本发明涉及生物医用材料领域，尤其涉及一种应用于皮肤组织损伤修复领域的皮肤细胞喷雾及其制备方法。
背景技术：
皮肤是人体最大，也是最重要的器官之一，烧烫伤治疗是临床外科手术最重要的领域之一。创面烧伤程度一般分四级：浅度、浅二度、深二度和三度，浅层皮肤缺损后，随着表皮细胞增殖、分化和迁移，皮肤得以再生修复。如果是深度(深二度和三度)烧伤患者，创面的修复常需要通过各种皮片移植手术才能完成。深度烧伤创面的修复目前主要采用“拆东墙补西墙”的自体皮片移植，如深度烧伤创面面积不大，供皮区较充足，可采用自体大张皮或网状皮移植，创面愈合后瘢痕增生较轻，外观和功能较理想。尽管该方法成功救治了许多大面积深度烧伤患者，但是也带来了诸多问题：一是：创面修复时间过长，增加了医疗费用，且在漫长的创面修复过程中常发生感染、器官功能不全等并发症，甚至危及生命；二是：由于缺乏真皮层，移植自体表皮后，即使病人能得到及时救治完成创面的封闭，但后期会出现瘢痕挛缩畸形和功能障碍，是一个目前亟待攻克的难题。
为了解决临床上治疗深度烧伤、瘢痕整形患者的需求，异体真皮和人工皮肤产品孕育而生。由于异体皮肤涉及病毒传染风险、伦理问题、社会观念、来源限制等多重因素，异体皮肤在临床使用中受到极大的限制，而且价格及其昂贵。人工皮肤替代物被用于深度烧伤真皮修复，并取得良好的治疗效果。目前市场上的人工皮肤有：
干细胞治疗技术是组织工程的一大飞跃，是生物材料与细胞协同作用修复缺损组织的一大进步。在治疗皮肤损伤方面，干细胞治疗法是一种完美治愈皮肤缺损的新兴手段，可以替代目前市场上的人工皮肤，并具有显著的优势。如干细胞通过分泌一些生物活性因子，诱导体内成纤维细胞和血管内皮细胞等修复细胞的迁移、浸入和增殖，可以永久性修复创面，尤其是瘢痕少、挛缩小、触感柔软、活动度好、无功能障碍。目前细胞治疗方法一般采用干细胞与生物材料支架协同作用治疗。目前支架主要有两大类：一类是人工合成的真皮支架，另一类是基因天然材料的人工真皮支架。然而此类方法对支架材料的性能具有较高的要求，如孔径，力学性能，材料的韧性，生物相容性等，并且具有手术操作复杂，活动度差，材料价格昂贵等缺陷。
技术实现要素：
鉴于上述状况，本发明提供一种应用于皮肤组织损伤修复领域的皮肤细胞喷雾及其制备方法。
一种皮肤细胞喷雾的制备方法，其包括如下步骤：
a.配置营养液，所述营养液为乳酸盐溶液、细胞培养基混合溶液、生长因子中的两种或几种组合；
b.配置高分子悬液，所述高分子悬液中的高分子为透明质酸钠、胶原、明胶、硫酸软骨素、海藻酸钠、丝素蛋白、壳聚糖、多肽中的一种或几种组合；
c.制备混合细胞悬液，选取真皮干细胞、表皮干细胞、骨髓间充质干细胞、祖细胞、毛囊干细胞、造血干细胞、脂肪干细胞、角质细胞、成纤维母细胞、t细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊水间充质干细胞中的一种或者几种组合，置于培养皿中，加入细胞特定的培养基，制得所述混合细胞悬液；
d.制备皮肤细胞喷雾，将步骤a、b、c中所得的营养液、高分子悬液、混合细胞悬液中的一种或几种混合，制得所述皮肤细胞喷雾并置于喷雾装置内。
优选地，所述乳酸盐溶液由氯化钠、乳酸钠、氯化钙、氯化钾及注射用水组成，所述氯化钠的浓度为0.05-0.15mol/l，所述乳酸钠的浓度为0.02-0.03mol/l，所述氯化钙的浓度为0.001-0.002mol/l，所述氯化钾的浓度为0.001-0.005mol/l，所述乳酸盐溶液ph值为6.0-7.5。
优选地，所述细胞培养基混合溶液由选取dmem细胞培养基、rpmi1640细胞培养基、mem细胞培养基、1640细胞培养基、dmem/f12细胞培养基、imdm细胞培养基、mccoy5a细胞培养基、ksfm细胞培养基中的一种或几种组合，再添加血清蛋白和青霉素/链霉素混合溶液，或生长因子中的一种或几种组合而获得，所述生长因子的浓度为0.5-10ng/ml。所述青霉素/链霉素混合溶液为双抗溶液。
优选地，所述生长因子由碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素生长因子中的一种或几种构成。
优选地，所述配置高分子悬液包括：用溶剂溶解所述高分子，所述溶剂为醋酸、丙二酸、水或所述营养液中的一种；用氢氧化钠，或盐酸,或醋酸，或醋酸钠调节溶液的ph值，直至溶液出现微小颗粒状高分子聚集体或高分子微小纤维。
优选地，通过用溶剂溶解高分子得到的壳聚糖溶液的浓度为0.5-20mg/ml，丝素蛋白溶液的浓度为0.1-10mg/ml，胶原蛋白溶液的浓度为0.1-10mg/ml，多肽溶液的浓度为0.1-20mg/ml，透明质酸钠溶液的浓度为0.1-30mg/ml，海藻酸钠溶液的浓度为0.1-30mg/ml，硫酸软骨素溶液的浓度为0.1-25mg/ml。
优选地，所述壳聚糖溶液的ph值为4.0-6.5，分子量为1万-30万道尔顿(dalton,da)；所述丝素蛋白溶液的ph值为5.2-7.4；所述胶原蛋白溶液的ph值6.5-7.8；所述多肽溶液的ph值为5.5-7.5，分子量为0.5-1da；所述透明质酸钠溶液的ph值为6.5-7.4，分子量为800-20000da；所述海藻酸钠溶液的ph值为6.5-7.4，分子量为7.5万-10万da，d-古罗糖醛酸的含量大于60％；所述硫酸软骨素溶液的ph为6.5-7.4，分子量为1000-50000da。
优选地，所述氢氧化钠的浓度为0.01-1mol/l，所述盐酸的浓度为0.01-1mol/l，所述醋酸的浓度为0.01-0.5mol/l，所述醋酸钠的浓度为0.01-0.5mol/l。
优选地，所述高分子悬液中的高分子颗粒的大小为20-500微米。
优选地，所述混合细胞悬液中的细胞是自体组织提取。
优选地，所述混合细胞悬液中的细胞数目为1×105-2×107个/ml，检测细胞存活率为80％-100％。
优选地，所述营养液、高分子悬液、混合细胞悬液、皮肤细胞喷雾制剂的制备均在无菌条件下进行，材料选择医用级，溶液选择注射级。
一种皮肤细胞喷雾，所述皮肤细胞喷雾由以上描述的皮肤细胞喷雾的制备方法制得。
一种皮肤细胞喷雾的应用方法，将皮肤细胞喷雾按照喷涂扩张面积与所述皮肤损伤面积的一定比例进行喷涂，所述的一定比例为1:10-1:50。
由于本发明的皮肤细胞喷雾是由混合细胞悬液与营养液和高分子悬液混合制得，所述混合细胞悬液中含有干细胞，所述营养液中含有细胞培养基混合液，所以本发明的皮肤细胞具有以下优点：(1)细胞存活率高，且存活时间较长，具有良好的可注射性，通过喷涂的方式，将皮肤细胞喷雾喷射于皮肤损伤部位，操作简单；(2)永久性修复创面，尤其是瘢痕少、挛缩小、触感柔软、活动度好、无功能障碍。由于所述混合细胞悬液中的干细胞从自体组织中提取，所以本发明的皮肤细胞喷雾可以避免动物源性。
具体实施方式：
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以进一步阐述本发明。显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种皮肤细胞喷雾的制备方法，其包括如下步骤：
配置营养液。所述营养液为乳酸盐溶液、细胞培养基混合溶液、生长因子中的两种或几种组合。所述乳酸盐溶液由氯化钠、乳酸钠、氯化钙、氯化钾及注射用水组成，所述氯化钠的浓度为0.05-0.15mol/l，所述乳酸钠的浓度为0.02-0.03mol/l，所述氯化钙的浓度为0.001-0.002mol/l，所述氯化钾的浓度为0.001-0.005mol/l，所述乳酸盐溶液ph值为6.0-7.5。所述细胞培养基混合溶液由dmem细胞培养基、rpmi1640细胞培养基、mem细胞培养基、1640细胞培养基、dmem/f12细胞培养基、imdm细胞培养基、mccoy5a细胞培养基、ksfm细胞培养基中的一种或数种组合，补充血清蛋白和青霉素/链霉素混合溶液，或生长因子中的一种或多种构成。所述生长因子的浓度为0.5-10ng/ml。所述生长因子由碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素生长因子中的一种或多种构成。所述青霉素/链霉素混合溶液为双抗溶液。
配置高分子悬液。所述高分子悬液中的高分子为透明质酸钠、胶原、明胶、硫酸软骨素、海藻酸钠、丝素蛋白、壳聚糖、多肽中的一种或几种组合。该步骤包括：用溶剂溶解高分子，所述溶剂为醋酸，或丙二酸，或水，或上一步骤所得的营养液，所述高分子为壳聚糖、丝素蛋白、胶原、多肽、透明质酸钠、海藻酸钠、明胶、硫酸软骨素中的一种或几种组合；用氢氧化钠，或盐酸,或醋酸，或醋酸钠调节溶液的ph值，溶液出现微小颗粒状高分聚集体或高分子微小纤维，即得到所述高分子悬液。所述氢氧化钠的浓度为0.01-1mol/l，所述盐酸的浓度为0.01-1mol/l，所述醋酸的浓度为0.01-0.5mol/l，所述醋酸钠的浓度为0.01-0.5mol/l。通过该步骤，得到壳聚糖溶液的浓度为0.5-20mg/ml，ph值为4.0-6.5，分子量为1万-30万道尔顿(dalton,da)，丝素蛋白溶液的浓度为0.1-10mg/ml，ph值为5.2-7.4,胶原蛋白溶液的浓度为0.1-10mg/ml，ph值6.5-7.8,多肽溶液的浓度为0.1-20mg/ml，ph值为5.5-7.5，分子量为0.5-1万da,透明质酸钠溶液的浓度为0.1-30mg/ml，ph值为6.5-7.4，分子量为800-20000da，海藻酸钠溶液的浓度为0.1-30mg/ml，ph值为6.5-7.4，分子量为7.5万-10万da，d-古罗糖醛酸的含量大于60％，硫酸软骨素溶液的浓度为0.1-25mg/ml，ph为6.5-7.4，分子量为1000-50000da。所述高分子悬液中的高分子颗粒的大小为20-500微米。
制备混合细胞悬液。选取真皮干细胞、表皮干细胞、骨髓间充质干细胞、祖细胞、毛囊干细胞、造血干细胞、脂肪干细胞、角质细胞、成纤维母细胞、t细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊水间充质干细胞中的一种或者几种组合，置于培养皿中，加入细胞特定的培养基，制得所述混合细胞悬液。所述混合细胞悬液中的细胞是字体组织提取。所述混合细胞悬液中的细胞数目为为1×105-2×107个/ml，检测细胞存活率为80％-100％。
制备皮肤细胞喷雾制剂。将上述的营养液、高分子悬液、混合细胞悬液中的一种或几种按比例混合，制得所述皮肤细胞喷雾制剂。
以上各步骤均在无菌条件下进行，材料选择医用级，溶液选择注射级。
下面结合实施例对本发明的皮肤细胞喷雾的制备方法进行详细描述。
实施例一
(1)营养液的配置
在本实施例中，所述营养液为乳酸盐溶液。所述乳酸盐溶液的配方为：氯化钠6g，乳酸钠3.1g,氯化钾0.3g，二水氯化钙0.2g，注射用水1l，制得的乳酸盐溶液的ph为6.5。
(2)高分子悬液的配置
在本实施例中，高分子悬液中的高分子为透明质酸钠。将30mg的寡聚透明质酸粉末，放入5ml的注射器中，加入2ml步骤(1)制得的营养液，并拉动活塞，使营养液浸渍透明质酸粉末，并排除针筒中的空气，待透明质酸溶液溶胀2h，即得高分子悬液。
(3)混合细胞悬液的制备
在本实施例中，通过自体皮分离得到混合细胞体系，所述混合细胞体系主要包含有角质细胞，成纤维细胞，真皮干细胞，表皮干细胞。将所述混合细胞体系置于培养皿中，并添加培养基进行培养，最终混合细胞体系的细胞浓度为1×106个/ml。在本实施例中，添加的培养基为ksfm培养基，制得的混合细胞悬液为单层混合细胞悬液。
(4)皮肤细胞喷雾制剂的制备
在本实施例中，将1ml由步骤(3)制得的单层混合细胞悬液加入至由步骤(2)制得的高分子悬液中，然后将混合后的悬液置于培养箱中在5％co2，37℃的环境下培养12小时，此时悬液中的细胞成球体。将培养后的细胞球体溶液与由步骤(1)制得的乳酸盐溶液按照体积比为8:2的比例进行混合，制备皮肤细胞喷雾制剂。然后将2ml的喷雾制剂放入自制的特殊喷雾装置中备用。
实施例二
(1)营养液的配置
本实施例中的营养液为乳酸盐溶液和dmem/f12细胞培养基的混合液。
所述乳酸盐溶液的配方为：氯化钠6g，乳酸钠3.1g,氯化钾0.3g，二水氯化钙0.2g，注射用水1l，溶液的ph为6.5。
所述dmem/f12细胞培养基中dmem培养基和f12培养基的体积比为3:1，然后在所述dmem/f12细胞培养基加入10％人的血清蛋白，之后加入10ng/ml的表皮细胞生长因子(epidermalgrowthfactor,egf)，5ng/ml类胰岛素一号增长因子(insulin-likegrowthfactors–1,ifg-1)，1％的双抗溶液，腺嘌呤2.4mg/100ml，氢克0.5ug/ml，胰岛素0.5mg/100ml，霍乱毒素0.1nm，所述dmem/f12细胞培养基的ph值为7.4。
所述营养液中乳酸盐溶液与dmem/f12细胞培养基的体积比为3:7。
(2)高分子悬液的配置
在本实施例中，用0.5mol/l的醋酸溶解胶原蛋白，配置浓度为0.3％的胶原蛋白溶液，然后在4℃条件下，用0.05mol/l的氢氧化钠溶液调节所述胶原蛋白溶液的ph值至6.8，使溶液中出现较小的絮状物，即得高分子悬液。
(3)混合细胞悬液的制备
在本实施例中，混合细胞悬液的制备方法与实施例一大致相同，不同之处在于本实施例的混合细胞悬液中的细胞是通过自体组织分离提取的人表皮干细胞和祖细胞。
(4)皮肤细胞喷雾制剂的制备
在本实施例中，将步骤(3)制得的混合细胞悬液与步骤(1)制得的营养液和步骤(2)制得的高分子悬液按照体积比2：6：2的比例混合，制备皮肤细胞喷雾制剂。然后将2ml的喷雾制剂放入自制的特殊喷雾装置中备用。
实施例三
(1)高分子悬液的配置
在本实施例中，高分子悬液中的高分子为透明质酸钠和硫酸软骨素的组合。将15mg寡聚透明质酸粉末和15mg硫酸软骨素粉末，放入容量为5ml的注射器中，加入2ml的ksfm培养基溶液，并拉动活塞，使细胞悬液浸渍硫酸软骨粉末和透明质酸粉末，并除去里面的空气，溶解4个小时后，即得高分子悬液，所述高分子悬液的ph值为7.4。
(2)混合细胞悬液的制备
在本实施例中，混合细胞悬液的制备方法与实施例一大致相同，不同之处在于本实施例的混合细胞悬液中的细胞是从自体组织中提取的成纤维母细胞和真皮细胞。
(3)皮肤细胞喷雾制剂的制备
在本实施例中，将1ml由步骤(2)制得的单层的混合细胞悬液加入至步骤(1)制得的高分子悬液中，所述混合细胞悬液和所述高分子悬液的体积比为4:5，然后将混合后的溶液置于培养箱中在5％co2，37℃的环境下培养24小时，此时细胞成球体，培养完成的混合溶液及为皮肤细胞喷雾制剂。
实施例四
(1)营养液的配置
本实施例的营养液的配置与实施例二中营养液的配置相同。
(2)高分子悬液的配置
在本实施例中，高分子悬液中的高分子为胶原蛋白和壳聚糖的组合。用0.5mol/l的醋酸分别溶解胶原蛋白和壳聚糖，配置质量浓度为0.3％的胶原蛋白溶液和质量浓度为0.1％的壳聚糖溶液，将胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液混合，所述胶原蛋白溶液与所述壳聚糖溶液的体积比为6:4，然后在4℃条件下，用0.04mol/l的氢氧化钠溶液调节上述混合溶液的ph值至7.0，即得高分子悬液。
(3)混合细胞悬液的制备
在本实施例中，混合细胞悬液的制备方法与实施例一大致相同，不同之处在于本实施例的混合细胞悬液中的细胞是从自体组织中提取的人表皮干细胞。
(4)皮肤细胞喷雾制剂的制备
在本实施例中，将步骤(3)制得的混合细胞悬液与步骤(1)制得的营养液和步骤(2)制得的高分子悬液按照体积比为3：6：1的比例混合，制备皮肤细胞喷雾制剂。
本发明提供一种皮肤细胞喷雾，所述皮肤细胞喷雾是由实施例一到实施例四中所描述的皮肤细胞喷雾的制备方法制得。
本发明还提供一种皮肤细胞喷雾的应用，在使用该皮肤细胞喷雾时，需要按照喷雾扩张面积与皮肤损伤面积的比例进行喷涂。所述喷雾扩张面积与皮肤损伤面积的比为1:10-1:50，最佳比例为1:20。
由于本发明的皮肤细胞喷雾是由混合细胞悬液与营养液和高分子悬液混合制得，所述混合细胞悬液中含有干细胞，所述营养液中含有细胞培养基混合液，所以本发明的皮肤细胞具有以下优点：(1)细胞存活率高，且存活时间较长，具有良好的可注射性，通过喷涂的方式，将皮肤细胞喷雾喷射于皮肤损伤部位，操作简单；(2)永久性修复创面，尤其是瘢痕少、挛缩小、触感柔软、活动度好、无功能障碍。由于所述混合细胞悬液中的干细胞从自体组织中提取，所以本发明的皮肤细胞喷雾可以避免动物源性。
以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照以上较佳实施方式对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或等同替换都不应脱离本发明技术方案的精神和范围。