一种氧化铁纳米粒在抑制单核细胞活化中的应用的制作方法

本发明涉及纳米材料的生物活性应用领域，具体涉及一种氧化铁纳米粒在抑制单核细胞活化中的应用。

背景技术：

已知外周血单核细胞是血液中一群来自骨髓、具有吞噬功能且体积最大的白细胞，是脊椎动物固有免疫系统的重要组成部分，参与适应性免疫功能，能分化为巨噬细胞等细胞。单核细胞经内毒素(lps)等刺激物刺激活化释放多种细胞因子，这些细胞因子可引起机体进一步炎症反应。

现有的非甾体抗炎药物(nsaid)如布洛芬、奈普生、塞来昔布和双氯芬酸等主要用于各种类型的关节炎和抗风湿等，临床使用广泛。但是，现有的非甾体抗炎药物也是不良反应较多的一类药物，尤其是长期大剂量应用时，不良反应发生率更高。例如，高血压患者服用非甾体抗炎药物会出现急性肾损伤的风险。美国fda早在2005年发出警告，长期使用会造成心脏病发作或者脑卒中风险，而且绝对不能同时服用两种或两种以上的非甾体抗炎药物。

磁性纳米材料具有优异的磁学等方面的性质，目前在生物医学研究领域得到广泛的关注，可以用做磁共振成像造影剂、药物载体，或用于治疗铁缺乏等，并且有部分产品已进入临床转化和临床试验，如fda批准的ferumoxytol等。

因此，以单核细胞为靶点，采用纳米材料作为单核细胞活化抑制剂具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种氧化铁纳米粒在抑制单核细胞活化中的应用。

本发明所提供的技术方案为：一种氧化铁纳米粒在抑制单核细胞活化中的应用。

优选的，所述单核细胞包括外周血单核细胞。

氧化铁纳米粒可以通过现有的制备方法制备得到。由于制备得到的氧化铁纳米粒往往是被非极性的有机相所包覆，在抑制单核细胞活化时，往往需要进行表面修饰，使其由油相转换成水相；优选的，采用磷脂peg进行表面修饰。

优选的，所述氧化铁纳米粒包括氧化铁纳米方块或氧化铁纳米球。所述氧化铁纳米方块的合成方法已经在2009年化学类top期刊j.am.chem.soc.中公开发表“d.kim,n.lee,m.park,b.h.kim,k.an,t.hyeon,j.am.chem.soc.2009,131,454-455.”，所述氧化铁纳米球已经在2007年chem.mater.杂志期刊中公开发表“l.m.bronstein,x.huang,j.retrum,a.schmucker,m.pink,b.d.stein,b.dragnea,chem.mater.2007,19,3624-3632.”。

优选的，所述氧化铁纳米方块的制备方法具体包括如下步骤：将乙酰丙酮铁，4-苯基苯甲酸，油酸和二苄醚混匀后，在氩气保护下280～300℃加热反应得到。进一步优选，所述将乙酰丙酮铁，4-苯基苯甲酸，油酸和二苄醚的质量比为1:0.5～0.6:1.7～1.8:14～15。

优选的，所述氧化铁纳米球的制备方法具体包括如下步骤：1)将氯化铁溶液和油酸钠溶液混匀，在氩气保护下60～80℃搅拌反应，得到油酸铁复合物；2)将油酸铁复合物，油酸和二十二烷混匀后，在380～400℃下加热反应得到。进一步优选，所述氯化铁和油酸钠的质量比为1:3～3.5。所述油酸铁复合物和油酸的投料比为2.5～3g:1ml。

本发明还提供一种氧化铁纳米粒在抑制单核细胞分泌细胞因子中的应用。

优选的，所述氧化铁纳米粒包括氧化铁纳米方块或氧化铁纳米球。

优选的，所述细胞因子包括tnf-α、il-1β或il-6。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：由于氧化铁纳米粒具有较好的生物安全性，使其能够用于单核细胞；此外，单分散氧化铁纳米粒可抑制单核细胞分泌多种细胞因子包括tnf-α、il-1β和il-6。

附图说明

图1为实施例1中氧化铁纳米球的tem图；

图2为实施例3中氧化铁纳米方块的tem图；

图3为应用例1中氧化铁纳米球的流式结果图；

图4为应用例2中氧化铁纳米球对单核细胞tnf-α分泌剂量依赖效应图；

图5为应用例3中氧化铁纳米球对thp-1和u937单核细胞株tnf-α、il-1和il-6分泌效应图；

图6为应用例4中氧化铁纳米球对单核细胞经lps刺激不同时间的tnf-α细胞因子分泌效应图；

图7为应用例5中氧化铁纳米方块的流式结果图；

图8为应用例6中氧化铁纳米方块对单核细胞tnf-α分泌剂量依赖效应图；

图9为应用例7中氧化铁纳米方块对thp-1和u937单核细胞株的tnf-α、il-1和il-6分泌效应图；

图10为应用例8中氧化铁纳米方块对单核细胞经lps刺激不同时间的tnf-α细胞因子分泌效应图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：氧化铁纳米球的合成

(1)油酸铁复合物的合成：

称取3.24g三氯化铁六水合物溶解在12ml去离子水中，然后过滤备用。称取10.95g油酸钠，24ml乙醇，6ml去离子水和42ml正己烷混合。然后将六水氯化铁溶液和油酸钠溶液混匀，在70℃氩气保护条件下搅拌4h。反应结束后，上层红色的有机相用分液漏斗分离，然后每次用9ml去离子水洗3次。然后在旋转蒸发仪上将正己烷旋干，得到的油酸铁复合物在真空条件下干燥24h。

(2)单分散氧化铁纳米球的合成：

称取2.78g油酸铁复合物，0.96ml油酸，10ml二十二烷加入到三颈烧瓶中。在60℃条件下加热使其溶解，然后以3.3℃/min的速率加热到370℃，在370℃条件下保持3min。然后快速冷却至50℃，加入10ml正己烷和40ml丙酮的混合溶剂使氧化铁纳米球沉淀出来，离心，洗涤3次，最后分散在氯仿中进行保存。

针对实施例1中的产物氧化铁纳米球进行tem表征，如图1所示，可知形貌为纳米球，尺寸约为22nm。

实施例2：氧化铁纳米球的表面修饰

量取实施例1中制备的氧化铁纳米球5mg，磷脂peg25mg，将两者溶于10ml氯仿中，然后在60℃条件下旋蒸1h，1h后加入pbs进行水化。

实施例3：氧化铁纳米方块的合成

称取乙酰丙酮铁0.706g，4-苯基苯甲酸0.4g，油酸1.27g和二苄醚10.4g，将其加入到三颈烧瓶中，然后室温条件下抽真空1个小时，然后通入氩气进行保护，从室温以20℃/min的速度加热至290℃，并在290℃保持30min。30min后，快速冷却至60℃，加入乙醇沉淀，最后用乙醇洗涤三次，将所得到的氧化铁纳米方块分散在氯仿中备用。

针对实施例3中的产物氧化铁纳米方块进行tem表征，如图2所示，可知形貌为纳米方块，尺寸约为25nm。

实施例4：氧化铁纳米方块的表面修饰

量取实施例3中制备的氧化铁纳米方块5mg，磷脂peg25mg，将两者溶于10ml氯仿中，然后在60℃条件下旋蒸1h，1h后加入pbs进行水化。

应用例1:单分散氧化铁纳米球的细胞毒性试验

单核细胞株thp-1经单分散氧化铁纳米球(50、100和200μg/ml)联合1μg/mllps，干预24h，采用bd公司的凋亡试剂盒用annexinv-fitc/pi双染细胞凋亡检测方法，用流式细胞术检测细胞存活情况，观察对细胞毒性影响。所用的仪器是bdc6型流式细胞仪。

具体步骤按照凋亡试剂盒的说明书操作，简要描述如下：(1)用去离子水将10×bindingbuffer稀释成1×bindingbuffer；(2)收集细胞：室温2000rpm离心5-10分钟；(3)细胞洗涤：用预冷1×pbs重悬细胞一次，2000rpm离心5-10分钟，洗涤细胞；(4)加入300μl的1×bindingbuffer悬浮细胞；(5)annexinv-fitc标记：加入5μl的annexinv-fitc混匀后，避光，室温孵育15min；(6)pi标记：上机前5分钟再加入5μl的pi染色；(7)上机前，补加200μl的1×bingdingbuffer。

结果如图3a所示，氧化铁纳米球200μg/ml联合1μg/mllps的细胞凋亡流式代表图，可见即使联合lps，sphere对细胞活力影响很小。

如图3b所示，氧化铁纳米球(50、100和200μg/ml)联合1μg/mllps的细胞存活、凋亡和死亡比例。

由上述结果可得出结论，与空白对照组相比，单分散氧化铁纳米球对细胞无毒性。

应用例2:单分散氧化铁纳米球对单核细胞的tnf-α细胞因子分泌能力的剂量依赖效应

将单分散氧化铁纳米球以25、50和100μg/ml浓度先干预单核细胞株thp-130min，再经1μg/mllps刺激3h，采用elisa检测细胞上清液中tnf-α水平，所用的仪器是美国bio-rad伯乐酶标仪imark吸收光标酶标仪，所用试剂是tnf-αelisa试剂盒，具体步骤按照说明书操作。

如图4所示，与lps组相比，单分散氧化铁纳米球显著抑制lps刺激单核细胞的细胞因子分泌能力，具有显著性差异，而且具有剂量依赖效应。

而且单分散氧化铁纳米球预保护30min比lps刺激30min后再用单分散氧化铁纳米球干预的抑制效果更好，其中高剂量100μg/ml预保护的tnf-α抑制效果最好。

应用例3:单分散氧化铁纳米球对多种单核细胞株的多种细胞因子分泌能力

1μg/mllps刺激单核细胞株thp-1和u93730min后，将100μg/ml单分散氧化铁纳米球干预24h，采用elisa检测细胞上清液中tnf-α、il-1和il-6水平，所用的仪器是美国bio-rad伯乐酶标仪imark吸收光标酶标仪，所用试剂是tnf-α、il-1和il-6elisa试剂盒，具体步骤按照说明书操作。

如图5所示，与lps组相比，单分散氧化铁纳米球显著抑制lps刺激两种单核细胞株的多种细胞因子分泌能力，具有显著性差异。

应用例4:单分散氧化铁纳米球对lps刺激不同时间单核细胞株的细胞因子分泌能力

将单分散氧化铁纳米球以100μg/ml浓度干预经1μg/mllps刺激0min、30min、60min和6h后的单核细胞株thp-1，采用elisa检测细胞上清液中tnf-α水平，所用的仪器是美国bio-rad伯乐酶标仪imark吸收光标酶标仪，所用试剂是tnf-αelisa试剂盒，具体步骤按照说明书操作。

如图6所示，与lps组相比，单分散氧化铁纳米球显著抑制lps刺激单核细胞株thp-1的tnf-α细胞因子分泌能力，具有显著性差异，而且具有时间依赖效应，lps刺激时间越长，纳米球干预的tnf-α细胞因子抑制分泌能力越弱，单核细胞株thp-1经1μg/mllps刺激60min和6h后，纳米球抑制tnf-α细胞因子分泌能力，无显著差异。

应用例5:单分散氧化铁纳米方块的细胞毒性试验

取50、100和200μg/ml氧化铁纳米方块联合1μg/mllps，干预单核细胞株thp-124h，采用凋亡试剂盒用annexinv-fitc/pi双染细胞凋亡检测方法，用流式细胞术检测细胞存活情况，观察对细胞毒性影响。所用的仪器是bdc6型流式细胞仪。

具体步骤按照凋亡试剂盒的说明书操作，简要描述如下：(1)用去离子水将10×bindingbuffer稀释成1×bindingbuffer；(2)收集细胞：室温2000rpm离心5-10分钟；(3)细胞洗涤：用预冷1×pbs重悬细胞一次，2000rpm离心5-10分钟，洗涤细胞；(4)加入300μl的1×bindingbuffer悬浮细胞；(5)annexinv-fitc标记：加入5μl的annexinv-fitc混匀后，避光，室温孵育15min；(6)pi标记：上机前5分钟再加入5μl的pi染色；(7)上机前，补加200μl的1×bingdingbuffer。

结果如图7a所示，氧化铁纳米方块200μg/ml联合1μg/mllps的细胞凋亡流式代表图，可见即使联合lps，cube对细胞活力影响很小。

如图7b所示，氧化铁纳米方块(50、100和200μg/ml)联合1μg/mllps的细胞存活、凋亡和死亡比例。

由上述结果可得出结论，与空白对照组相比，单分散氧化铁纳米方块对细胞无毒性。

应用例6:单分散氧化铁纳米方块对单核细胞的tnf-α细胞因子分泌能力的剂量依赖效应

将氧化铁纳米方块以25、50和100μg/ml浓度干预经1μg/mllps刺激的单核细胞株thp-13h，采用elisa检测细胞上清液中tnf-α水平，所用的仪器是美国bio-rad伯乐酶标仪imark吸收光标酶标仪，所用试剂是tnf-αelisa试剂盒，具体步骤按照说明书操作。

如图8所示，与lps组相比，氧化铁纳米方块显著抑制lps刺激单核细胞的细胞因子分泌能力，具有显著性差异，而且具有剂量依赖效应。

而且cube预保护30min比lps刺激30min后再用cube干预的抑制效果更好，其中高剂量100μg/ml的tnf-α抑制效果最好。

应用例7:单分散氧化铁纳米方块对多种单核细胞株的多种细胞因子分泌能力

将氧化铁纳米方块以100μg/ml浓度干预经1μg/mllps刺激30min后的单核细胞株thp-1和u93724h，采用elisa检测细胞上清液中tnf-α、il-1和il-6水平，所用的仪器是美国bio-rad伯乐酶标仪imark吸收光标酶标仪，所用试剂是tnf-α、il-1和il-6elisa试剂盒，具体步骤按照说明书操作。

如图9所示，与lps组相比，氧化铁纳米方块显著抑制lps刺激两种单核细胞株的多种细胞因子分泌能力，具有显著性差异。

应用例8:单分散氧化铁纳米方块对lps刺激不同时间单核细胞株的细胞因子分泌能力

将氧化铁纳米方块以100μg/ml浓度干预经1μg/mllps刺激0min、30min、60min和6h后的单核细胞株thp-1，采用elisa检测细胞上清液中tnf-α水平，所用的仪器是美国bio-rad伯乐酶标仪imark吸收光标酶标仪，所用试剂是tnf-αelisa试剂盒，具体步骤按照说明书操作。

如图10所示，与lps组相比，氧化铁纳米方块显著抑制lps刺激单核细胞株thp-1的tnf-α细胞因子分泌能力，具有显著性差异，而且具有时间依赖效应，lps刺激时间越长，纳米颗粒干预的tnf-α细胞因子抑制分泌能力越弱。