由多能性干细胞的慢性肺疾病的改善及治疗的制作方法

本发明涉及在再生医疗中的细胞制剂。更具体而言，涉及含有多能性干细胞的在慢性肺疾病的治疗中有效的细胞制剂及新的治疗方法。

背景技术：

慢性肺疾病(chroniclungdisease；cld)、特别是新生儿的慢性肺疾病是新生儿医疗的重大并且频度高的并发症，确认为由于呼吸窘迫综合征等的呼吸障碍而受人工换气疗法的早产儿的一组，是慢性的肺的病变。当今，伴随新生儿医疗的进步，在此20年间先进诸国的出生体重不足1500g的婴儿的生存率从不足70％升高至80％以上，cld的罹患率在胎不足28周的婴儿中是53.2％、在出生体重不足1000g的婴儿中依然是40％的高率。

关于新生儿慢性肺疾病，根据2001年国际上提倡的定义，是“在胎不足32周的早产儿中，在修正36周或至出院前需要超21％的氧疗法28天以上的婴儿”，根据其氧依赖度进行重症度分类。慢性肺疾病有即使在出院后也以在家氧疗法作为必要的情况，再者，是幼儿期的呼吸器感染症的住院等考虑医疗经济上重要的疾病。另外，慢性肺疾病不仅是新生儿及幼儿，甚至波及至青年期的呼吸功能的降低也成为大的问题。

至今认为，新生儿慢性肺疾病是在肺未成熟性或表面活性剂缺乏状态下，再加上感染、动脉管未闭症、氧毒性、人工换气等的损伤而因肺组织的发育异常而至气肿化、纤维化，但近年认为，新生儿慢性肺疾病不仅是简单的肺的伤害，是发育过程中的未成熟肺出胎外而成长的过程中加各种各样的损伤而肺泡或血管系统的发达停止的状态。

此疾病的治疗法进行作为对症疗法施用的氧浓度的限制、水分的限制、由利尿药的对肺循环的水分负荷减轻、支气管扩张剂或呼吸刺激剂的施用、期待抗炎症作用或抗浮肿作用的类固醇施用等。例如，在专利文献1中，为了降低呼吸窘迫综合征患者患新生儿慢性肺疾病的风险，提议组合类固醇剂及肺表面活性剂的应用于气管内施用的医药组合物。但是，对于类固醇，由于畏惧向成长期的中枢神经系统的副作用，目前仅对于重病例拯救性地进行短期少量施用。这样，对于慢性肺疾病是对症疗法地进行治疗，旨在该疾病的根治的治疗药及治疗法则未被报告。

近年，在再生医疗领域中，对于各种各样的疾病研究使用干细胞的细胞疗法，在也进行向临床的应用中，期待干细胞应用于慢性肺疾病、例如支气管肺发育异常症(bpd)的改善或治疗(非专利文献1～3)。例如，已知骨髓间充质细胞级分(msc)有从成体单离，分化为骨、软骨、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌等的能力(非专利文献4及5)。但是，msc是含各种各样的细胞的细胞群，不知其分化能力的实体，治疗效果上偏差大。另外报告了作为成体来源的多能性干细胞，ips细胞(专利文献2)除了在ips细胞的建立中，以向体细胞导入对于作为间充质细胞的皮肤成纤维细胞级分特定的基因或特定的化合物这样的极其复杂的操作作为必要，还由于ips细胞有高的肿瘤形成能力，向临床应用存在极其高的障碍。

由作为本发明人的一人的出泽氏的研究得知，存在于间充质细胞级分，无诱导操作地得到的将ssea-3(stage-specificembryonicantigen-3(阶段-特异性胚胎抗原-3))作为表面抗原表达的多能性干细胞(multilineage-differentiatingstressenduringcells(多系-分化压力耐受细胞)，muse细胞)担负间充质细胞级分所具有的多能性，有可应用于旨在组织再生的疾病治疗的可能性。另外还得知，muse细胞可通过将间充质细胞级分用各种应激刺激浓缩(专利文献3；非专利文献6)。但是，还不知在慢性肺疾病的改善及/或治疗中使用muse细胞而得到了期待的治疗效果的例。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：特开2007-262064号公报

专利文献2：专利第4183742号公报

专利文献3：国际公开第2011/007900号

【非专利文献】

非专利文献1：chou,h.c.,etal.,am.j.transl.res.,vol.8,p.342-353(2016)

非专利文献2：kim,y.e.,etal.,pediatricres.,2016,doi：10.1038/pr.2016.88

非专利文献3：luan,y.,etal.,mol.med.rep.,vol.11,p.1945-1950(2015)

非专利文献4：dezawa,m.,etal.,j.clin.invest.,vol.113,p.1701-1710(2004)

非专利文献5：dezawa,m.,etal.,science,vol.309,p.314-317(2005)

非专利文献6：wakao,s,etal.,proc.natl.acad.sci.usa,vol.108,p.9875-9880(2011)

【发明的概要】

【发明要解决的课题】

本发明旨在提供在再生医疗中使用多能性干细胞(muse细胞)的新的医疗用途。更具体而言，本发明旨在提供含muse细胞的在慢性肺疾病(cld)的治疗中有效的细胞制剂及医药组合物、以及新的治疗方法。

【用于解决课题的手段】

本发明人发现，通过制作高氧负荷导致的慢性肺疾病模型大鼠，由静脉注射施用muse细胞而改善慢性肺疾病，从而完成本发明。

即，本发明如下所述。

[1]用于改善及/或治疗慢性肺疾病的细胞制剂，其含从生物体的间充质组织或培养的间充质细胞分离的ssea-3阳性的多能性干细胞。

[2]上述[1]所述的细胞制剂，其含由外部应激刺激浓缩ssea-3阳性的多能性干细胞的细胞级分。

[3]上述[1]或[2]所述的细胞制剂，其中上述多能性干细胞是cd105阳性。

[4]上述[1]～[3]之任一项所述的细胞制剂，其中上述多能性干细胞是cd117阴性及cd146阴性。

[5]上述[1]～[4]之任一项所述的细胞制剂，其中上述多能性干细胞是cd117阴性、cd146阴性、ng2阴性、cd34阴性、vwf阴性、及cd271阴性。

[6]上述[1]～[5]之任一项所述的细胞制剂，其中上述多能性干细胞是cd34阴性、cd117阴性、cd146阴性、cd271阴性、ng2阴性、vwf阴性、sox10阴性、snai1阴性、slug阴性、tyrp1阴性、及dct阴性。

[7]上述[1]～[6]之任一项所述的细胞制剂，其中上述多能性干细胞是有以下的性质的全部的多能性干细胞：

(i)端粒末端转移酶活性低或无；

(ii)具有分化为三胚层之任一胚层的细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；及

(iv)具有自我更新能力。

[8]上述[1]～[7]之任一项所述的细胞制剂，其中慢性肺疾病选自支气管肺发育异常症(bpd)、wilson·mikity综合征(wms)、新生儿持续性肺高血压症(pphn)、及新生儿高血压症。

[9]上述[1]～[8]之任一项所述的细胞制剂，其中上述多能性干细胞有在肺组织植活的能力。

[10]上述[1]～[9]之任一项所述的细胞制剂，其中向人新生儿、乳儿或幼儿对象作为治疗有效量以约1×10⁴个细胞/个体～约3×10⁸个细胞/个体施用上述多能性干细胞。

[11]上述[1]～[10]之任一项所述的细胞制剂，其中向人新生儿、乳儿或幼儿对象作为治疗有效量而以将该对象每一个体约3×10⁴个细胞/kg～约3×10⁷个细胞/kg体重换算的细胞量施用上述多能性干细胞。

【发明的效果】

本发明通过对于患慢性肺疾病的对象(主要是新生儿)，将muse细胞从静脉等施用，可发挥抗炎症作用及组织修复作用，构建正常的肺组织。

【附图的简单的说明】

【图1】显示被gfp标记的muse细胞在15日龄的慢性肺疾病模型大鼠的肺组织中植活。

【图2】显示评价muse细胞施用组(“muse”)、仅添加细胞悬浮液(hank’sbalancedsaltsolution(hank’s平衡盐溶液)，hbss)的组(“媒质”)、及假操作组(“假”)的慢性肺疾病模型大鼠的肺组织的结果。短期组以15日龄的大鼠作为受试对象，长期组以29日龄的大鼠作为受试对象。纵轴表示组织的比例。

【图3】显示评价muse细胞施用组(“muse”)、非muse细胞施用组(“非muse”)、仅添加细胞悬浮液(hbss)的组(“媒质”)、及假操作组(“假”)的慢性肺疾病模型大鼠的肺组织的结果。短期组以15日龄的大鼠作为受试对象，长期组以29日龄的大鼠作为受试对象。纵轴表示组织的比例。

【图4】显示评价在29日龄的大鼠的肺组织中的肺泡壁的比例的结果。肺泡壁比例越高，越表示紧密形成了肺泡壁而修复肺组织。

【图5】显示对在15日龄的慢性肺疾病模型大鼠的肺组织中表达的炎症性细胞因子的mrna表达量进行测定的结果。纵轴表示将假操作组设为1的相对的表达量。

【图6】显示进行muse细胞施用组(“muse组”)、仅添加细胞悬浮液(hbss)的组(“媒质组”)、及假操作组(“假组”)的慢性肺疾病模型大鼠的心脏评价的结果。纵轴表示用右心室壁的重量除以左心室壁和中隔的重量。

【图7】显示进行muse细胞施用组(“muse组”)、非muse细胞施用组(“非muse细胞”)、仅添加细胞悬浮液(hbss)的组(“媒质组”)、及假操作组(“假组”)的慢性肺疾病模型大鼠的心脏评价的结果。纵轴表示用右心室壁的重量除以左心室壁和中隔的重量。

【图8】显示以肺动脉血管的内壁率的变化作为指标，探讨在各种施用组中的肺动脉血管壁的肥厚的减轻的结果。图8(a)是将以肺动脉血管作为截面的组织使用抗α-sma抗体而进行染色的图。图8(b)显示对在短期组及长期组中的肺动脉细胞的内壁率进行测定的结果。

【图9】显示在各种施用组中探讨伴随慢性肺疾病而亢进的肺动脉细胞的新生的抑制的结果。图9(a)显示组织学地染色的结果，将增殖中的肺动脉细胞的核用抗ki-67抗体染色(绿色)，将α-平滑肌肌动蛋白用抗α-sma抗体染色(红色)，将肺动脉细胞的核用dapi染色(蓝色)。图9(b)显示由抗ki-67抗体的阳性率。

【图10】显示探讨肺泡清洗液中的炎症性细胞的数的结果。

【具体实施方式】

本发明涉及含ssea-3阳性的多能性干细胞(muse细胞)的用于改善及/或治疗慢性肺疾病的细胞制剂及医药组合物、以及新的治疗方法。接下来详细地说明本发明。

1.适用疾病和其诊断

本发明旨在使用含ssea-3阳性的多能性干细胞(muse细胞)的细胞制剂或医药组合物来改善及治疗慢性肺疾病。在日本在1996年由厚生劳动省研究班，将新生儿的“慢性肺障碍”定义为“由除先天畸形的肺的异常而需要氧施用的呼吸窘迫症状在新生儿期开始，超日龄28天而继续”，再者，为了以占肺障碍之中大部分的低出生体重儿的慢性肺障碍作为疾病表征，将“慢性肺疾病”确定为“在胸部x线照片上有伴随弥漫性不透亮像、泡沫状阴影等明显的异常见解的慢性肺障碍的情况”，根据背景因子及胸部x线见解，如以下的表1所示分类为i～vi的病型。

【表1】新生儿慢性肺疾病的疾病分类基准

i.新生儿的呼吸窘迫综合征(rds)先行的新生儿慢性肺障碍，且生后超过28天而呈胸部x线上弥漫性的泡沫状阴影或不规则索状气肿状阴影

ii.rds先行的新生儿慢性肺障碍，且生后超过28天而呈胸部x线上弥漫性的不透亮像，未至泡沫状阴影或不规则索状气肿状阴影

iii.rds不先行的新生儿慢性肺障碍，且脐带血的igm高值、绒毛膜羊膜炎、脐带炎等的出生前感染的疑似浓厚，并且，生后超过28天而呈胸部x线上弥漫性的泡沫状阴影或不规则索状气肿状阴影

iv.rds不先行的新生儿慢性肺障碍，且关于出生前感染不明，但生后超过28天而呈胸部x线上弥漫性的泡沫状阴影或不规则索状气肿状阴影

iii’.rds不先行的新生儿慢性肺障碍，且脐带血的igm高值、绒毛膜羊膜炎、脐带炎等的出生前感染的疑似浓厚，并且，生后超过28天而呈胸部x线上弥漫性的不透亮像，未至泡沫状阴影或不规则索状气肿状阴影

v.rds不先行的新生儿慢性肺障碍，且生后超过28天而呈胸部x线上弥漫性的不透亮像，未至泡沫状阴影或不规则索状气肿状阴影

vi.不被分类为上述i～v之任一者

慢性肺疾病的诊断如在上述基准中记载，由胸部x线诊断为以呼吸窘迫综合征中的多呼吸为主的症状，但否定其他呼吸器疾病的可能性之后的除外诊断成为基本。

一般而言，新生儿慢性肺疾病是肺的未成熟性、氧毒性、人工换气、炎症、感染、动脉管未闭症等作为危险因子被知，可被掌握为起因于肺泡或血管系的发达被抑制的状态的疾病，在作为本发明的适用疾病的慢性肺疾病中，虽不限定，也可含支气管肺发育异常症(bpd)、wilson·mikity综合征(wms)、新生儿持续性肺高血压症(pphn)、新生儿高血压症等。再者，支气管肺发育异常症(bpd)在1967年由northway等开始报告，一般在欧美成为慢性肺疾病的别名。

新生儿慢性肺疾病是早产儿多患的疾病，是超日龄28天或修正36周也以氧作为必要的呼吸障碍持续的疾病。作为慢性肺疾病的病因，如上记载，特别以高氧疗法(长期的高浓度吸收氧、高压的人工呼吸器管理等)或炎症作为起因的时候多。在与炎症(感染)的关联中，由绒毛羊膜炎、脐带炎等的出生前感染成为慢性肺障碍的病因，这些也可另外成为本发明的适用对象。绒毛羊膜炎是包胎儿的羊膜上波及炎症，胎盘炎症引起的感染症之一。发生绒毛羊膜炎，则在胎内炎症性物质成为高值，因此导致支气管或肺泡上皮的剥离、对于肺泡结构的再生必要的物质的降低，被认为患慢性肺障碍。

根据本发明，为了治疗上述的适用疾病，向对象施用后述的细胞制剂及医药组合物(以下，有时总的记为“移植”)，使适用疾病的改善及/或治疗变得可能。其中，“改善”是指伴随慢性肺疾病的各种症状的缓和及发展的抑制，优选是指将症状缓和至不妨碍日常生活的程度。另外，“治疗”是指抑制伴随慢性肺疾病的各种症状或使完全地消失。

2.细胞制剂及医药组合物

(1)多能性干细胞

在本发明的细胞制剂及医药组合物中使用的多能性干细胞，典型而言，是作为本发明人的一人的出泽氏在人生物体内发现其存在，命名为“muse(multilineage-differentiatingstressenduring(多系分化压力耐受))细胞”的细胞。muse细胞可从骨髓液、脂肪组织(ogura,f.，etal.，stemcellsdev.，nov20,2013(发表于2014年1月17日))或真皮结缔组织等的皮肤组织得到，也散在于各器官的结缔组织。另外，此细胞是有多能性干细胞和间充质干细胞这两方的性质的细胞，例如，作为是各自的细胞表面标志物的“ssea-3(stage-specificembryonicantigen-3)”和“cd105”的双阳性鉴定。从而，muse细胞或含muse细胞的细胞集团，例如，可以这些抗原标志物作为指标而从生物体组织分离。另外，muse细胞具有应激抗性，可从间充质组织或培养的间充质细胞由各种应激刺激浓缩。在本发明的细胞制剂中，也可使用由应激刺激浓缩muse细胞的细胞级分。muse细胞的分离法、鉴定法、及特征等的详细在国际公开第wo2011/007900号中公开。另外，如由wakao等(2011、上述)报告，得知从骨髓、皮肤等培养间充质细胞，以其作为muse细胞的母集团使用时，ssea-3阳性细胞的全部是cd105阳性细胞。从而，在本发明中的细胞制剂及医药组合物中，当从生物体的间充质组织或培养的间充质干细胞分离muse细胞时，可单以ssea-3作为抗原标志物而纯化、使用muse细胞。再者，在本说明书中，以可在用于改善及/或治疗慢性肺疾病的细胞制剂及医药组合物中使用的ssea-3作为抗原标志物，有时将从生物体的间充质组织或培养的间充质组织分离的多能性干细胞(muse细胞)或含muse细胞的细胞集团简记作“ssea-3阳性细胞”。另外，在本说明书中，“非muse细胞”是指生物体的间充质组织或培养的间充质组织中所含的细胞，指“ssea-3阳性细胞”以外的细胞。

简言之，muse细胞或含muse细胞的细胞集团可单独使用对于作为细胞表面标志物的ssea-3的抗体，或者使用对于ssea-3及cd105的各自的抗体两方而从生物体组织(例如，间充质组织)分离。其中，“生物体”是指哺乳动物生物体。在本发明中，在生物体中，不含发生阶段在受精卵或囊胚期之前的胚，但含有含胎儿或囊胚的囊胚期往后的发生阶段的胚。在哺乳动物中，虽不限定，可举出人、猴等的灵长类、小鼠、大鼠、兔、豚鼠等的啮齿类、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、驴、山羊、雪貂等。在本发明的细胞制剂及医药组合物中使用的muse细胞在从生物体的组织直接使用标志物分离的方面，明确地区别为胚胎干细胞(es细胞)或ips细胞。另外，“间充质组织”是指骨、滑膜、脂肪、血液、骨髓、骨骼肌、真皮、韧带、腱、齿髓、脐带、脐带血等的组织及存在于各种器官的组织。例如，muse细胞可从骨髓或皮肤、脂肪组织得到。例如，优选采集生物体的间充质组织，从此组织分离muse细胞而利用。另外，也可使用上述分离手段而从成纤维细胞或骨髓间充质干细胞等的培养的间充质细胞分离muse细胞。在本发明的细胞制剂及医药组合物中，使用的muse细胞可为对于受者而言是自体，或者，也可为异体。

如上所述，muse细胞或含muse细胞的细胞集团例如，可以ssea-3阳性、及ssea-3和cd105的双阳性作为指标而从生物体组织分离，但已知在人成人皮肤中含各种类型的干细胞及前体细胞。但是，muse细胞与这些细胞不相同。在这样的干细胞及前体细胞中，可举出皮肤来源前体细胞(skp)、神经嵴干细胞(ncsc)、成黑色素细胞(mb)、血管周围细胞(pc)、内皮前体细胞(ep)、脂肪来源干细胞(adsc)。可以在这些细胞中固有的标志物的“非表达”作为指标，对muse细胞进行分离。更具体而言，muse细胞可将选自cd34(ep及adsc的标志物)、cd117(c-kit)(mb的标志物)、cd146(pc及adsc的标志物)、cd271(ngfr)(ncsc的标志物)、ng2(pc的标志物)、vwf因子(冯·威利布兰德因子)(ep的标志物)、sox10(ncsc的标志物)、snai1(skp的标志物)、slug(skp的标志物)、tyrp1(mb的标志物)、及dct(mb的标志物)的11个标志物之中至少1个、例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个标志物的非表达分离为指标。例如，不限定，可将cd117及cd146的非表达分离为指标，再者，可将cd117、cd146、ng2、cd34、vwf及cd271的非表达分离为指标，再者，可将上述的11个标志物的非表达分离为指标。

另外，在本发明的细胞制剂及医药组合物中使用的有上述特征的muse细胞也可有选自以下的至少1个性质：

(i)端粒末端转移酶活性低或无；

(ii)具有分化为三胚层之任一胚层的细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；及

(iv)具有自我更新能力。

在本发明的一方面，在本发明的细胞制剂及医药组合物中使用的muse细胞有全部上述性质。其中，对于上述(i)，“端粒末端转移酶活性低或无”是指例如，在使用trapezexl端粒酶检测试剂盒(millipore公司)来检测端粒末端转移酶活性时，低或无法检测。端粒末端转移酶活性“低”是指例如，有与作为体细胞的人成纤维细胞同程度的端粒末端转移酶活性，或有与hela细胞比1/5以下，优选1/10以下的端粒末端转移酶活性。对于上述(ii)，muse细胞有在体外及体内分化为三胚层(内胚层系、中胚层系、及外胚层系)的能力，例如，通过在体外诱导培养，可分化为肝细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、骨细胞、脂肪细胞等。另外，有在体内移植精巢时也显示分化为三胚层的能力的情况。再者，通过由静脉注射向生物体移植而在受损伤的器官(心脏、皮肤、脊髓、肝、肌肉等)游走及植活，有分化为对应于组织的细胞的能力。对于上述(iii)，muse细胞在悬浮培养中以增殖速度约1.3天增殖，在悬浮培养中有从1细胞增殖，制作胚样体样细胞块而在14天左右增殖停止这样的性质，但当将这些胚样体样细胞块接附培养时，再开始细胞增殖，从细胞块增殖的细胞扩大。再者，有向精巢移植时，至少半年间不癌化这样的性质。另外，对于上述(iv)，muse细胞有自我更新(自体复制)能力。其中，“自我更新”是指可确认到从通过从1个muse细胞由悬浮培养进行培养而得到的胚样体样细胞块中所含的细胞向3胚层性的细胞的分化的同时，通过将胚样体样细胞块的细胞再次以1细胞悬浮培养，可形成以下的世代的胚样体样细胞块，由此再次确认3胚层性的分化和悬浮培养中的胚样体样细胞块。自我更新是重复1次或多次的循环即可。

另外，在本发明的细胞制剂中使用的含muse细胞的细胞级分也可为由包括向生物体的间充质组织或培养的间充质细胞给外部应激刺激，回收对该外部应激具有抗性的细胞的方法得到的，有以下的性质的至少1个，优选全部的，ssea-3阳性及cd105阳性的多能性干细胞被浓缩的细胞级分。

(i)ssea-3阳性；

(ii)cd105阳性；

(iii)端粒末端转移酶活性低或无；

(iv)具有分化为三胚层的能力；

(v)不显示肿瘤性增殖；及

(vi)具有自我更新能力。

上述外部应激也可为蛋白酶处理、以低氧浓度的培养、在低磷酸条件下的培养、以低血清浓度的培养、在低营养条件下的培养、在向热休克的暴露下的培养、以低温的培养、冷冻处理、在有害物质存在下的培养、在活性氧存在下的培养、在机械的刺激下的培养、在振荡处理下的培养、在压力处理下的培养或物理的冲击之任一者或多个组合。例如，由上述蛋白酶的处理时间是为了向细胞给外部应激而进行优选合计0.5～36小时。另外，蛋白酶浓度只要是剥接附在培养容器的细胞之时，将细胞块分散为单细胞之时，或者在从组织回收单细胞之时使用的浓度即可。蛋白酶优选为丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或n末端苏氨酸蛋白酶。再者，上述蛋白酶优选为胰蛋白酶、胶原酶或分散酶。

另外，在本发明的细胞制剂中使用的有上述特征的muse细胞由静脉施用等向生物体施用后，在慢性肺疾病的肺组织植活，其后，muse细胞分化为构成该组织的细胞，也被认为改善及/或治疗慢性肺疾病。

(2)细胞制剂及医药组合物的调制及使用

本发明的细胞制剂及医药组合物不限定，通过将上述(1)中得到的muse细胞或含muse细胞的细胞集团悬浮于生理盐水或适合的缓冲液(例如磷酸缓冲生理盐水、hbss)而得到。此时，在从自体或异体的组织分离的muse细胞数少的情况中，也可在施用前培养细胞而使增殖至得到指定的细胞浓度。再者，如已经报告(国际公开第wo2011/007900号单行本)、muse细胞由于不肿瘤化，以未分化的状态含从生物体组织回收的细胞也癌化的可能性低而安全。另外，回收的muse细胞的培养不特别限定，可在通常的增殖培养基(例如，含10％仔牛血清的α-最少必须培养基(α-mem))中进行。更具体而言，可参照上述国际公开第wo2011/007900号，在muse细胞的培养及增殖中，适宜选择培养基、添加物(例如，抗生物质、血清)等，调制含指定浓度的muse细胞的溶液。在向人对象施用本发明的细胞制剂或医药组合物时，可从人的肠骨采集数ml程度的骨髓液，例如，在作为来自骨髓液的接附细胞培养骨髓间充质干细胞而增加至达到可分离有效的治疗量的muse细胞的细胞量之后，将muse细胞以ssea-3的抗原标志物作为指标分离，以自体或异体的muse细胞作为细胞制剂调制。或者，例如，可将muse细胞以ssea-3的抗原标志物作为指标分离后，将细胞培养增加至达到有效的治疗量之后，以自体或异体的muse细胞作为细胞制剂调制。

另外，在muse细胞向细胞制剂及医药组合物的使用中，可为了保护该细胞而使细胞制剂及医药组合物中含有二甲基亚砜(dmso)或血清白蛋白等，也可为了防细菌的混入及增殖而使细胞制剂及医药组合物中含有抗生物质等。再者，也可使细胞制剂及医药组合物中含有制剂中容许的其他成分(例如，载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛化剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)或间充质干细胞中所含的muse细胞以外的细胞或成分。本领域技术人员可将这些因子及药剂以适合的浓度添加到细胞制剂及医药组合物。

上述调制的细胞制剂及医药组合物中所含有的muse细胞数可以在慢性肺疾病的改善及/或治疗中得到期望的效果(例如，死亡率降低、人工呼吸管理天数的缩短、氧施用天数的缩短)的方式，考虑对象的性别、年龄、体重、患部的状态、使用的细胞的状态等而适宜调整。在后述的实施例2～7中，使用高氧负荷导致的慢性肺疾病模型大鼠而探讨由muse细胞移植导致的各种效果，但对于体重约5～15g的该模型大鼠，通过将ssea3阳性细胞以1×10⁴个细胞/只(每一个体)施用，得到了非常优良的效果。从结果期待，通过对人新生儿(生后28天以内)、乳儿(生后不足1年)、或者幼儿(生后1～6年)的每一个体施用约3×10⁴个细胞/kg～约3×10⁷个细胞/kg进行体重换算的细胞量而得到了优良的效果。例如，将新生儿及乳儿的体重设为约400～10,000g时，作为施用量，概算约1×10⁴个细胞/个体～约3×10⁸个细胞/个体被认为是有效的。一方面，为了防止由向血管的细胞施用导致的闭塞，作为1次施用分的量，例如，将ssea-3阳性细胞以3×10⁷个细胞/kg以下含有在细胞制剂中即可。其中个体含大鼠、人，但不限于此。另外，本发明的细胞制剂及医药组合物也可多次(例如，2～10次)、适宜、间隔(例如，1天2次、1天1次、1周2次、1周1次、2周1次)施用至得到期望的治疗效果。从而，虽也取决于对象的状态，但作为治疗有效量，例如，优选每一个体约1×10⁴个细胞～约3×10⁸个细胞而1～10次的施用量。作为一个体中的施用总量不限定，可举出1×10⁴个细胞～3×10⁹个细胞、1×10⁴个细胞～1×10⁹个细胞、1×10⁴个细胞～5×10⁸个细胞、1×10⁴个细胞～3×10⁸个细胞、1×10⁴个细胞～1×10⁸个细胞、1×10⁴个细胞～5×10⁷个细胞、1×10⁴个细胞～3×10⁷个细胞、1×10⁴个细胞～1×10⁷个细胞、1×10⁴个细胞～5×10⁶个细胞、1×10⁴个细胞～3×10⁶个细胞、1×10⁴个细胞～1×10⁶个细胞、1×10⁴个细胞～5×10⁵个细胞、1×10⁴个细胞～3×10⁵个细胞、1×10⁴个细胞～1×10⁵个细胞、1×10⁵个细胞～3×10⁹个细胞、1×10⁵个细胞～1×10⁹个细胞、1×10⁵个细胞～5×10⁸个细胞、1×10⁵个细胞～3×10⁸个细胞、1×10⁵个细胞～1×10⁸个细胞、1×10⁵个细胞～5×10⁷个细胞、1×10⁵个细胞～3×10⁷个细胞、1×10⁵个细胞～1×10⁷个细胞、1×10⁵个细胞～5×10⁶个细胞、1×10⁵个细胞～3×10⁶个细胞、1×10⁵个细胞～1×10⁶个细胞、1×10⁶个细胞～3×10⁹个细胞、1×10⁶个细胞～1×10⁹个细胞、1×10⁶个细胞～5×10⁸个细胞、1×10⁶个细胞～3×10⁸个细胞、1×10⁶个细胞～1×10⁸个细胞、1×10⁶个细胞～5×10⁷个细胞、1×10⁶个细胞～3×10⁷个细胞、1×10⁶个细胞～1×10⁷个细胞、1×10⁷个细胞～3×10⁹个细胞、1×10⁷个细胞～1×10⁹个细胞、1×10⁷个细胞～5×10⁸个细胞、1×10⁷个细胞～3×10⁸个细胞、1×10⁷个细胞～1×10⁸个细胞、1×10⁵个细胞～3×10⁸个细胞、1×10⁵个细胞～1×10⁸个细胞、1×10⁵个细胞～5×10⁷个细胞、1×10⁵个细胞～3×10⁷个细胞、1×10⁵个细胞～1×10⁷个细胞、1×10⁵个细胞～5×10⁶个细胞、1×10⁵个细胞～3×10⁶个细胞、1×10⁵个细胞～1×10⁶个细胞、5×10⁵个细胞～3×10⁸个细胞、5×10⁵个细胞～1×10⁸个细胞、5×10⁵个细胞～5×10⁷个细胞、5×10⁵个细胞～3×10⁷个细胞、5×10⁵个细胞～1×10⁷个细胞、5×10⁵个细胞～5×10⁶个细胞、5×10⁵个细胞～1×10⁶个细胞、1×10⁶个细胞～1×10⁸个细胞、1×10⁶个细胞～5×10⁷个细胞、1×10⁶个细胞～1×10⁷个细胞、1×10⁶个细胞～5×10⁶个细胞等。

本发明的细胞制剂及医药组合物以慢性肺疾病作为改善及治疗对象，作为施用时期，可为由出生后的小儿科的见解、胸部x射线照片或ct等诊断为慢性肺疾病之后，也可为从刚诊断后起数个月以内。或者，在生后早期也可判断为成为呼吸状态坏的慢性肺疾病的可能性高之时(例如，生后第1周)。一方面，根据本发明，该细胞制剂等优选在受伤后立即施用，受伤后迟后的时期、例如，即使在从受伤起1周后，1个月后，3个月后，6个月、12个月后，也可期待本发明的细胞制剂等的效果。另外，由于本发明人的实验中确认使用的muse细胞即使是异体来源的情况也不引发免疫应答，也可适宜施用至在慢性肺疾病的改善及治疗中得到期望的效果。再者，如后述的实施例2～7中所示，对于由使用慢性肺疾病模型大鼠的muse细胞的该疾病的改善而进行肺组织评价及心脏评价，则处于长期(生后29天)的治疗效果比短期(生后15天)的治疗效果显著的倾向。

3.慢性肺疾病模型大鼠的制作

在本说明书中，可为了探讨由本发明的细胞制剂的慢性肺疾病的改善及治疗效果而构建、使用慢性肺疾病模型大鼠。在作为该模型使用的大鼠中，虽不限定，一般而言，可举出wistar/st系大鼠、sprague-dawley(sd)系大鼠。制作慢性肺疾病模型大鼠的方法是公知的，例如，可根据lu,a.等人(pediatr.res.，77,784-792(2015))的方法而制作慢性肺疾病模型大鼠。另外，可由肺组织的评价确认由上述方法制作的模型大鼠是否有慢性肺疾病。

在本发明的细胞制剂及医药组合物中使用的muse细胞有在疾病部位蓄积的性质。从而，在细胞制剂或医药组合物的施用中，它们的施用部位(例如，腹腔内、肌内、疾病部位)、施用的血管的种类(静脉及动脉)等不限定。另外，作为确认施用的muse细胞到达疾病部位而植活的方法，例如，可制作以预先表达荧光蛋白质(例如，绿色荧光蛋白质(gfp))的方式基因导入的muse细胞，向生物体施用后，由可检测荧光的方法(例如，免疫组织染色)观察，确认muse细胞的动态。再者，由于在本发明的细胞制剂及医药组合物中使用的muse细胞是人来源的，处于与大鼠异种的关系。在模型动物中施用异种细胞等的实验中，为了抑制异种细胞在生物体内的排斥反应，也可在异种细胞的施用前或同时施用免疫抑制剂(环孢菌素等)。

4.由慢性肺疾病模型大鼠中的muse细胞的改善及治疗效果

在本发明的实施方式中，本发明的细胞制剂及医药组合物可改善及/或治疗在含人的哺乳动物中的慢性肺疾病及伴随其的各种症状。根据本发明，可使用上述制作的慢性肺疾病模型大鼠而实验探讨由慢性肺疾病的大鼠中的muse细胞的症状的改善等，评价该muse细胞的效果。作为评价方法，可使用利用大鼠评价肺功能的一般的测定系统来进行，例如，可利用finepointe(商标)－呼吸－肺功能评价系统noninvasiveairwaymechanics(nam)等的大鼠的呼吸及肺功能评价系统。另外，可通过进行例如，肺泡壁的测定(肺泡间腔的扩大)、炎症性细胞因子等的mrna表达量的测定、或者，与慢性肺疾病相关联的右心室心肌评价、肺血管评价来评价从模型大鼠取出的肺组织。

(1)肺组织的评价

根据本发明，通过作为肺组织的评价之一而测定组织体积密度(tissuevolumedensity)，可评价慢性肺疾病的治疗改善效果。简言之，将从受试对象取出的肺组织用4％多聚甲醛固定，制成石蜡块切片后，用苏木精－曙红染色。可在显微镜下对指定数的格之中肺组织的比例进行计数，评价肺组织的病变(参照后述的实施例4)。在肺组织有损伤，则肺泡腔率变高。

在别的实施方式中，通过对在肺组织中表达的炎症性细胞因子的表达量进行测定，可评价对于慢性肺疾病的本发明的细胞制剂或医药组合物的有效性。一般而言，在炎症性细胞因子中，例示il-1α、il-1β、il-6、ccl2(mcp-1)、tnf-α、tgf-β、vegf等。可将在组织中表达的炎症性细胞因子的表达量使用由常规方法，例如，rt-pcr而进行测定。如在后述的实施例5中记载，在施用muse细胞的组中，可与施用媒质的对照组比较而使炎症性细胞因子的表达量显著地降低，muse细胞可在慢性肺疾病的治疗中被期待。

(2)心脏评价(肺高血压评价)

在起因于高氧负荷的慢性肺疾病中，由应用的高氧浓度而发生肺血管的肥厚，伴随其而确认到心脏的肥厚。在新生儿的慢性肺疾病中，(以成为重症的程度)合并2次的肺高血压症。此2次的肺高血压症也是确定生命预后的重要的要因。由于持续的肺高血压与右心脏负荷导致的右心室壁肥厚关联，可使用心脏(心肌)的评价而评价肺高血压。如后述的实施例6所示，在慢性肺疾病模型大鼠中也观察到被认为右心脏负荷导致的右心室壁肥厚，可将此肥厚由muse细胞的施用降低。

(3)肺泡清洗液中的炎症性细胞数的测定

在慢性肺疾病中，观察到炎症性细胞数的增加，可通过对来自肺泡的清洗液中的炎症性细胞数测定由各种处置导致的慢性肺疾病的治疗效果来评价。如后述的实施例7所示，muse细胞可使在慢性肺疾病模型大鼠中的炎症性细胞数显著地减少。

由以下的实施例进一步具体性地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。

【实施例】

【实施例1：muse细胞的调制】

基于在涉及人muse细胞的分离及鉴定的国际公开第wo2011/007900号中记载的方法而得到muse细胞。

【实施例2：慢性肺疾病模型大鼠的制作和muse细胞的施用】

关于本研究中使用的实验动物的流程是由名古屋大学医学部动物实验委员会承认的。从日本slc株式会社(日本、静冈县)得到妊娠sd大鼠。从刚出生后(24小时以内)起使母大鼠和仔大鼠在实验期间可自由摄取食饵和水，在施加高氧负荷的笼(具备氧控制器和传感器适配器的动物室)内，在12小时的明暗循环下饲育。将动物室和笼内常维持在23℃。由于母大鼠也因高氧化受伤，每2天更替代理母大鼠。

在5日龄对上述慢性肺疾病模型大鼠由异氟烷吸入实施麻醉，对于处置组，将muse细胞(1×10⁴个细胞/个体)从右外颈静脉施用(处置组)。在对照组中，代替muse细胞而仅施用同体积的hbss。以未一同供予muse细胞及hbss，另外未进行高氧负荷的大鼠作为假组。在以下的实验中，以15日龄和29日龄的大鼠各自作为短期组及长期组，在各种评价中使用。再者，将短期评价进行至15日龄，大鼠暴露于高氧浓度(80％)，其后，将长期评价进行至29日龄，暴露于通常的氧浓度(21％)。

【实施例3：在肺组织中的muse细胞的植活确认】

进行确认在移植中使用的muse细胞在肺组织植活的实验。首先，表达绿色荧光蛋白质(gfp)，以muse细胞被此标记的方式向muse细胞预先导入慢病毒-gfp基因。以被gfp标记的muse细胞作为gfp和ssea-3的双阳性细胞而用facs进行分离。其后，如在实施例2中记载，施用muse细胞。

接下来，在施用了muse细胞的15日龄的大鼠(高氧负荷后第14天)的肺中，如下所述，确认muse细胞在肺组织植活。将大鼠安乐死之后，切除肺，根据常规方法制作肺组织的切片。制作冷冻切片，用histovtone(nacalaitesque株式会社)进行抗原赋活。为了防抗体的非特异性结合而用驴血清进行封闭之后，用抗gfp抗体于4℃进行一晚温育。接下来，用适合的第2抗体进一步温育。其后，用含对dna进行染色的dapi的封入剂封入。从结果显示，从大鼠的右外颈静脉移植的muse细胞在受肺障碍的肺组织植活(图1)。

【实施例4：肺组织评价】

如以下一样进行慢性肺疾病模型大鼠的肺组织的评价。将上述的短期组和长期组的该模型大鼠安乐死，从右心室注入生理盐水而对肺血管进行灌流之后，经气管导管而将肺用4％多聚甲醛水溶液膨胀(20cmh2o、20分钟)。摘出肺，在4％多聚甲醛溶液中固定18～24小时(4℃)之后，区分为各肺叶。将区分的肺叶用乙醇水溶液、二甲苯脱水，石蜡包埋后，将肺叶作为厚度5μm的切片，苏木精-曙红染色(he染色)而制作标本。使用倒置显微镜(olympus公司制、型号ix83)，在显微镜软件(stereoinvestigator)上置100的格(×3处×6切片)，确认各自的格下是空间或肺组织之哪一者。评价100(计1,800)格之中多少％是肺组织。通常，在正常的肺组织中占40％左右，伴随肺组织的损伤而肺泡腔变大。如图2所示，在短期组(15日龄)的大鼠中，施用muse细胞的处置组(muse组)及施用hbss的处置组(媒质组)与正常状态的假组比较是同程度，但在长期组(29日龄)的大鼠中，与媒质组比较而在muse组中显示显著的效果，放松至接近正常状态。

与上述同样地，除了新施用muse细胞的组、媒质组、假组之外，加施用非muse细胞的组，在短期组及长期组的大鼠中再评价肺组织(图3)。在短期组中，施用非muse细胞的处置组(非muse组)与媒质组同程度而观察不到肺组织的损伤的减轻效果，但在施用了muse细胞的组(muse组)中，与以前的结果(图2)同样地，观察到由muse细胞的肺组织的损伤的显著的减轻效果。一方面，在长期组中，在非muse组中，与媒质组比较而观察到肺组织的损伤的减轻效果，但其效果比muse组小。显示在施用了muse细胞的大鼠中，肺组织的损伤与以前的结果同样地放松至接近正常状态。

再者，在29日龄的大鼠中，通过测量肺泡壁比例而评价肺组织。将制作的标本用显微镜用数字摄像机(olympus公司制、型号dp73)摄影。使用成像软件(olympus株式会社制、商品名cellsens)而解析摄影图像。从标本切片整体的面积刨除气管、血管及障碍部位的面积而作为肺泡的面积，其中，将肺泡壁所占的面积的比例(肺泡壁比例)由下述式算出。

肺泡壁比例(％)＝肺泡壁面积÷肺标本整体面积-(气管部位面积+血管部位面积+障碍部位面积)×100

此肺泡壁比例越高，越表示紧密形成了肺泡壁而修复肺组织。结果示于图4。在假组中，肺泡壁比例是约22～23％，在向慢性肺疾病模型大鼠施用muse细胞的组中，被破坏的肺泡壁恢复至21％前后。

另外，在非muse细胞组中也见到恢复的效果，但未至muse细胞组的程度。这样，从上述的肺组织评价显示，在肺muse组中显示显著的效果，放松至接近正常状态。

【实施例5：炎症性细胞因子的mrna表达测定】

在慢性肺疾病中，在肺组织中各种炎症性细胞因子的表达增大，探讨是否可由muse细胞的移植降低这些的表达量。从15日龄的大鼠采集肺组织，根据常规方法而提取总rna的后，在处置组和媒质组之间比较作为炎症性细胞因子的ccl2及vegf的mrna表达量。作为具体的方法，向快速地取出肺组织的容器添加tri试剂，用dounce匀浆机、21g针附带注射器进行匀浆。添加氯仿后，离心分离，得到含rna的水层。用异丙醇使rna沉淀，将以指出浓度溶解的rna用superscript(注册商标)vilo(商标)cdna合成试剂盒合成cdna。其后，使用sybrgreen而进行实时定量rt-pcr。结果示于图5。纵轴表示将假组的表达量设为1之时的各细胞因子的mrna的相对的表达量。施用muse细胞的处置组(muse组)可与施用hbss的处置组(媒质组)比较而使任何的炎症性细胞因子的mrna表达量显著地降低。

【实施例6：心脏评价(肺高血压评价)】

作为由muse细胞的慢性肺疾病的治疗效果，使用大鼠的心脏进行评价。从上述的短期组及长期组的模型大鼠取出心脏，分离为右心室壁(rv)和中隔+左心室壁(ivs+lv)这2个后，用干燥机充分(60℃、48小时)干燥，对各自的重量进行测定。有持续的肺高血压，则右心室壁肥厚(＝变重)。图6的假组是正常值，但当成为慢性肺疾病(媒质组)时升高至0.4程度。这显示右心室肥厚。与此相比，得知在施用muse细胞的组(muse组)中，大致正常化。

与上述同样地，除了新施用muse细胞的组、媒质组、假组之外，加施用非muse细胞的组，在短期组及长期组的大鼠中对于肺高血压的改善效果而进一步进行评价(图7)。在短期组及长期组的两方中，施用非muse细胞的处置组(非muse组)与媒质组同程度而观察不到肺高血压的减轻效果。一方面，在施用了muse细胞的组(muse组)中，与以前的结果(图6)同样地，观察到由muse细胞的肺高血压的显著的减轻效果。

接下来，对于由高氧负荷损伤的肺组织的修复而进行组织学评价。起初，将肺动脉的血管壁由抗α-sma(α-平滑肌肌动蛋白)抗体组织学染色，对于各种施用组而以内壁率的变化作为指标而评价肺动脉血管壁的肥厚的减轻效果。同时，对于伴随慢性肺疾病而亢进的肺动脉细胞的新生是否因muse细胞的施用而被抑制，以作为细胞周期关联核蛋白质的ki-67作为细胞增殖标志物而进行探讨。与上述的实施例同样地制作石蜡切片，其后，用柠檬酸缓冲液进行抗原赋活。为了防抗体的非特异性结合而用驴血清进行封闭之后，用抗α-sma抗体、及抗ki-67抗体于4℃进行一晚温育。用适合的第2抗体进一步温育之后，用含对dna进行染色的dapi的封入剂封入。

在肺动脉血管的截面的组织染色的结果示于图8(a)。基于这些图像而根据以下的式算出各组的内壁率：

内壁率(％)＝{(血管外径-血管内径)/血管外径}×100

结果示于图8(b)。如此图所示，短期组及长期组均为类似的结果，在muse细胞组中，可显著地抑制起因于肺高血压的肺动脉血管壁的肥厚。另外，在非muse细胞组中也观察到抑制效果，但其效果比muse细胞组小。

将增殖中的肺动脉细胞的核由抗ki-67抗体组织学染色，对于肺动脉细胞的新生率而进行评价。在图9(a)中，显示进行由抗α-sma抗体、抗ki-67抗体、及dapi的三重染色的结果。图中所示的肺动脉标本是施用非muse细胞的组，观察到由抗ki-67抗体染色的增殖中的肺动脉细胞。

接下来，对于各组进行这样的三重染色，由dapi进行核染色的肺动脉细胞之中，算出作为ki-67阳性的细胞的比例(图9(b))。在短期组中，在muse细胞组中肺动脉细胞的新生与媒质组及非muse组比较而ki-67阳性细胞的比例减少。另外，在长期组中，muse细胞组是ki-67阳性细胞的比例减少至与假组同程度，其效果比短期组显著。从以上的肺高血压评价显示，muse细胞在慢性肺疾病的治疗中发挥显著的效果。

【实施例7：肺泡清洗液中的炎症性细胞数的测定】

在慢性肺疾病中，观察到炎症性细胞数的增加，探讨由muse细胞的施用减少这些的细胞数与否。将短期组的大鼠安乐死之后，自肺动脉将血管用生理盐水灌流，从插管的气管套管注入生理盐水0.4ml(0.2ml×2次)而进行肺泡清洗(bal)，回收bal液(balf)。将balf中的白细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、及淋巴细胞的数由以下的方法测量。具体而言，向支气管肺泡清洗液10μl加turk溶液20μl而进行染色，使用burker-turk血细胞计数板而测定总细胞数。接下来，使用cytospin4(注册商标)而制作支气管肺泡清洗液100μl的涂抹标本，将制作的涂抹标本用may-giemsa染色染色。在显微镜下，对每1标本至少200个细胞进行计数而测定白细胞分级分离，算出巨噬细胞数、嗜中性粒细胞数、及淋巴细胞数。结果示于图10。伴随慢性肺疾病而增加的各种炎症性细胞的数因muse细胞的施用而减轻。从结果显示，muse细胞在慢性肺疾病的治疗中发挥显著的效果。

【产业上的利用可能性】

本发明的细胞制剂及医药组合物可应用于新生儿慢性肺疾病的改善及治疗。

在本说明书中引用的全部刊物及专利文献通过参照作为整体在本说明书中援用。再者，在本说明书中以例示目的说明本发明的特定的实施方式，但本领域技术人员容易地理解可在不脱离本发明的精神及范围内进行各种改变。