本发明涉及介孔二氧化硅纳米粒子，属于医药
技术领域：
，具体地涉及一种二硫键功能化的荧光介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法及其用途。
背景技术：
：药物控制释放系统可以实现药物在病灶部位的靶向释放，提高药效,降低药物的毒副作用。理想的药物控制释放系统要求负载的药物在到达目标病灶部位之前零释放，到达目标靶向以后才释放出来。介孔二氧化硅纳米粒子(msns)在药物传递系统、催化与吸附、蛋白质分离等方面具有广泛的应用，尤其在药物传递系统中显示出不可比拟的优点：具有大的比表面积(＞900m2/g)和比孔容(＞0.9cm3/g)，可调节的孔径(2～10nm)，可控制的形态和可修饰的表面，可以在介孔通道内或在介孔表面负载各种药物，并可对药物进行可控的载药与药物释放，最终可以实现对组织的靶向。目前已经报道了一系列基于msns的刺激响应性系统，即药物释放可由包括温度，电，磁场，光等物理信号和ph，氧化还原，酶活性等化学信号这些环境刺激触发，为实现msns在药物控释递送系统的应用提供了广阔前景。其中，孔壁荧光功能化的介孔二氧化硅材料由于其具备稳定的荧光性能可作为荧光探针，正日益引起广泛关注，然而，一些荧光介孔材料由于本身的毒性或者暴露在材料表面导致正常细胞的非正常死亡，都会影响治疗效果；因此，设计和制备具有毒性较小的高稳定性的新型荧光功能化的介孔二氧化硅纳米粒子，对实现其在药物递送领域中的应用至关重要。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明公开了具备毒性较小和高稳定性的二硫键功能化的荧光介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法及其用途。为实现上述目的，本发明公开了一种二硫键功能化的荧光介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法，它包括如下步骤：1)制备巯基修饰的介孔二氧化硅纳米粒的乙醇分散液；2)制备荧光介孔二氧化硅纳米粒的乙醇分散液：取步骤1)制备的巯基修饰的介孔二氧化硅纳米粒的乙醇分散液，离心分散于醋酸锌溶液中，再与8-羟基喹啉在避光下反应，制备得到荧光介孔二氧化硅纳米粒，分散于乙醇中得到荧光介孔二氧化硅纳米粒的乙醇分散液；3)制备羧基功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒的水分散液：向酸酐中加入硅烷偶联剂，搅拌反应得到羧基功能化的硅烷偶联剂，取步骤2)得到的所述荧光介孔二氧化硅纳米粒的乙醇溶液，依次加入碱溶液、羧基功能化的硅烷偶联剂，避光反应得到羧基功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒，分散于水中，得到羧基功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒的水分散液；4)制备二硫键功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒的水分散液：取步骤3)制备得到的羧基功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒的水分散液，依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，再滴加胱胺二盐酸盐的水溶液避光反应制备得到二硫键功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒，分散于水中保存。进一步地，所述步骤2)中，取步骤1)制备的巯基修饰的介孔二氧化硅纳米粒的乙醇分散液，离心分散于醋酸锌溶液中，搅拌反应10～14h，再离心、乙醇洗涤后分散至水中制备成待反应液，取8-羟基喹啉的乙醇溶液在搅拌状态下，滴加到所述待反应液中，室温下避光反应40～56h，反应结束后经离心、乙醇洗涤至上清液为无色，得到荧光介孔二氧化硅纳米粒，分散至乙醇中得到荧光介孔二氧化硅纳米粒的乙醇分散液。再进一步地，所述步骤2)中，每0.1g的巯基修饰的介孔二氧化硅纳米粒中加入0.4～0.5mmol的8-羟基喹啉、0.047～0.095mmol的醋酸锌，醋酸锌溶液的浓度为0.05～0.08mol/l。更进一步地，所述步骤3)中，在冰浴条件下，向酸酐中加入硅烷偶联剂，搅拌反应至变成白色膏状固体，得到羧基功能化的硅烷偶联剂，冷藏保存，取步骤2)得到的所述荧光介孔二氧化硅纳米粒的乙醇溶液，依次加入碱溶液、羧基功能化的硅烷偶联剂，室温下避光反应10～14h，反应完全后离心，乙醇洗涤，得到羧基功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒，分散至水中保存。更进一步地，所述步骤3)中，所述碱溶液为氨水、三乙醇胺中的至少一种，所述硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷，所述酸酐为马来酸酐或琥珀酸酐中的至少一种。更进一步优选的，所述步骤4)中，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的物质的量比为1～10:1。更进一步优选的，所述步骤4)中，每0.1g的荧光介孔二氧化硅纳米粒中加入0.326mmol的羧基功能化的硅烷偶联剂、0.625～6.25mmol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、0.625mmol的n-羟基琥珀酰亚胺和0.324～3.24mmol的胱胺二盐酸盐。更进一步地，所述步骤1)中，取乙醇、水与表面活性剂混合后加入三乙醇胺中，搅拌至溶解，再在氮气保护作用下，控制温度为40～90℃，滴加二氧化硅前驱体和巯基硅烷偶联剂的混合溶液，搅拌2h，然后冷却至室温、第一次离心分离后采用乙醇洗涤2～3次，再在体积比为9:1的乙醇与37wt％盐酸的混合溶液体系中，控制温度为60℃，回流2～3次，回流结束后采用乙醇和水交替洗涤5～6次，第二次离心分离，再分散至乙醇中即制备得到巯基修饰的介孔二氧化硅纳米粒的乙醇分散液。更进一步优选的，所述步骤1)中，所述表面活性剂为十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三乙基溴化铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵或十四烷基三甲基氯化铵中的一种或一种以上的混合物；所述二氧化硅前驱体为正硅酸四乙酯、正硅酸四甲酯、正硅酸四丙酯、正硅酸四丁酯中的一种或一种以上的混合物；所述巯基硅烷偶联剂为巯丙基三甲氧基硅烷，巯丙基三乙氧基硅烷，γ-巯丙基三甲氧基硅烷中的至少一种。为了更好的实现本发明的技术方案，本发明还公开了采用上述制备方法制备得到的二硫键功能化的荧光介孔二氧化硅纳米颗粒，所述介孔二氧化硅纳米颗粒的粒径为80～150nm。此外，本发明还公开了上述制备的二硫键功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒在药物载体中的应用。作为本发明技术方案的优选：每0.1g的巯基修饰的介孔二氧化硅纳米粒中加入0.475mmol的8-羟基喹啉、0.067mmol的醋酸锌；每0.1g的荧光介孔二氧化硅纳米粒中加入0.326mmol的羧基功能化的硅烷偶联剂、0.625mmol的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、0.625mmol的n-羟基琥珀酰亚胺和3.24mmol的胱胺二盐酸盐。有益效果：1、本发明制备的二硫键功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒子的粒径为80～150nm，且粒径分散均匀；2、本发明制备的二硫键功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒子由于在孔内壁修饰有喹啉锌，使纳米粒子在380nm激发下具有发绿色荧光的特性，且在ph＝(5～9)的缓冲溶液中，荧光性质稳定；3、本发明制备的二硫键功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒子表面修饰有含二硫键的氨基官能团，使该纳米粒子具有还原响应的特性，纳米粒子可利用表面的氨基官能团可以进一步修饰高分子聚合物提高纳米粒的生物相容性的分子聚乙二醇、具有靶向性的分子如透明质酸或叶酸以及具有与喹啉锌发生荧光共振能量转移的分子如罗丹明等；可作为输送抗肿瘤药物的纳米载体材料，该载药体系具有实时监测的作用，可有效提高载药量控制药物释放，降低药物副作用，从而有效治疗相关的癌症。附图说明图1为本发明实施例cms-sh的透射电镜图；图2为本发明实施例znq-cms的透射电镜图；图3为本发明实施例znq-cms样品在380nm波长下的荧光光谱图；图4为图3的znq-cms样品在不同时间下的荧光光谱图；图5为图3的znq-cms样品在不同ph缓冲液下的荧光光谱图；图6为图5的荧光照片；图7为本发明实施例znq-cms、znq-cms-cooh和znq-cms-ss-nh2的归一化荧光光谱；图8为图7的荧光照片。具体实施方式为了更好的解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明公开了一种二硫键功能化的荧光介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法，它包括如下步骤：1)制备巯基修饰的介孔二氧化硅纳米粒(cms-sh)的乙醇分散液：25wt％(质量百分比)十六烷基三甲基氯化铵(ctac)水溶液的制备：取3.5gctac溶于10.5ml水中，在室温下剧烈搅拌20min，直至澄清；取64ml水、10.5ml乙醇、10.4ml25wt％ctac水溶液室温下剧烈搅拌10min，加入三乙醇胺4.125ml，继续剧烈搅拌15min，直至澄清用做储备液；取20ml储备液置于三口烧瓶中，在n2保护下油浴至60℃待温度稳定后，随后在搅拌下2～3min内逐滴加入1.454ml正硅酸四乙酯(teos)和0.1625ml巯丙基三乙氧基硅烷(mptes)的混合液，继续搅拌反应2h，离心，用乙醇洗涤2次；将上述溶液再分散于含有5ml盐酸(37wt％)与45ml的乙醇溶液中，60℃回流提取2h，重复两次，乙醇洗涤6次，最后分散于乙醇溶液中配制成5mg/ml的溶液保存。2)制备荧光介孔二氧化硅纳米粒(znq-cms)的乙醇分散液：所述步骤2)中，取20ml5mg/ml的步骤1)制备的cms-sh乙醇分散液，离心后分散于9.5ml浓度为0.05mol/l的醋酸锌溶液中，超声分散均匀，室温下搅拌反应12h，再离心、乙醇洗涤3次后分散至水中制备成浓度为5mg/ml的待反应液，取待反应液20ml，超声分散均匀，将25ml含有9.7mg(0.067mmol)8-羟基喹啉(8-hq)的乙醇溶液在搅拌状态下，逐滴滴加到所述待反应液中，室温下避光反应48h，反应结束后经离心、采用乙醇洗涤3～5次至上清液为无色，得到荧光介孔二氧化硅纳米粒(znq-cms)，分散至乙醇中得到浓度为5mg/ml溶液保存。3)制备羧基功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒(znq-cms-cooh)的水分散液：取2.5g(25.5mmol)马来酸酐置于配有转子的25ml圆底烧瓶中，在冰浴条件下，逐滴加入5.5ml(23.5mmol)3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，快速搅拌反应，可见马来酸酐溶解并放出大量热量，搅拌至反应物变成白色膏状固体后停止反应，得到羧基功能化的硅烷偶联剂(aptes-cooh)，将其置于冰箱中冷藏保存，取20ml步骤2)得到的所述znq-cms乙醇溶液(5mg/ml)，超声分散均匀，然后在搅拌状态下加入10ul氨水，取104mgaptes-cooh溶于2ml乙醇，逐滴加入到上述反应液中，室温下避光反应12h，反应完全后离心，乙醇洗涤3次，得到羧基功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒(znq-cms-cooh)，分散至20ml水中，得到羧基功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒的水分散液。4)制备二硫键功能化的荧光介孔二氧化硅纳米粒(znq-cms-ss-nh2)的水分散液：取步骤3)制备得到的znq-cms-cooh水分散液，加入120mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)，室温搅拌反应10min，然后再加入80mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)反应活化1h，再取0.5g胱胺二盐酸盐溶于5ml水中，并滴加至上述反应液中，室温避光搅拌12h，得到的产物以10000r/min离心15min分离，超纯水重悬洗涤三次，得到含有二硫键的氨基末端的荧光介孔二氧化硅纳米粒子(znq-cms-ss-nh2)，将其再分散于水中配制成5mg/ml的溶液保存。对上述实施例1制备的中间物及产物进行动态光散射粒度(dls)分析，得到了表1；表1cms-sh、znq-cms、znq-cms-cooh和znq-cms-ss-nh2的dls分析数据列表samplesizepdiz-电位cms-sh113.20.088-27.8znq-cms123.90.094-16.5znq-cms-cooh171.50.073-43.4znq-cms-ss-nh2134.10.108+30.6由上述表1可知，巯基功能化的介孔二氧化硅纳米粒子粒径为113.2nm，pdi为0.088，具有良好的分散性，电位为-27.8mv，其带负电主要是由于介孔二氧化硅表面存在大量的硅醇羟基；当孔道中引入zn2+与8-羟基喹啉后，znq-cms电位升高，这可能是zn2+与部分纳米粒表面的羟基作用的结果，然而粒径为123.9nm相较于cms-sh变化不明显，pdi为0.094呈现了良好的分散性，znq-cms经过羧基修饰后，水合粒径为171.5nm，相较于znq-cms增加了近50nm,其原因可能是由于羧基是亲水基团，经过羧基修饰后增加了纳米粒子的亲水性，水化层因此变大从而导致粒径的增加；进一步经过胱胺修饰后znq-cms-ss-nh2的粒径为134.1nm，与znq-cms相近，修饰后的纳米粒子的pdi均在0.1左右，表明了其良好的分散性。然而，值得注意的是，经过官能团修饰后znq-cms-cooh和znq-cms-ss-nh2的电位均发生了明显的变化。结合图1和图2可知，cms-sh呈现出球形形貌并且分布均匀，粒子大小相对均一，平均粒径约为85nm，此外，可观察到明显的蠕虫状的介孔孔道，这是胶体介孔二氧化硅纳米粒子的特征。值得注意的是，znq-cms也呈现球形形貌并且分布均匀，平均粒径为85nm，介孔结构仍然明显，表明金属配位化合物的掺杂对介孔结构和粒径影响较小。znq-cms的乙醇分散液在紫外灯照射下具有强烈的绿色荧光，如图3所示，当激发波长为380nm，狭缝为10nm时，其荧光发射波长在510nm；结合图4可知，将znq-cms样品在乙醇溶液中保存1个月和2个月后，其荧光发射波长和荧光强度均未发生明显变化，说明znq-cms在一定时间内荧光性质相对保持稳定。为了进一步的考察不同ph对znq-cms荧光性质的影响，将znq-cms置于不同ph的磷酸缓冲盐溶液(pbs)中，并在紫外灯下照射下，当激发波长为365nm，狭缝为10nm时，结果如图5所示，由图5可知，当在ph大于等于5的pbs中时，znq-cms的荧光强度保持相对稳定，然而当ph小于5时，荧光强度大大减弱，甚至在ph降到3时几乎完全淬灭；而文献报道肿瘤组织微环境中内涵体或溶酶体的ph最小达到5.0左右，因此，znq-cms在生理条件和肿瘤微环境中的荧光强度不会受很大影响，可应用于载体材料，具体的荧光照片如图6所示，图6也再次证明ph大于等于5时，znq-cms的荧光强度呈绿色，且保持相对稳定，而在ph降到3时荧光几乎完全淬灭。此外，为了证实每一步的修饰，如喹啉锌和氨基等对介孔二氧化硅纳米粒子的荧光光谱是否发生变化，测定了每一步修饰后所得物质的荧光光谱，如图7所示，其中znq-cms经过羧基和含二硫键的氨基修饰后，荧光发射峰最大位置由之前的510nm蓝移到了495nm处，但是其荧光光谱仍然与fret的受体罗丹明b的吸收光谱有重叠，不影响荧光共振能量转移纳米粒子fret-cms的构建。此外，该荧光光谱为归一化处理的图谱，随着修饰次数增加，荧光强度也相应有所降低，与图8紫外灯照射下荧光照片的结果保持一致，从照片看出修饰前后均呈现绿色荧光且荧光强度有所降低。以上实施例仅为最佳举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。当前第1页12