骨水泥、其制备方法和用途与流程

本发明一般涉及医用材料领域，并且更具体涉及骨水泥、其制备方法和用途。
背景技术：
：经皮椎体成型术是目前治疗骨质疏松性椎体压缩骨折的常用方法。使用的医用骨水泥一般是不可降解的聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)材料。pmma属于生物惰性材料，不能与宿主骨组织形成有机的化学界面结合，另外凝固聚合过程中产生热量、单体的细胞毒性作用、可操作时间有限等不足也限制了其临床应用。现有技术还有其它类型的骨水泥，如磷酸钙骨水泥和硫酸钙骨水泥。例如，中国专利申请cn104857568a公开了具有抗菌性的硫酸钙基骨水泥及其制备方法，并且考察了制得的骨水泥对铜绿杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等多种细菌的抑制作用。中国专利申请cn105396178a公开了一种可注射型抗菌骨水泥，其中利用银盐实现抗菌作用。中国专利申请cn106474561a公开了一种兼有成骨性和抗菌性的硫酸钙骨水泥的制备及应用，其中利用合成的掺锶和银的羟基磷灰石复合改性固相硫酸钙，掺杂的微量元素锶具有诱导成骨和抑制破骨的双重作用，银作为抗菌剂。尽管现有技术中存在这类骨水泥，一般认为它们仅仅是可用于骨缺损修复的材料，而并非针对骨质疏松性椎体压缩骨折的材料，不能满足糖皮质激素诱导骨质疏松(giop)导致的脊柱椎体压缩骨折的临床需求。临床上希望能够研制出一种生物可吸收的新型骨水泥，优选兼具抗菌性和成骨性的骨水泥，其可应用在骨质疏松性椎体压缩骨折患者中。技术实现要素：本发明至少部分基于申请人的下述发现：糖皮质激素诱导骨质疏松导致的脊柱椎体压缩骨折有以下临床特点：常为多发性骨折；每节骨折都比较轻微，多为终板下骨折；多合并内科病，并且应用激素，感染风险高；很多患者年龄较轻。pmma应用在糖皮质激素诱导骨质疏松(giop)导致的脊柱椎体压缩骨折的手术中有以下风险：多节段骨折导致术中骨水泥使用量大，骨水泥渗漏风险增高，一旦渗漏，则终生成为异物；多节段导致感染风险增高；部分患者年龄轻，不可吸收的骨水泥对未来其它可能的脊柱手术造成影响。针对上述发现，申请人提供了兼具抗菌和生物降解性能、并能在手术后一定时间起到力学支撑作用的复合磷酸钙骨水泥，专门针对并适用于糖皮质激素诱导骨质疏松(giop)导致的脊柱椎体压缩骨折的患者。这种新型水泥有以下特点：1.因为糖皮质激素诱导骨质疏松(giop)导致的脊柱椎体压缩骨折多为轻微骨折，所以对于抗压强度要求没有普通骨质疏松性骨折高；2.因为多合并内科病，并且应用激素，感染风险高，需要骨水泥具有一定的抗菌性；3.因为多节段骨折多，注射节段比较多，年轻化，因此对于可吸收、可降解以及促进骨形成的特性要求更高。出乎意料地，发明人还发现了本发明的骨水泥，例如特定含量(例如1-15wt％)的载纳米银硅藻土的骨水泥不仅具备良好的注射性能、凝固时间及压缩强度，而且兼具抗菌性和成骨性。一方面，本发明提供了骨水泥，优选兼具抗菌性和成骨性的骨水泥，所述骨水泥包含：50-92wt％，优选54-92％，优选72％α-磷酸三钙；3-10wt％，优选3-5％，优选4％二水磷酸氢钙；2-30wt％，优选2％-20wt％，优选20wt％淀粉，优选小麦淀粉、玉米淀粉和/或马铃薯淀粉；和0.5％-15wt％，优选5-15wt％，优选5％载纳米银硅藻土。在另一个实施方案中，载纳米银硅藻土占骨水泥的总量的1-10％，且更优选1-5％。在一个实施方案中，载纳米银硅藻土含有下列元素：5-20wt％或10-20at％的碳元素，优选11wt％或17at％的碳元素；45-60wt％或55-65at％的氧元素，优选54wt％或61at％的氧元素；25-35wt％或15-32at％的硅元素，优选32wt％或21at％的硅元素；和2-6wt％或0.3-0.6at％的银元素，优选3wt％或0.5at％的银元素。在一个实施方案中，所述载纳米银硅藻土是通过粒径20-40μm，优选20-35μm，优选30μm的盘状硅藻土制备的。在一个实施方案中，所述载纳米银硅藻土是通过将硅藻土颗粒加入银氨溶液搅拌，再加入葡萄糖，通过还原反应后，在硅藻土颗粒表面沉积银，形成银-硅藻土制备的。另一方面，提供了本申请的骨水泥的制备方法，其包括：(1)将α-磷酸三钙与二水磷酸氢钙按比例混合后，放入球磨罐，加入适量无水乙醇，球磨后烘干，然后研磨，过筛得到磷酸钙骨水泥固相粉末；(2)将磷酸钙骨水泥固相粉末与淀粉混合，形成磷酸钙骨水泥-淀粉粉末；(3)将载纳米银硅藻土与磷酸钙骨水泥-淀粉粉末混合，形成骨水泥固相粉末。在一个具体的实施方案中，α-磷酸三钙与二水磷酸氢钙按90-95:5-10，优选95:5的比例混合。在一个具体的实施方案中，淀粉的添加比为2-30wt％，优选20％。在一个具体的实施方案中，载纳米银硅藻土的添加比为0.5％-15wt％，优选1-10％，且更优选1-5％。在一个具体的实施方案中，所述淀粉为小麦淀粉。在一个具体的实施方案中，方法包括以下步骤：(1)按照磷酸钙骨水泥配方α-tcp:dcpd＝90-95:5-10，将α-tcp与dcpd混合，之后放入球磨罐，加入适量无水乙醇，球磨，优选以约464rpm的转速，持续约10小时后，放入例如约60℃烘箱中烘干，再于例如约80℃烘例如约2小时，然后研磨、过60目筛，得到cpc固相粉末；(2)将cpc与淀粉混合，淀粉种类选自小麦淀粉、玉米淀粉或马铃薯淀粉，淀粉添加比例为2-30wt％，优选2-20％，更优选20％，强度在12到35mpa之间；(3)将银-硅藻土颗粒与纯cpc粉末混合，用研钵混合均匀，形成骨水泥固相粉末。又一方面，提供了本申请的骨水泥在制备用于治疗骨折，优选糖皮质激素诱导骨质疏松导致的脊柱椎体压缩骨折或修复骨缺损的试剂盒中的用途。附图说明下文结合附图进一步说明本发明。图1：载纳米银硅藻土颗粒的扫描电子显微镜照片。通过扫描电子显微镜照片获得的本申请的载纳米银硅藻土颗粒的元素含量。图2：载纳米银硅藻土复合磷酸钙骨水泥的抗菌性。图3：体外羊椎体骨质疏松骨折填充实验。图4：大鼠股骨三点弯曲实验。具体实施方式定义下文提供以下定义以便于理解本发明。术语“抗菌”或“抗菌性”指抑制或杀死微生物，例如细菌，如革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌的能力。在一个实施方案中，抗菌性是指抑制或杀死大肠杆菌和/或枯草芽孢杆菌的能力。术语“成骨性”是指成骨细胞移至将要合成骨组织的部位，分泌，合成骨胶原及骨蛋白纤维，将钙，磷吸收到纤维的孔隙中进行沉淀结晶，形成成型的骨组织的能力。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。成骨细胞可以是小鼠成骨细胞mc3t3-e1。术语“骨水泥”是骨粘固剂的常用名，骨水泥是一种用于骨科手术的医用材料。生物骨水泥在发展过程中形成了两大体系：生物相容性较差的pmma骨水泥和生物相容性良好的可降解骨水泥。pmma骨水泥以聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥(polymethylmethacrylatecement,pmma)为代表。pmma属于生物惰性材料，不能与宿主骨组织形成有机的化学界面结合，另外凝固聚合过程中产生热量、单体的细胞毒性作用、可操作时间有限等不足也限制了其临床应用。磷酸钙骨水泥(calciumphosphatecement,cpc)是可降解骨水泥的代表，由一种或几种磷酸钙盐粉末的混合物与调和用的液相发生水化发应，在生理条件下能自固化，如：在温度(37℃)、湿度(100％)条件下发生水化反应得到与人体骨组织相近的固化产物－羟基磷灰石或透钙磷灰石，因此具有一定的可降解性和良好的生物相容性。术语“硅藻土”是一种硅质岩石，由无定形的sio2组成，并含有少量杂质。硅藻土有许多不同的形状，如圆盘状、针状、筒状、羽状等并且具有各种大小。在一个实施方案中，硅藻土是粒径20-40μm，优选20-35μm，优选30μm的盘状硅藻土。术语“载纳米银硅藻土”是指通过物理或化学手段将银颗粒加载到硅藻土之上或之中获得的产物。在一个实施方案中，载纳米银硅藻土是通过将硅藻土颗粒加入银氨溶液搅拌，再加入葡萄糖，通过还原反应后，在硅藻土颗粒表面沉积银，形成银-硅藻土制备的。在一个实施方案中，载纳米银硅藻土含有下列元素：5-20wt％或10-20at％的碳元素，优选11wt％或17at％的碳元素；45-60wt％或55-65at％的氧元素，优选54wt％或61at％的氧元素；25-35wt％或15-32at％的硅元素，优选32wt％或21at％的硅元素；和2-6wt％或0.3-0.6at％的银元素，优选3wt％或0.5at％的银元素。在另一个实施方案中，载纳米银硅藻土占骨水泥的总量的0.5-15％，优选1-10％，且更优选1-5％。纳米银-硅藻土(nagdt)的制备发明人通过将硅藻土颗粒进行煅烧、分离和提纯后，对不同形状和大小的硅藻土进行毒性分析。通过硅藻土的生物相容性和毒性分析，发现粒径大约为30μm、盘状的硅藻土(dt30-disk)具有较好的生物相容性。将硅藻土颗粒(dt30-disk)加入银氨溶液搅拌，再加入葡萄糖，通过还原反应后，在硅藻土颗粒表面沉积银，形成银-硅藻土(nagdt)。本申请的骨水泥的制备磷酸钙骨水泥(cpc)配方为α-tcp:dcpd＝90-95:5-10。可以将α-tcp与dcpd按比例混合后，放入球磨罐，加入适量无水乙醇，球磨(例如以约464rpm的转速，持续约10小时)后，放入约60℃烘箱中烘干，再于约80℃烘约2小时，然后研磨、过60目筛，得到cpc固相粉末。然后，将cpc与淀粉混合(cpc-淀粉)，淀粉种类包括小麦淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉等，淀粉添加比例为2-30wt％，优选2-20％，更优选20％，强度在12到35mpa之间。将银-硅藻土颗粒与纯cpc粉末混合，用研钵混合均匀，形成抗菌骨水泥固相粉末。在一个实施方案中，银-硅藻土颗粒添加量为0.5-15重量份，更优选为1-10重量份。在另一个实施方案中，银-硅藻土颗粒与纯cpc粉末混合，添加比为20wt％、10wt％、5wt％、或1wt％。载纳米银硅藻土可以占骨水泥的总量的0.5-15％，优选1-10％，且更优选1-5％。缩写：α-tcp：α-磷酸三钙dcpd：二水磷酸氢钙cpc：磷酸钙骨水泥cps：cpc-淀粉骨水泥mma：甲基丙烯酸甲酯nagdt：纳米银-硅藻土dt30-disk：30μm盘状的硅藻土giop：糖皮质激素诱导的骨质疏松wt％：重量百分比at％：原子百分比实施例下文提供了本申请的具体实施例以进一步阐述本发明。本领域技术人员应当理解这些实施例仅仅是示例性的，而非限制性的。本发明的范围仅由所附权利要求书的范围限定。材料和方法金黄色葡萄球菌：atcc25923大肠杆菌：atcc25922硅藻土：国药集团货号222470010成骨细胞mc3t3-e1：购自中国科学院细胞库/干细胞库sd大鼠：苏州恒新生物医药有限公司磷酸钙骨水泥的制备将α-tcp与dcpd按照95:5的比例混合后，放入球磨罐，加入适量无水乙醇，以464rpm的转速球磨10小时后，放入60℃烘箱中烘干，再于80℃烘2小时，然后研磨，过60目筛，得到cpc固相粉末。cpc-淀粉骨水泥的制备将cpc粉末与小麦淀粉混合，形成混合cpc-小麦淀粉粉末，小麦淀粉的质量比为20wt％，具体方法为：将处理好的cpc粉末与淀粉分别称量后放入研钵，用钵杵将其混合均匀。纳米银-硅藻土(nagdt)的制备将硅藻土颗粒进行煅烧、分离和提纯后，对不同形状和大小的硅藻土进行毒性分析：通过硅藻土的生物相容性和毒性分析，发现粒径大约为30μm、盘状的硅藻土(dt30-disk)具有较好的生物相容性。因此，在本实施例中使用此类硅藻土制备纳米银-硅藻土(nagdt)。将硅藻土颗粒(dt30-disk)加入银氨溶液搅拌，再加入葡萄糖，通过还原反应后，在硅藻土颗粒表面沉积银，形成银-硅藻土(nagdt)。具体地，将硅藻土颗粒加入到tollens试剂中，该试剂是通过将25-28％nh3·h2o溶液滴加到0.1magno3溶液中而制备的。搅拌30分钟后，加入0.2m葡萄糖溶液，在室温下反应1小时。反应完成后，得到黑色混浊液体，将固体过滤并在60℃下干燥24小时以收集nagdt颗粒。通过扫描电子显微镜(sem,feiquanta250)及附加的分散x射线光谱法(teameds,ametek)和x射线衍射(xrd)(apexduo,brukeraxs)分析硅藻土和nagdt的形态和组分。如图1所示，所得的纳米银-硅藻土包含11.41wt％，17.38at％的c元素，53.59wt％，61.30at％的o元素，31.93wt％，20.80at％的si元素，3.08wt％，0.52at％的ag元素。抗菌骨水泥的制备将银-硅藻土颗粒与纯cpc粉末混合，质量比为20wt％、10wt％、5wt％、或1wt％，用研钵混合均匀，形成抗菌骨水泥固相粉末。压缩强度测定将骨水泥粉末按照0.25-0.6ml/g的液固比与固化液0.25m的na2hpo4水溶液进行混合，在下述实施例中以0.5ml/g的液固比进行混合，形成柔软均匀的膏状物，然后将膏状物填入标准模具中，形成直径6mm、高12mm的骨水泥圆柱体(iso5833:2002)。在37℃、60％湿度的烘箱中固化3天后，取出，圆柱上下表面用800目砂纸打磨光滑平行，单轴力学试验机上进行力学压缩实验。记录其力学压缩曲线，取其第一个最高点为最大力学压缩，计算压缩强度。注射性能测定将上述骨水泥膏体装入1ml注射器，在不大于50n的力下缓慢注射，然后称量注射出膏体的质量，注射性能的计算方法为：注射性能(％)＝注射出膏体的质量m/初始膏体的质量m0x100％。凝固时间测定将骨水泥膏体装入模具，表面抹平，放入37℃的烘箱，参照astmc266-04标准，用gilmore双针法、每隔60秒进行凝固时间测试。初凝时间用轻针(113.4g，直径2.12mm)测试，针在骨水泥表面插入不超过1.5mm时可判定初凝；终凝时间用重针(453.6g，直径1.06mm)测试，当针在骨水泥表面不能留下完整的圆环时确定骨水泥已发生终凝。实施例1：抗菌骨水泥的物理性质研究提供如上述材料和方法中制备的cpc、cpc-淀粉、cpc-淀粉/nagdt(1wt％)、cpc-淀粉/nagdt(5wt％)和cpc-淀粉/nagdt(10wt％)，并且按照上述方法分别测定各种骨水泥体系的注射性能、凝固时间及压缩强度。在表1中显示了测定结果。表1：各种骨水泥体系的注射性能、凝固时间及压缩强度我们发现与cpc和cpc-淀粉相比，cpc-淀粉/nagdt(1wt％)、cpc-淀粉/nagdt(5wt％)和cpc-淀粉/nagdt(10wt％)在注射性能、初凝时间ti(min)、终凝时间tf(min)和压缩强度(mpa)上都获得了相当或更好的效果，其中令人惊讶地，我们发现cpc-淀粉/nagdt的注射性能、初凝时间、终凝时间tf和压缩强度在nagdt为0wt％-5wt％时随浓度增加而提升，当nagdt浓度大于5wt％时有随浓度增加而降低的趋势。实施例2：抗菌骨水泥的抗菌研究在抗菌实验中，选用金黄色葡萄球菌(革兰氏阴性菌)和大肠杆菌(革兰氏阳性菌)两种细菌进行试验。将含1w.t.％的银硅藻土复合磷酸钙骨水泥与pbs溶液混合，形成不同nagdt含量的梯度溶液，分别为1、0.5和0.1mg/ml，以检测载银硅藻土复合骨水泥的抗菌性能。将1接种环细菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别接种入10mllb液体培养基在37℃下以220rpm进行培养，培养12小时后，收集全部样品，并通过超声使全部细菌悬浮于lb培养基中，统计菌落数。然后将50mllb液体培养基与100μl密度为105cfu/ml的细菌悬液混合，混合均匀后，取1ml的混合培养液在190rpm、37℃条件下培养4小时。4小时后，接种到lb琼脂板上固化，在固化后，将细菌培养板翻转，用封口膜密封，放置在细菌培养箱中于37℃培养48小时。48小时后，取出细菌培养板，计算出不同实验组的菌落数。如图2所示，随着银-硅藻土浓度的升高，菌落数发生了明显的变化，当浓度达到0.5mg/ml时，琼脂板上菌落只有少数几个，基本满足抗菌性能，浓度达到1mg/ml时，琼脂板上已经没有菌落，即表明所有的细菌都已经死亡，这表明针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，银-硅藻土具有良好的抗菌性能。我们还对实施例1中所述的cpc-淀粉、cpc-淀粉/nagdt(1wt％)、cpc-淀粉/nagdt(5wt％)、和cpc-淀粉/nagdt(10wt％)进行了抑菌圈实验。具体地，将上述骨水泥制成圆片(ф6mmx3mm)，置于上文制备的细菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养板上，用封口膜密封，放置在细菌培养箱中于37℃培养48小时。48小时后，取出细菌培养板观察。我们发现cpc-淀粉无抑菌圈，cpc-淀粉/nagdt(1wt％)、cpc-淀粉/nagdt(5wt％)、和cpc-淀粉/nagdt(10wt％)均能够形成抑菌圈，表明cpc-淀粉/nagdt(1wt％)、cpc-淀粉/nagdt(5wt％)、和cpc-淀粉/nagdt(10wt％)都有效能够抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。cpc-淀粉/nagdt(5wt％)和cpc-淀粉/nagdt(10wt％)具有大致相同直径的抑菌圈且大于cpc-淀粉/nagdt(1wt％)的抑菌圈。实施例3：抗菌骨水泥的生物相容性将含1w.t.％的银硅藻土复合磷酸钙骨水泥与含10％牛血清和1％青链霉素双抗的dmem培养基溶液混合形成浸提液，用dmem培养基配制形成不同nagdt含量的梯度溶液，分别为5、2.5、1、0.5、0.1mg/ml，以检测其生物相容性。以小鼠成骨细胞mc3t3-e1(上海细胞库)为例，以浸提液为培养基，将其按照1x104个细胞/cm2的密度种植在24孔板上。37℃培养箱培养72小时后，计算细胞增殖密度(如表2)。发现当nagdt含量在1mg/ml及以下时，对细胞的增殖生长没有影响，样品生物相容性良好。我们还对实施例1中所述的cpc-淀粉、cpc-淀粉/nagdt(1wt％)、cpc-淀粉/nagdt(5wt％)、和cpc-淀粉/nagdt(10wt％)、以及另外的cpc-淀粉/nagdt(20wt％)进行生物相容性测试。具体地，将小鼠成骨细胞mc3t3-e1按照1x104个细胞/cm2的密度种植dmem培养基平板上，将制成圆片(ф6mmx3mm)的上述各自类型的骨水泥置于平板中央，37℃培养箱培养72小时后观察。我们发现当采用cpc-淀粉、cpc-淀粉/nagdt(1wt％)和cpc-淀粉/nagdt(5wt％)时均没有明显的抑制圈，cpc-淀粉/nagdt(10wt％)仅具备微弱的抑制圈，但是当采用cpc-淀粉/nagdt(20wt％)时，可观察到抑制圈的存在。这表明cpc-淀粉/nagdt(1wt％)、cpc-淀粉/nagdt(5wt％)、和cpc-淀粉/nagdt(10wt％)具备良好的生物相容性。表2样品细胞密度(细胞/cm2)对照36000±30000.1mg/mlnagdt30000±32000.5mg/mlnagdt28300±19001mg/mlnagdt25600±27002.5mg/mlnagdt5000±7505mg/mlnagdt1800±650本发明人发现了含有特定含量(例如1-15wt％)的载纳米银硅藻土的本发明的骨水泥不仅具备良好的注射性能、凝固时间及压缩强度，而且兼具抗菌性和成骨性。实施例4：抗菌骨水泥和聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)骨水泥的比较研究在体外羊椎体骨质疏松骨折模型中，通过分别注射填充抗菌骨水泥cpc-/nagdt(5wt％)和聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)骨水泥，37℃固化3天后，单轴力学压缩试验机测试。我们发现填充两种骨水泥的椎体均不会被压坏(如图3)，且填充抗菌骨水泥的椎体的力学压缩强度最高可达到2800±480n，略高于填充pmma骨水泥的椎体(2650±300n)，并且与正常未骨质疏松椎体的力学压缩强度相似(3200n)。实验结果表明抗菌cpc骨水泥适用于giop，并且本申请的骨水泥可降解和可吸收性，即使用量很大，最后也能完全吸收，不会对今后的治疗和手术造成影响。在体内sd大鼠股骨缺损模型中，分别填充抗菌骨水泥cpc-淀粉/nagdt(5wt％)和pmma骨水泥，正常饲养12周后，取出大鼠股骨，进行三点弯曲实验(实验如图4)，发现填充抗菌骨水泥cpc-淀粉/nagdt(5wt％)的股骨三点弯曲强度仍然高于填充pmma骨水泥的股骨。因此此体内填充实验也证明抗菌骨水泥可以适用于骨缺损的填充与修复。尽管已经参照上面提供的实施例描述了本发明，但是应该理解，可以在不脱离本发明的情况下进行各种修改。因此，本发明仅由权利要求书限定。当前第1页12