一种用于倒置荧光显微镜下成像的活体小动物窗口的固定装置的制作方法

本实用新型涉及仪器工程技术，具体地，涉及一种用于倒置荧光显微镜下成像的活体小动物窗口的固定装置。

背景技术：

在过去二十年中，荧光蛋白技术和活体显微镜技术的发展，扩大了我们对单个细胞信息的认识，从而也促使我们对细胞生物学的理解迈出了巨大的一步。这些大多数的知识主要是通过细胞体外培养获得的，体外培养实验操作方面的用途非常之大。然而，它们并不能完全作为复杂的多细胞生物学的真实代表。线虫成像方法的发展成为了解决这个问题的第一步，它提供了容易执行的遗传操作并因此揭示组织中发生的几个生理过程。最近，光学显微镜成像的技术已经扩展到活体哺乳动物模型中，由此也开发了一种称为活体显微镜的新的成像方法。快速地，活体成像已经成为几个领域的重要工具，如神经生物学，免疫学和肿瘤生物学。

此外，在过去五年中，活细胞成像的成功打开了分子水平和生理条件下研究细胞生物学的大门。通过改进显微镜，用于成像分析的光学和软件以及能够在时间和空间上控制给定基因的表达的新型遗传工具，使得这些进步成为可能。特别地，几个表达荧光标记蛋白质的敲入小鼠已经以相对较低的成本获得了可用性，使科学家能够解决几个关键的科学问题。然而，这种技术无法实现重复成像，甚至当动物生物体被严格测量和控制时，活体成像只能进行几小时。为了将成像时间延伸至几天或几个月，甚至更久，活体成像窗口技术得到了发展。通过该成像窗口，能够对活体动物进行细胞水平的成像，并能对活体组织内的各类型细胞、非细胞结构因子(如：细胞外基质)、荧光标记蛋白或荧光生物传感器可以进行可视化的动态研究。通过利用成像窗口，可以对活体组织重复成像，组织的可视化时间延伸至几天或几个月，更甚至达到一年。成像期间动物可以从麻醉中恢复，避免了因麻醉时间过长而导致死亡率增加。并且成像窗口的使用，实现了对动物体内深处组织的反复成像，通过手术暴露成像部位，进而可视化小肠、肾脏、脾脏、胰腺和肝脏等腹部器官。

在活体研究中,运用倒置荧光显微镜对成像窗口观察是由于小鼠体位容易发生大幅度的变化，再者，变化的一瞬间活体成像的数据可能就会发生非常大的变化，一些有重大意义的发现往往会淹没其中。因此,要想发挥运用倒置荧光显微镜在活体成像窗口的中优势，稳定的成像窗口维持与固定是亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

本实用新型的目的是提供一种用于倒置荧光显微镜下成像的活体小动物窗口的固定装置，该固定装置可方便地对活体小动物进行固定，并且能方便地应用于倒置荧光显微镜中活体小动物窗口的成像。

本实用新型提供一种用于倒置荧光显微镜下成像的活体小动物窗口的固定装置，活体小动物待观察的组织或器官处开设有窗口，该固定装置包括底座和用于装载活体小动物的承载装置，所述承载装置可拆卸地连接于所述底座上；所述承载装置上开设有用于固定活体小动物组织或器官窗口的开口，所述底座上开设有和所述承载装置对应的成像窗口用于活体小动物成像。

可选地，所述承载装置上的所述开口、所述活体小动物组织或器官窗口以及所述底座的成像窗口均为圆形。

可选地，所述承载装置为空心的圆柱筒。

可选地，所述固定装置还包括固定支架，所述固定支架连接于所述底座上，所述承载装置可拆卸地连接于所述固定支架上。

可选地，所述固定支架为两个并分别连接于所述底座上所述成像窗口的两侧，所述固定支架上开设有可容纳所述承载装置端部的连接孔，所述承载装置可拆卸地连接于所述两个固定支架之间。

可选地，所述固定支架上开设有穿孔，所述固定支架还包括螺钉，螺钉可拆卸地穿过所述穿孔后将所述承载装置固定于所述固定支架的所述连接孔内。

可选地，所述承载装置上的所述开口与所述活体小动物组织或器官窗口的直径相同；所述底座的成像窗口的直径大于所述活体小动物组织或器官窗口的直径。

可选地，所述底座的成像窗口的直径与所述活体小动物组织或器官窗口的直径的比值为(1.1-3)：1。

通过本实用新型的固定装置可以方便地对活体动物成像窗口进行固定，固定装置非常适合用于倒置荧光显微镜对活体小动物的器官、组织等进行活体窗口成像观察，使用所述固定装置对小动物的活体窗口固定后能够增加小动物的舒适度，并且可以有效地掌控小动物成像过程中的体位，能够更方便、更长时间、更高效地对小动物的不同部位进行观察研究。

本实用新型的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本实用新型的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本实用新型，但并不构成对本实用新型的限制。在附图中：

图1是本实用新型的用于倒置荧光显微镜下成像的活体小动物窗口的固定装置的一种具体实施方式的结构示意图。

附图标记说明

1底座 2固定支架 3承载装置

4螺钉 1-1成像窗口 2-1连接孔

2-2穿孔 3-1开口

具体实施方式

以下结合附图对本实用新型的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本实用新型，并不用于限制本实用新型。

在本实用新型中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上、下、”通常是指用于倒置荧光显微镜下成像的活体小动物窗口的固定装置在正常使用状态下定义的，具体可参见附图1所示的图面方向，“内、外”是指相应轮廓的内外。

本实用新型提供一种用于倒置荧光显微镜下成像的活体小动物窗口的固定装置，活体小动物待观察的组织或器官处开设有窗口，如图1所示，该固定装置可有包括底座1和用于装载活体小动物的承载装置3，所述承载装置3可以可拆卸地连接于所述底座1上；所述承载装置3上可以开设有用于固定活体小动物组织或器官窗口的开口3-1，所述底座1上可以开设有和所述承载装置3对应的成像窗口1-1用于活体小动物成像。

活体小动物开设的窗口可以为在活体小动物上开设的刀口用以暴露出小动物的器官或组织等进而方便观察研究，具体地可以通过活体小动物窗口观察小动物活体的肾脏、脾脏、小肠、胰腺和脑部等。

如图1所示，所述承载装置3上的所述开口3-1、所述活体小动物组织或器官窗口以及所述底座1的成像窗口1-1可以均为圆形。

如图1所示，所述承载装置3可以为空心的圆柱筒。

优选地，所述圆柱筒的内径可以略大于待观察活体小动物的大小，空心圆柱筒沿长度方向的两端可以均开设出口，其中一端的出口可以用于固定并露出活体小动物的头部，另一端的出口可以用于固定并露出活体小动物的尾部，这样小动物在承载至所述承载装置时仍然能够很好地进行呼吸和尾部摆动，小动物在承载装置中有更好的舒适度，更加有利于小动物的身体健康以及成像观察的顺利开展。

如图1所示，所述固定装置还可以包括固定支架2，所述固定支架2可以连接于所述底座1上，所述承载装置3可以可拆卸地连接于所述固定支架 2上。

所述固定支架2可以固定连接在底座1上，或者可以可拆卸地连接在底座1上；优选地，所述固定支架2在所述底座1上的位置可以调节。

如图1所示，所述固定支架2可以为两个并可以分别连接于所述底座1 上所述成像窗口1-1的两侧，所述固定支架2上可以开设有可容纳所述承载装置3端部的连接孔2-1，所述承载装置3可以可拆卸地连接于所述两个固定支架2之间。

所述固定支架2可以可拆卸地连接在底座1上，固定支架2在底座1上的连接位置可以可调节，这样，两个固定支架2之间的距离可以方便地调节为恰好可以与所述承载装置3的长度相匹配，所述承载装置3可以合适地连接至两个固定支架2之间。

如图1所示，所述固定支架2上可以开设有穿孔2-2，所述固定支架2 还可以包括螺钉4，螺钉4可以可拆卸地穿过所述穿孔2-2后将所述承载装置3固定于所述固定支架2的所述连接孔2-1内。

通过所述螺钉4可以方便地对承载装置3和固定支架2间的连接松紧度进行调节，可以通过转动螺钉4使承载装置3和固定支架2间松绑后转动承载装置3，调整好后可以反向转动螺钉4使承载装置3和固定支架2间紧密连接。

在使用本实用新型上述的用于倒置荧光显微镜下成像的活体小动物窗口的固定装置时，首先可以将麻醉后且开设了观察器官或组织窗口的活体小动物放入所述承载装置3中，使活体小动物窗口与承载装置3的开口3-1位于相同位置，即通过承载装置3的开口3-1恰能很好地观察到活体小动物窗口内的器官或组织，同时，使活体小动物的头部和尾部分别经过承载装置3 两端的开口穿出；然后，将装载有活体小动物的承载装置3的两端分别固定至底座1上的两个固定支架2中，使活体小动物窗口、承载装置3的开口3-1 和底座的成像窗口1-1恰在同一条竖直直线上，即将底座1向上举起一定高度后，从底座1底部从下往上看时，通过底座1的成像窗口1-1能穿过承载装置3的开口3-1看到活体小动物窗口，进而可以观察研究活体小动物窗口暴露的内脏或组织，在这个过程中，可以适当地松开所述螺钉4后转动承载装置3，调整至合适位置后再将所述螺钉4拧紧即可；最后，可以将固定有活体小动物的固定装置放置于倒置显微镜载物台上，即可进行成像观察。通过本实用新型的固定装置固定后的活体小鼠的肝脏和肾脏可以通过倒置荧光显微镜很好地成像。

如图1所示，所述承载装置3上的所述开口3-1与所述活体小动物组织或器官窗口的直径可以相同；所述底座1的成像窗口1-1的直径可以大于所述活体小动物组织或器官窗口的直径。

所述底座1的成像窗口1-1的直径与活体小动物组织或器官窗口直径的比值可以为(1.1-3)：1。

如图1所示，所述底座1的成像窗口1-1的直径与所述活体小动物窗口的直径的比值可以为(1.1-3)：1。通过设置成像窗口1-1直径与活体小动物窗口直径的比值为上述数值范围，可以更加方便操作人员对活体小动物窗口中暴露出来的器官、组织等进行观察。

以下通过实施例进一步对本实用新型进行说明，以下实施例仅用于说明和解释本实用新型，并不用于限制本实用新型。

在以下实施例中，IIW指intravital imaging window，所使用的倒置显微镜可以为Nikon倒置荧光显微镜，型号为Ti-U。

实施例1：固定装置在小鼠肝脏活体成像中的应用

小鼠肝脏活体成像窗口的制备步骤：

1)高压消毒手术器械，使用医用酒精消毒手术台区域；

2)经腹腔注射水合氯醛(4％，350mg/kg)麻醉小鼠，小鼠麻醉后，腹部脱毛，常规手术消毒；

3)使用镊子夹住皮肤，并使用显微切割剪刀从剑突开始切开，纵向形成一个15mm的中线切口，分离皮肤与腹部肌肉并打开腹腔；

4)用止血钳抓住剑突，尽可能地夹紧；

5)在颅内方向提起止血钳，同时，通过使用潮湿(PBS)棉签轻轻地擦拭肝脏，可看到镰状韧带；

6)使用止血钳夹紧剑突后5分钟后，并除去剑突；

7)使用棉签拨动肝脏，然后使用镊子将棉纱布横向插入肝脏和隔膜之间产生的空隙中；

8)使用针线穿过腹壁和皮肤，从切口的尾端开始，距离边缘约1毫米，先通过缝合线穿过皮肤，再通过相对的腹壁从外部到内部。接下来，沿着切口移动3mm，并从内向外再次通过缝合线穿过腹壁和皮肤。沿着整个伤口边缘重复动作缝合，最后形成一个圆形缝合线。为了能够将缝合的皮肤和腹壁固定在环槽中，不要使切口太大。最后一个针脚应位于距离第一个入口约 3毫米处，确保使环留在外面；

9)使用镊子将腹壁和皮肤小心地放置在IIW的凹槽中；

10)逐个拉线缝合线，将缝合线收紧在IIW的凹槽中。

11)在IIW的内圈表面涂胶，然后将事先准备好的玻璃片紧贴于内槽中。固定装置与活体成像窗口的结合：

小鼠诱导麻醉后，将其放置于空心圆柱筒内，并使小鼠肝脏部位体表的成像窗口与圆柱筒壁的开口吻合，再将圆柱筒放于V型固定架上，转动圆柱筒使开口与底座上的窗口吻合，用螺钉固定紧，最后将整个固定装置放于倒置显微镜载物台上，即可进行成像观察。

实施例2：固定装置在小鼠肾脏活体成像中的应用

小鼠肾脏活体成像窗口的制备步骤：

1)高压消毒手术器械，使用医用酒精消毒手术台区域；

2)经腹腔注射水合氯醛(4％，350mg/kg)麻醉小鼠，小鼠麻醉后，背部脱毛，常规手术消毒；

3)经腹腔注射水合氯醛(4％，350mg/kg)麻醉小鼠，于背部中部、脊柱左侧0.2cm处纵行切开皮肤(0.8-1cm)，分离皮下结缔组织，离断背部肌肉进入腹腔，探查并暴露左肾，可见正常肾脏呈现鲜红色；

7)使用棉签拨动肾脏，然后使用镊子将棉纱布横向插入肾脏和隔膜之间产生的空隙中；

8)使用针线穿过腹壁和皮肤，从切口的尾端开始，距离边缘约1毫米，先通过缝合线穿过皮肤，再通过相对的腹壁从外部到内部。接下来，沿着切口移动3mm，并从内向外再次通过缝合线穿过腹壁和皮肤。沿着整个伤口边缘重复动作缝合，最后形成一个圆形缝合线。为了能够将缝合的皮肤和腹壁固定在环槽中，不要使切口太大。最后一个针脚应位于距离第一个入口约 3毫米处，确保使环留在外面；

9)使用镊子将腹壁和皮肤小心地放置在IIW的凹槽中；

10)逐个拉线缝合线，将缝合线收紧在IIW的凹槽中；

11)在IIW的内圈表面涂胶，然后将事先准备好的玻璃片紧贴于内槽中；固定装置与活体成像窗口的结合：

小鼠诱导麻醉后，将其放置于空心圆柱筒内，并使小鼠肾脏部位体表的成像窗口与圆柱筒壁的开口吻合，再将圆柱筒放于V型固定架上，转动圆柱筒使开口与底座上的窗口吻合，用螺钉固定紧，最后将整个固定装置放于倒置显微镜载物台上，即可进行成像观察。

通过上述实施例可以看出，本实用新型的固定装置可以方便地对成像窗口进行维持和固定，方便对活体动物进行细胞水平的成像，并能对活体组织内的各类型细胞、非细胞结构因子(如：细胞外基质)、荧光标记蛋白或荧光生物传感器可以进行可视化的动态研究。通过利用该固定装置，可以对活体组织重复成像，组织的可视化时间延伸至几天或几个月，更甚至达到一年。成像期间动物可以从麻醉中恢复，避免了因麻醉时间过长而导致死亡率增加。并且该固定装置对成像窗口的维持与固定，实现了对动物体内深处组织的反复成像，通过手术暴露成像部位，进而可视化小肠、肾脏、脾脏、胰腺和肝脏等腹部器官。

以上结合附图详细描述了本实用新型的优选实施方式，但是，本实用新型并不限于上述实施方式中的具体细节，在本实用新型的技术构思范围内，可以对本实用新型的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本实用新型的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本实用新型对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本实用新型的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本实用新型的思想，其同样应当视为本实用新型所公开的内容。