核-单壳微球系统均匀粘附在固定装置上，喷金干燥后入镜观察；扫描电镜结果如图1所示，包埋gdnf的多核-单壳微球的表面可以观察到很多隆起的小微球，即包埋gdnf的plga微球，这说明包埋gdnf的多核-单壳微球制备成功。

(二)体外ph值检测：

为了评估制备出的包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统是否能有效中和plga微球的酸性降解产物，对其降解溶液进行了ph值检测，具体检测方法如下：

将20mg包埋gdnf的plga微球、包埋gdnf的多核-单壳微球分别加入5ml的pbs溶液中(ph7.4)并搅拌，在特定的时间点，将降解液离心10min，离心速度为800rpm，待离心处理完成后提取上清液并应用zdj–4a自动电位滴定器检测，所有的样本检测三次。

ph值检测结果如图2所示：包埋gdnf的多核-单壳微球在12周内ph值始终保持在7.3～7.4之间；而包埋gdnf的plga微球在经历12周的降解后，ph值从7.3降低为2，这说明：包埋gdnf的plga/壳聚糖多核-单壳微球可有效中和plga微球的酸性降解产物。

(三)体外微球缓释动力学测定：

检测方法如下：将20mg的包埋gdnf的plga微球、20mg的包埋gdnf的多核-单壳微球各溶解于6mlpbs溶液中(ph值为7.4)；将该样本放入37℃恒温摇床匀速摇动(速度为100rmp/min)；在不同的预设时间点(1天、15天、30天、45天、60天及90天)，对该样本进行离心处理10min(离心速度为13500rmp/min)；从离心后的样本中吸取200μl缓释液，将其冷藏于-20℃冰箱，再向样本中添加200μlpbs，继续匀速摇动；对不同时间点吸取的缓释液进行酶联免疫吸附试验分析。

微球缓释动力学结果如图3所示：与包埋gdnf的plga微球相比，包埋gdnf的多核-单壳微球可显著降低gdnf的“突释率”，持续缓释gdnf达84天，说明该制备方法可显著降低包埋药物的“突释率”，持续缓慢释放。

(四)缓释液中gdnf的生物活性测定：

方法具体为：将pc12细胞以1×10⁵细胞/每毫升的密度培养于10ml培养液中(rpmi1640、10％马血清、5％胎牛血清及1％青链霉素)；随后将pc12细胞以1×10⁴细胞/每孔的密度接种于含1ml培养液24孔培养板内；将不同时间点吸取的缓释液分别加入24孔培养板，在培养箱中培养3天；在光学显微镜下对分化为神经元表型的pc12细胞进行计数，每孔至少计数100个细胞；10ng/mlgdnf作为阳性对照组，单纯细胞培养液(无gdnf)作为阴性对照组。

生物活性测定结果如图4所示，包埋gdnf的多核-单壳微球(包埋50nggdnf)与阳性对照组(40nggdnf组)相比无统计学差异，与阴性对照组相比(无gdnf)，有显著差异，这说明：包埋gdnf的多核-单壳微球可有效缓释具有生物活性的gdnf。

(五)统计方法，具体如下：

以上实验均重复至少三次，统计学分析两组间均数差异的比较采用student’s2-tailedt-test检验，组间多重比较采用anova分析，各组间比较采用dunnett-tmodification检验。

统计学软件采用graphpadsoftware(美国cricketsoftware公司)，p<0.05认为有统计学差异。

实施例1

于2℃条件下，将60μlgdnf溶液(浓度为0.1mg/ml)、100mg多库酯钠及7mg人血清白蛋白共同溶解于0.5ml蒸馏水中，制备出内水相w1；将0.6gplga溶于6ml二氯甲烷中，制备出油相o1；将0.6mg聚山梨醇酯80与60ml水的混合均匀，制备出外层水相w2；将内水相w1分散于油相o1中，用超声细胞粉碎机超声分散10s，之后暂停10s；再重复这一过程两次，得到初乳液w1/o1，超声细胞粉碎机的输出功率为100w，工作频率为15khz；将初乳液w1/o1添加到外层水相w2中，用超声细胞粉碎机超声分散10s，之后暂停10s，重复这一过程两次，制备出双层终乳液w1/o1/w2，超声细胞粉碎机的输出功率为300w，工作频率为20khz；将制备得到的双层终乳液采用磁力搅拌器均匀搅拌2h，充分蒸发有机溶剂后完全固化，得到包埋gdnf的plga微球，磁力搅拌器的搅拌速度为500rmp/min；

将制备出的包埋gdnf的plga微球依次进行冲洗、离心及冰冻干燥处理，再储存于冰箱内；其中，冲洗时采用的是水，水的温度为18℃，冲洗3次；采用离心机进行离心处理；冰冻干燥的过程为：先将plga微球先放置于-20℃冰箱中过夜，然后放置于真空干燥机内24h，即得到干燥的plga微球；存储时冰箱内的温度控制为4℃；

于2℃条件下，将100mg壳聚糖粉末溶解于10ml冰醋酸水溶液中，制备出壳聚糖溶液；将得到的包埋gdnf的plga微球溶解于水中配制成2ml的plga微球水溶液，其中包埋gdnf的plga微球含量为36mg；将制备出的plga微球水溶液添加到壳聚糖溶液中，搅拌均匀后制备出水相w；将100ml液体石蜡油与表面活性剂span80依次注入容器内(三口烧瓶内)，采用机械搅拌均匀，搅拌速度控制为300rmp/min，制备得到油相o；于4℃条件下，将水相w逐滴加入油相o中，并机械搅拌1h，制备出水/油乳浊液w/o，机械搅拌的速度为1000rmp/min；将20ml的三聚磷酸钠溶液逐滴添加到制备出的水/油乳浊液w/o中，机械搅拌1h，制备出乳浊液；其中，三聚磷酸钠溶液的体积百分比浓度为3％，机械搅拌的速度为1000rmp/min；将制备出的乳浊液依次用石油醚、异丙醇以及双蒸水清洗，得到包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统，并将其冰冻干燥后储存于冰箱中；用石油醚清洗的次数为3次，用异丙醇清洗的次数为3次，用双蒸水清洗的次数为3次；冰冻干燥的条件为：-60℃，100mtorr、6h；冰箱内的温度为4℃。

实施例2

于2℃条件下，将70μlgdnf溶液(浓度为0.1mg/ml)、105mg多库酯钠及7mg人血清白蛋白共同溶解于0.5ml蒸馏水中，制备出内水相w1；将0.7gplga溶于6ml二氯甲烷中，制备出油相o1；将0.6mg聚山梨醇酯80与62ml水的混合均匀，制备出外层水相w2；将内水相w1分散于油相o1中，用超声细胞粉碎机超声分散11s，之后暂停11s；再重复这一过程两次，得到初乳液w1/o1，超声细胞粉碎机的输出功率为110w，工作频率为16khz；将初乳液w1/o1添加到外层水相w2中，用超声细胞粉碎机超声分散11s，之后暂停11s，重复这一过程两次，制备出双层终乳液w1/o1/w2，超声细胞粉碎机的输出功率为350w，工作频率为25khz；将制备得到的双层终乳液采用磁力搅拌器均匀搅拌2h，充分蒸发有机溶剂后完全固化，得到包埋gdnf的plga微球，磁力搅拌器的搅拌速度为600rmp/min；

将制备出的包埋gdnf的plga微球依次进行冲洗、离心及冰冻干燥处理，再储存于冰箱内；其中，冲洗时采用的是水，水的温度为18℃，冲洗4次；采用离心机进行离心处理；冰冻干燥的过程为：先将plga微球先放置于-20℃冰箱中过夜，然后放置于真空干燥机内28h，即得到干燥的plga微球；存储时冰箱内的温度控制为4℃；

于2℃条件下，将105mg壳聚糖粉末溶解于10.5ml冰醋酸水溶液中，制备出壳聚糖溶液；将得到的包埋gdnf的plga微球溶解于水中配制成2.5ml的plga微球水溶液，其中包埋gdnf的plga微球含量为36mg；将制备出的plga微球水溶液添加到壳聚糖溶液中，搅拌均匀后制备出水相w；将105ml液体石蜡油与表面活性剂span80依次注入容器内(三口烧瓶内)，采用机械搅拌均匀，搅拌速度控制为350rmp/min，制备得到油相o；于4℃条件下，将水相w逐滴加入油相o中，并机械搅拌1.5h，制备出水/油乳浊液w/o，机械搅拌的速度为1050rmp/min；将22ml的三聚磷酸钠溶液逐滴添加到制备出的水/油乳浊液w/o中，机械搅拌1.5h，制备出乳浊液；其中，三聚磷酸钠溶液的体积百分比浓度为5％，机械搅拌的速度为1050rmp/min；将制备出的乳浊液依次用石油醚、异丙醇以及双蒸水清洗，得到包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统，并将其冰冻干燥后储存于冰箱中；用石油醚清洗的次数为4次，用异丙醇清洗的次数为4次，用双蒸水清洗的次数为4次；冰冻干燥的条件为：-65℃，105mtorr、7h；冰箱内的温度为4℃。

实施例3

于3℃条件下，将80μlgdnf溶液(浓度为0.1mg/ml)、110mg多库酯钠及7.5mg人血清白蛋白共同溶解于0.5ml蒸馏水中，制备出内水相w1；将0.8gplga溶于6ml二氯甲烷中，制备出油相o1；将0.6mg聚山梨醇酯80与65ml水的混合均匀，制备出外层水相w2；将内水相w1分散于油相o1中，用超声细胞粉碎机超声分散13s，之后暂停13s；再重复这一过程两次，得到初乳液w1/o1，超声细胞粉碎机的输出功率为130w，工作频率为18khz；将初乳液w1/o1添加到外层水相w2中，用超声细胞粉碎机超声分散13s，之后暂停13s，重复这一过程两次，制备出双层终乳液w1/o1/w2，超声细胞粉碎机的输出功率为400w，工作频率为30khz；将制备得到的双层终乳液采用磁力搅拌器均匀搅拌2.5h，充分蒸发有机溶剂后完全固化，得到包埋gdnf的plga微球，磁力搅拌器的搅拌速度为700mp/min；

将制备出的包埋gdnf的plga微球依次进行冲洗、离心及冰冻干燥处理，再储存于冰箱内；其中，冲洗时采用的是水，水的温度为19℃，冲洗3次；采用离心机进行离心处理；冰冻干燥的过程为：先将plga微球先放置于-20℃冰箱中过夜，然后放置于真空干燥机内30h，即得到干燥的plga微球；存储时冰箱内的温度控制为4℃；

于3℃条件下，将110mg壳聚糖粉末溶解于11ml冰醋酸水溶液中，制备出壳聚糖溶液；将得到的包埋gdnf的plga微球溶解于水中配制成3ml的plga微球水溶液，其中包埋gdnf的plga微球含量为36mg；将制备出的plga微球水溶液添加到壳聚糖溶液中，搅拌均匀后制备出水相w；将110ml液体石蜡油与表面活性剂span80依次注入容器内(三口烧瓶内)，采用机械搅拌均匀，搅拌速度控制为400rmp/min，制备得到油相o；于4℃条件下，将水相w逐滴加入油相o中，并机械搅拌1.5h，制备出水/油乳浊液w/o，机械搅拌的速度为1100rmp/min；将23ml的三聚磷酸钠溶液逐滴添加到制备出的水/油乳浊液w/o中，机械搅拌1.5h，制备出乳浊液；其中，三聚磷酸钠溶液的体积百分比浓度为7％，机械搅拌的速度为1100rmp/min；将制备出的乳浊液依次用石油醚、异丙醇以及双蒸水清洗，得到包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统，并将其冰冻干燥后储存于冰箱中；用石油醚清洗的次数为4次，用异丙醇清洗的次数为4次，用双蒸水清洗的次数为4次；冰冻干燥的条件为：-70℃，110mtorr、9h；冰箱内的温度为4℃。

实施例4

于4℃条件下，将90μlgdnf溶液(浓度为0.1mg/ml)、115mg多库酯钠及8mg人血清白蛋白共同溶解于0.5ml蒸馏水中，制备出内水相w1；将0.9gplga溶于6ml二氯甲烷中，制备出油相o1；将0.6mg聚山梨醇酯80与68ml水的混合均匀，制备出外层水相w2；将内水相w1分散于油相o1中，用超声细胞粉碎机超声分散14s，之后暂停14s；再重复这一过程两次，得到初乳液w1/o1，超声细胞粉碎机的输出功率为140w，工作频率为19khz；将初乳液w1/o1添加到外层水相w2中，用超声细胞粉碎机超声分散14s，之后暂停14s，重复这一过程两次，制备出双层终乳液w1/o1/w2，超声细胞粉碎机的输出功率为450w，工作频率为35khz；将制备得到的双层终乳液采用磁力搅拌器均匀搅拌3h，充分蒸发有机溶剂后完全固化，得到包埋gdnf的plga微球，磁力搅拌器的搅拌速度为750rmp/min；

将制备出的包埋gdnf的plga微球依次进行冲洗、离心及冰冻干燥处理，再储存于冰箱内；其中，冲洗时采用的是水，水的温度为19℃，冲洗4次；采用离心机进行离心处理；冰冻干燥的过程为：先将plga微球先放置于-20℃冰箱中过夜，然后放置于真空干燥机内34h，即得到干燥的plga微球；存储时冰箱内的温度控制为4℃；

于4℃条件下，将115mg壳聚糖粉末溶解于11.5ml冰醋酸水溶液中，制备出壳聚糖溶液；将得到的包埋gdnf的plga微球溶解于水中配制成3.5ml的plga微球水溶液，其中包埋gdnf的plga微球含量为36mg；将制备出的plga微球水溶液添加到壳聚糖溶液中，搅拌均匀后制备出水相w；将115ml液体石蜡油与表面活性剂span80依次注入容器内(三口烧瓶内)，采用机械搅拌均匀，搅拌速度控制为450rmp/min，制备得到油相o；于4℃条件下，将水相w逐滴加入油相o中，并机械搅拌2h，制备出水/油乳浊液w/o，机械搅拌的速度为1150rmp/min；将24ml的三聚磷酸钠溶液逐滴添加到制备出的水/油乳浊液w/o中，机械搅拌2h，制备出乳浊液；其中，三聚磷酸钠溶液的体积百分比浓度为8％，机械搅拌的速度为1150rmp/min；将制备出的乳浊液依次用石油醚、异丙醇以及双蒸水清洗，得到包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统，并将其冰冻干燥后储存于冰箱中；用石油醚清洗的次数为3次，用异丙醇清洗的次数为3次，用双蒸水清洗的次数为3次；冰冻干燥的条件为：-75℃，115mtorr、11h；冰箱内的温度为4℃。

实施例4

于4℃条件下，将100μlgdnf溶液(浓度为0.1mg/ml)、120mg多库酯钠及8mg人血清白蛋白共同溶解于0.5ml蒸馏水中，制备出内水相w1；将1.0gplga溶于6ml二氯甲烷中，制备出油相o1；将0.6mg聚山梨醇酯80与70ml水的混合均匀，制备出外层水相w2；将内水相w1分散于油相o1中，用超声细胞粉碎机超声分散15s，之后暂停15s；再重复这一过程两次，得到初乳液w1/o1，超声细胞粉碎机的输出功率为150w，工作频率为20khz；将初乳液w1/o1添加到外层水相w2中，用超声细胞粉碎机超声分散15s，之后暂停15s，重复这一过程两次，制备出双层终乳液w1/o1/w2，超声细胞粉碎机的输出功率为500w，工作频率为40khz；将制备得到的双层终乳液采用磁力搅拌器均匀搅拌3h，充分蒸发有机溶剂后完全固化，得到包埋gdnf的plga微球，磁力搅拌器的搅拌速度为800rmp/min；

将制备出的包埋gdnf的plga微球依次进行冲洗、离心及冰冻干燥处理，再储存于冰箱内；其中，冲洗时采用的是水，水的温度为20℃，冲洗4次；采用离心机进行离心处理；冰冻干燥的过程为：先将plga微球先放置于-20℃冰箱中过夜，然后放置于真空干燥机内36h，即得到干燥的plga微球；存储时冰箱内的温度控制为4℃；

于4℃条件下，将120mg壳聚糖粉末溶解于12ml冰醋酸水溶液中，制备出壳聚糖溶液；将得到的包埋gdnf的plga微球溶解于水中配制成4ml的plga微球水溶液，其中包埋gdnf的plga微球含量为36mg；将制备出的plga微球水溶液添加到壳聚糖溶液中，搅拌均匀后制备出水相w；将120ml液体石蜡油与表面活性剂span80依次注入容器内(三口烧瓶内)，采用机械搅拌均匀，搅拌速度控制为500rmp/min，制备得到油相o；于4℃条件下，将水相w逐滴加入油相o中，并机械搅拌2h，制备出水/油乳浊液w/o，机械搅拌的速度为1200rmp/min；将25ml的三聚磷酸钠溶液逐滴添加到制备出的水/油乳浊液w/o中，机械搅拌2h，制备出乳浊液；其中，三聚磷酸钠溶液的体积百分比浓度为10％，机械搅拌的速度为1200rmp/min；将制备出的乳浊液依次用石油醚、异丙醇以及双蒸水清洗，得到包埋gdnf的多核-单壳微球缓释系统，并将其冰冻干燥后储存于冰箱中；用石油醚清洗的次数为4次，用异丙醇清洗的次数为4次，用双蒸水清洗的次数为4次；冰冻干燥的条件为：-80℃℃，120mtorr、12h；冰箱内的温度为4℃。

利用本发明的制备方法制备出的系统能中和plga微球的酸性降解产物，改善酸性微环境，给受损神经局部提供良好的再生环境；还能降低plga微球的“突释量”，持续可控性缓慢释放具有生物活性的gdnf。