本发明涉及兽药领域，具体而言，涉及一种复方甲紫溶液及其制备方法和应用。
背景技术：
蹄是支持牛体的基础，是牛重要的支持器官和运动器官，通过蹄的运动可促进血液循环，发挥重要的血泵功能。而蹄病则是危害世界乳牛业的三大疾病之一，与乳房炎和繁殖力降低构成奶牛饲养业三大制约因素。
腐蹄病是蹄病中的一种，在我国各地的饲养单位都表现出较高的发病率。同时，腐蹄病是也奶牛蹄病中危害最大的一种，患有腐蹄病的奶牛会出现蹄变形、跋行、运动困难、食欲减退、泌乳量下降、繁殖能力降低等临床症状，病情严重的奶牛还可能被迫淘汰。同时，即使患牛被治愈也会缩短其利用年限，严重影响到奶牛场的发展，给奶牛业带来了很大的经济损失。
不同于死亡率很高的传染性疾病，腐蹄病是一种由严格厌氧的坏死梭杆菌和节瘤拟杆菌为主要病原菌引起的一种传染病，在奶牛、肉牛饲养业发达的欧美等国家也早有相关疾病的报道。
随着我国畜牧业高速发展，尤其是在国家大力支持的情况下，奶牛业的发展更是蒸蒸日上。然而，由于奶牛数量的增加，腐蹄病的发病率也在逐年增加，在各类文章杂志上也有许多的报道。腐蹄病的死亡率极低，但其所能够造成的经济损失确是十分巨大的。因而，奶牛蹄病的治疗应坚持早发现、早治疗的原则。采用化学药物的治疗发病动物，减少畜牧业的经济损失具有重大意义。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种复方甲紫溶液，所述的复方甲紫溶液以甲紫和多西环素为主要功效原料，并配合相关辅料得到复方药液，不仅具有良好的腐蹄病治疗效果，而且可以减少用药次数；同时，高性能表皮润肤剂的使用也能够增加药效时间；助溶剂、表皮修复剂等辅料的配合也能够有效提高药物治疗效果。
本发明的第二目的在于提供一种所述的方甲紫溶液的制备方法，该方法具有制备工艺简便，适于规模化生产等优点。
本发明的第三目的在于提供一种包含所述的复方甲紫溶液的药物或药物组合物。
本发明的第四目的在于提供一种所述的复方甲紫溶液在制备由坏死梭杆菌和节瘤拟杆菌所引发的腐蹄病治疗药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种复方甲紫溶液，所述复方甲紫溶液主要由以下组分制成：甲紫、多西环素、助溶剂、表皮润肤剂、表皮修复剂，以及水。
优选的，本发明所述的复方甲紫溶液中，所述助溶剂包括：异丙醇、乙醇、聚乙二醇300、聚氧乙烯化蓖麻油，以及聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯中的一种或几种的混合物；
更优选的，所述助溶剂包括聚氧乙烯化蓖麻油，以及聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯中的一种或二者的混合物。
优选的，本发明所述的复方甲紫溶液中，所述表皮润肤剂包括：丙二醇、丙三醇、肉豆蔻酸异丙酯，或者棕榈酸乙基己酯中的一种或几种的混合物；
更优选的，所述表皮润肤剂包括肉豆蔻酸异丙酯，或者棕榈酸乙基己酯中的一种或二者的混合物。
优选的，本发明所述的复方甲紫溶液中，所述表皮修复剂包括：生长因子、真皮生长因子，或者重组表皮生长因子中的一种或几种的混合物；
更优选的，所述表皮修复剂包括表皮生长因子。
优选的，按照重量百分数计，本发明所述的复方甲紫溶液主要由以下组分制成：甲紫1.0～10.0％，多西环素2.0～20.0％，助溶剂1.0～15.0％，表皮润肤剂2.0～20.0％，表皮修复剂1.0～15.0％，以及水40.0～90.0％。
优选的，按照重量百分数计，本发明所述的复方甲紫溶液主要由以下组分制成：甲紫1.0～5.0％，多西环素3.0～15.0％，助溶剂2.0～10.0％，表皮润肤剂3.0～15.0％，表皮修复剂1.0～10.0％，以及水45～90％。
优选的，本发明所述的复方甲紫溶液中，甲紫和多西环素的质量比为1:3；和/或，甲紫和助溶剂的质量比为1:2；和/或，甲紫和表皮润肤剂的质量比1:3。
同时，本发明还提供了所述的复方甲紫溶液的制备方法，其包括如下步骤：将甲紫、多西环素两者均匀混合后，再依次加入助溶剂、表皮润肤剂以及表皮修复剂，均匀搅拌后加入水补充至全量，过滤，即得复方甲紫溶液；
优选的，所述均匀搅拌的温度为20～30℃，时间为20～30min。
同样的，本发明还提供了包含本发明所述的复方甲紫溶液的药物或药物组合物。
进一步的，本发明也提供了所述的复方甲紫溶液在制备由坏死梭杆菌和节瘤拟杆菌所引发的腐蹄病治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所述的复方甲紫溶液中以甲紫和多西环素复合使用，抗菌谱广，对由坏死梭杆菌和节瘤拟杆菌引起的腐蹄病具有显著疗效，专一性强，而且能够减少药物交叉耐药性。
(2)本发明所述的复方甲紫溶液可以采用外用喷雾给药，使用方便，节省生产人工成本，同时动物机体对药物的摄入刺激小。
(3)本发明所述的复方甲紫溶液经局部给药后，表皮修复因子和表皮润肤剂能能够与坏死组织凝结成保护膜，起收敛保护作用，加速蹄部自我修复。
(4)本发明所述的复方甲紫溶液生物安全性高，不会产生药物残留，处于泌乳期的奶牛也能放心使。
(5)本发明所述的复方甲紫溶液选用新型辅料，药物制剂安全性和稳定性好，药物毒副作用小，对组织无刺激。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
有鉴于腐蹄病对于奶牛生产性能影响较大，且现有治疗药物在安全性和治疗效果上并不十分理想，本发明特提供了一种新型复方甲紫溶液，从而实现对于腐蹄病，特别是对于由坏死梭杆菌和节瘤拟杆菌所引发的腐蹄病实现快速、有效的治疗。
具体的，本发明所提供的复方甲紫溶液原料如下：甲紫、多西环素、助溶剂、表皮润肤剂、表皮修复剂，以及水；
其中，甲紫(methylrosanilniumchloride)为氯化四甲基副玫瑰苯胺、氯化五甲基副玫瑰苯胺与氯化六甲基副玫瑰苯胺的混合物，是一种三苯甲烷类染料消毒剂，能与微生物酶系统发生氢离子的竞争性对抗，使酶成为无活性的氧化状态，从而发挥杀菌作用。甲紫主要对革兰阳性菌如葡萄球菌、白喉杆菌，以及绿脓杆菌、白念珠菌、表皮癣菌有很好的杀灭作用；同时，其毒性小，对组织无刺激，且能与坏死组织凝结成保护膜，起收敛作用。
多西环素(doxycycline)是由土霉素经脱氧而得到的一种半合成四环素类抗生素，为淡黄色或黄色结晶性粉末，在水中或甲醇中易溶。多西环素为广谱抗生素，与四环四抗菌谱相似，但抗菌活性强于四环素。在低浓度时该药物发挥促进剂作用，在高浓度下起治疗作用。可以用于g+菌、g-菌、支原体、巴氏杆菌等引起的疾病，而且对芽孢也有一定的破坏作用。临床上主要用于治疗主要用于治疗g+菌、g-菌感染导致的呼吸道炎症、蜂窝织炎等炎症。
而本发明所提供的复方甲紫溶液中，则是以甲紫和多西环素为主要成分，并复合使用，对治疗和控制牛、羊的腐蹄病有很好的临床效果，尤其是对奶牛的防治十分适用。同时，本发明复方甲紫溶液对诱发腐蹄病的多种病原菌都有良好的抑制作用，尤其是对坏死梭杆菌、节瘤拟杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用显著，相较于甲紫溶液、多西环素溶液的单一使用而言，治疗效果要好。因此，本复方甲紫溶液可作为制备治疗奶牛腐蹄病的药物组合物，从而为奶牛腐蹄病提供了新的治疗候选药物。同时，本发明复方甲紫溶液刺激性小，使用方便，具有很大的市场潜力和竞争力。
同时，优选的，本发明原料助溶剂为异丙醇、乙醇、聚乙二醇300、聚氧乙烯化蓖麻油，以及聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯中的一种或几种的混合物；
更优选的，所述助溶剂为聚氧乙烯化蓖麻油，以及聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯中的一种或二者的混合物；
进一步优选的，所述助溶剂为聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯。
优选的，本发明原料表皮润肤剂为丙二醇、丙三醇、肉豆蔻酸异丙酯，或者棕榈酸乙基己酯中的一种或几种的混合物；
更优选的，所述表皮润肤剂为肉豆蔻酸异丙酯，或者棕榈酸乙基己酯中的一种或二者的混合物；
进一步优选的，所述表皮润肤剂为肉豆蔻酸异丙酯。
优选的，本发明原料表皮修复剂为生长因子(egf)、真皮生长因子(afgf)，或者重组表皮生长因子(regf)中的一种或几种的混合物；
更优选的，所述表皮修复剂为表皮生长因子(egf)。
进一步的，按照重量百分数比例计，本发明复方甲紫溶液各组分用量如下：甲紫1.0～10.0％，例如可以为，但不限于2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，或者9.5％等；多西环素2.0～20.0％，例如可以为，但不限于3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0，或者19.0％等；助溶剂1.0～15.0％，例如可以为，但不限于2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，或者14.0等；表皮润肤剂2.0～20.0％，例如可以为，但不限于3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0，或者19.0％等；表皮修复剂1.0～15.0％，例如可以为，但不限于2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，或者14.0等；以及水40.0～90.0％，例如可以为，但不限于45.0、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、80.0，或者85.0％等。
优选的，按照重量百分数计，本发明复方甲紫溶液各组分用量如下：甲紫1.0～5.0％，多西环素3.0～15.0％，助溶剂2.0～10.0％，表皮润肤剂3.0～15.0％，表皮修复剂1.0～10.0％，以及余量的水；
条件是，各组分质量之和为100％。
进一步优选的，在本发明所提供的复方甲紫溶液中，甲紫和多西环素的质量比为1:3；
同时，优选的，甲紫和助溶剂的质量比为1:2；
同样的，优选的，甲紫和表皮润肤剂的质量比1:3。
进一步的，本发明复方甲紫溶液的制备工艺也较为简便，其步骤可参考如下：
将甲紫溶解，优选的，是以适量的水将甲紫溶解；然后加入多西环素搅拌溶解；
然后优选的依次加入助溶剂、表皮润肤剂以及表皮修复剂，均匀搅拌；
优选的，此步骤中，搅拌的温度为20～30℃，时间为20～30min；更优选的，此步骤中，搅拌的温度为25℃，搅拌的时间为25min；
搅拌后，加入剩余量的水，过滤，优选的以粗纱进行过滤，得到复方甲紫溶液。
由如上方法所得到的本发明复方甲紫溶液对于由坏死梭杆菌和结瘤杆菌引起的腐蹄病具有良好的治疗效果，可以用于牛、羊等牲畜的腐蹄病治疗，其施用方法也较为便捷，将复方甲紫溶液从牲畜腿部距地面10～15cm处喷雾给药，每次给药喷射3～5次，每天重复一次；同时，护理患病牲畜蹄部的外伤、溃疡和创面的感染，至痊愈。
进一步的，在患病牲畜的治疗过程中，可以仅以本发明复方甲紫溶液按照如上的方法进行治疗，也可以将本发明复方甲紫溶液与其他内和/或外用药物进行配合治疗，从而起到复合治疗的功效。
实施例1
按照质量百分数：甲紫2％，多西环素6％，聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯4％，肉豆蔻酸异丙酯6％，生长因子(egf)1％，以及余量的水，分别称取适量各原料；
然后，按照如下方法得到实施例1的复方甲紫溶液：
将甲紫以适量水溶解后，加入多西环素继续搅拌溶解；
然后，向所得溶液中依次加入聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯、肉豆蔻酸异丙酯，以及表皮生长因子，并在25℃条件下搅拌25min；
然后向所得溶液中加入水，并搅拌混合，然后以粗纱进行过滤，得到复方甲紫溶液，即为实施例1的复方甲紫溶液。
实施例2
按照质量百分数：甲紫5％，多西环素3％，聚氧乙烯化蓖麻油6％，棕榈酸乙基己酯8％，真皮生长因子(afgf)1％，以及余量的水，分别称取适量各原料；
然后，参照实施例1的方法得到实施例2的复方甲紫溶液。
实施例3
按照质量百分数：甲紫1％，多西环素8％，异丙醇2％，乙醇1％，聚乙二醇3006％，重组表皮生长因子(regf)，以及余量的水，分别称取适量各原料；
然后，参照实施例1的方法得到实施例3的复方甲紫溶液。
实验例1药物的抑菌效力试验
本试验在东方澳龙大动物临床药物评价中心进行，试验产品由东方澳龙制药有限公司(gmp认证生产线)产的复方甲紫溶液(2.0％甲紫、6％多西环素)，生产批号为160803，依据中国农业部颁布的《兽用化学药物抑菌效力检查法指导原则》办法进行的复方甲紫溶液抑菌效力试验。
1.1病料
18份病料分别来源于清远晨光农场奶牛病蹄组织8头份，从化绿色农场奶牛病蹄组织6头份，湛江农垦农场奶牛蹄部浓汁4头份。
1.2培养基
鲜血琼脂培养基、营养肉汤、节瘤拟杆菌培养基、坏死梭杆菌培养基、厌氧菌生化试验培养基。
1.3病料的采集与分离鉴定
病料的采集，在病变部位用灭菌注射器直接吸取深部脓汁后，立即排出气泡，然后将针头插入无菌的橡皮塞内，使针筒内的标本物与外界空气隔绝。或用消毒过的刀、剪、镊采取新发生的病变组织，用灭菌棉拭子抹取，放入运送培养基。把注射器或运送培养基立刻放入密闭低于0℃的恒温容器内运送。
固体培养基上挑纯菌株,经镜检细菌形态观察、生化鉴定试验和pcr方法检测,确定病原菌株，并纯化培养保存。
1.4药敏试验
采用世界卫生组织(who)推荐的kirby-bauer纸片法进行甲紫溶液的抑菌效力试验。从奶牛场病料中分离纯化后的病原菌中，挑取单个菌落，分别接种于营养培养液中，37℃培养24h。用无菌生理盐水稀释制成0.5麦氏标准的菌悬液，吸取适量菌液于营养琼脂平板内，在其表而均匀涂布，盖上平板，于室温放置数分钟，用无菌小镊子夹取各种稀释浓度的复方甲紫溶液、2.0％甲紫溶液、3.0％多西环素溶液3种纸片，平贴于琼脂表面，然后倒置于37℃培养16-18h。平板取出后，观察在药敏纸片周围有无抑菌圈形成，测量其直径(d)大小。结果判定标准d＞15mm为高度敏感；10.1mm＜d＜15mm为中度敏感；d＜10mm为耐药。
1.5试验结果
通过对感染奶牛腐蹄病的坏死梭杆菌、节瘤拟杆菌、化脓棒状杆菌、链球菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌6种病原菌进行药敏试验。试验结果见如下表1：
表13种药物的抑菌效力表
由如上表1的实验结果可知，本发明复方甲紫溶液对从奶牛腐蹄病病料中分离的6种病原菌都有很好的抑菌效力，只是对产气荚膜梭菌抑菌效力差一些，表现为中等敏感；
同时，2.0％甲紫溶液仅对坏死梭杆菌、节瘤拟杆菌、化脓棒状杆菌3种病原菌有很好的抑菌效力；而6.0％多西环素溶液只是对链球菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌3种病原菌有很好的抑菌效力；
由如上的对照试验结果对比也可以明显得知的是，相较于甲紫和多西环素而言，本发明复方甲紫溶液对于奶牛腐蹄病具有良较好的组合治疗效果，对病原菌抑菌效力更加全面、高效。
实验例2药物临床效果试验
本试验于2016年9月～2017年9月在肇庆骏彬奶牛场和湛江农垦奶牛场中进行，选取患病动物，随机分为实验组和对照组，依据中国农业部颁布的《兽用化学药临床试验技术指导原则(试行)》办法进行，具体信息见表2。
表2临床试验实验组和对照组信息表
治疗剂量：将各组溶液通过喷雾的方式给药，并从10-15cm处喷射3-5次，每天重复一次，护理外伤、溃疡和创面的感染，直至痊愈。治疗开始后，以相同给药方式和相应疾病，每日记录患病动物身体变化情况，治疗7日后统计，治疗结果如下表3-6所示：
表3肇庆骏彬奶牛场防治措施前后发病情况比较
表4湛江农垦奶牛场防治措施前后发病情况比较
表5肇庆骏彬奶牛场防治措施前后产奶量情况比较
表6湛江农垦奶牛场防治措施前后产奶量情况比较
由如上表3、表4的奶牛场防治措施前后发病情况比较结果可知，6.0％多西环素溶液主要对变形蹄发病和蹄底糜烂发病的治疗效果明显，2.0％甲紫溶液主要对指(趾)间皮炎发病和指关节病发病治疗效果明显；
本发明的复方甲紫溶液在两个奶牛场使用后，4种奶牛常见蹄病变形蹄发病、蹄底糜烂发病、指(趾)间皮炎发病和指关节病发病几乎完全治愈，与其它两个对照组比较有显著差别，由此可见，本发明复方甲紫溶液对奶牛常见的蹄病都有显著的治疗效果；
进一步的，由不同实施例组治疗效果对比可知，实施例1所提供的复方甲紫溶液能够取得更好的治疗效果，由此可见，原料配比对于所制备的复方甲紫溶液的效果也有一定的影响。
而由表5、6所示的奶牛场防治措施前后产奶量结果可知，本发明的复方甲紫溶液在两个奶牛场使用后，平均每头奶牛产奶量提高20.4％、18.4％，远远要高于要2个对照组2.0％甲紫溶液(10.1％、11.5％)和6.0％多西环素溶液(4.6％、7.6％)，由此可见，本发明的复方甲紫溶液在有效治疗奶牛蹄疾后，能迅速恢复产奶性能，增加生产效益；
进一步的，由不同实施例组效果对比可知，实施例1组复方甲紫溶液能够取得更为优异的奶牛治愈后产奶性能，更有利于生产效益的提高。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。