包含BCMA特异性III型纤连蛋白结构域的嵌合抗原受体及其用途的制作方法

本申请包含已经以ascii格式电子递交的序列表，所述序列表据此全文以引用方式并入。所述ascii副本创建于2017年8月31日，命名为jbi5097wopct_sl.txt，并且大小为138,671字节。本发明涉及bcma特异性iii型纤连蛋白(fn3)结构域、包含fn3结构域的靶向bcma的嵌合抗原受体(car)，以及表达car的工程化靶向bcma的免疫细胞。还提供了编码fn3结构域和car的核酸和表达载体、包含载体的重组细胞，以及包含表达靶向bcma的car的工程化免疫细胞的组合物。还提供了制备fn3结构域、car、以及工程化免疫细胞的方法，使用工程化免疫细胞治疗包括癌症在内的病症的方法。
背景技术：
：使t细胞遗传工程化成用于以靶特异性的方式特异性地结合和杀伤肿瘤细胞的结果是建立了用于癌症患者的新治疗选项——称作工程化t细胞疗法。这种靶向通常通过对具有编码嵌合抗原受体(car)的重组dna分子的来源于患者的t细胞进行遗传学操作而产生。car是包含连接于肽接头的胞外靶向结构域、跨膜(tm)结构域、以及一个或多个胞内信号结构域的合成受体。传统地，胞外结构域由对给定的肿瘤相关抗原(taa)或细胞表面靶标有特异性的抗体的单链fv片段(scfv)组成。胞外scfv结构域赋予car肿瘤特异性，而信号结构域在taa/靶标结合时激活t细胞。将这些工程化t细胞(car-t细胞)再灌注到癌症患者体内，其中它们特异性地结合并杀伤表达car的taa靶的细胞(maus等人，blood.2014年4月24日；123(17):2625-35；curran和brentjens,jclinoncol.2015年5月20日；33(15):1703-6)。免疫球蛋白(ig)折叠存在于抗体以及数千种非抗体蛋白质的可变区。已证实，一种这样的ig蛋白，即人纤连蛋白的第10个iii型纤连蛋白(fn3)重复序列，能容忍表面所暴露的环中的许多突变而保持总体的ig折叠结构。氨基酸变体库已构建进这些环以及所选的与多个不同靶点结合的特定结合蛋白中。已发现此类工程化的fn3结构域以较高的亲和力与靶点结合，同时保持重要的生物物理特性。参见例如us2010/0216708及其中的参考文献。报道car-t疗法在血液恶性肿瘤中的有前景用途的许多临床研究通过靶向cd19或cd20而致力于b细胞恶性肿瘤。虽然cart细胞疗法作为高效疗法出现，仍然需要改善该疗法的某些方面，诸如，例如car信号转导的优化、最佳靶抗原的鉴定、细胞制备方法的优化、cart细胞疗法安全性的提高、改善cart细胞的治疗潜力的组合策略的优化等(dai等人，jnatlcancerinst.2016年1月27日；108(7))。多发性骨髓瘤(mm)是一种以克隆浆细胞的积聚为特征的癌症。mm是第二常见的血液恶性肿瘤，并且其占全部癌症死亡数多至2％。mm是异质性疾病，并且以宽泛的侵袭性和治疗抗性范围为特征。一些患者在诊断后存活十年或更久，而其它患者则遭受迅速的治疗抗性进展并在2年内死亡。尽管新治疗剂的开发取得进展，目前mm仍是无法治愈的。虽然当前疗法通常导致mm缓解，但疾病最终在几乎所有患者中复发并最终致死(naymagonandabdul-hay,jhematoloncol.2016年6月30日；9(1):52)。此外，常规治疗方法，包括化学疗法和放射疗法由于毒副作用而具有有限的实用性。因此，本领域中仍然需要用于治疗mm的更有效治疗剂。mm疗法的潜在靶标是b细胞成熟抗原(bcma)，即主要表达于成熟b细胞上的肿瘤坏死因子受体家族的成员(coquery和erickson,critrevimmunol.2012；32(4):287-305)。bcma在结合其配体(tnf家族的b细胞活化剂(baff)和一种增殖诱导配体(april))时传送促存活信号。bcma触发b细胞中的抗原呈递，这取决于nf-κb和jnk信号转导。在健康个体中，bcma在介导维持长期体液免疫的浆细胞存活中发挥作用，但其表达也与多种癌症、自体免疫障碍和感染性疾病关联。例如，bcmarna通常在mm细胞及其它淋巴瘤中检测出，并且已在mm患者的浆细胞表面检测到bcma蛋白质(novak等人，blood.2004年1月15日；103(2):689-94；neri等人，clincancerres.2007年10月1日；13(19):5903-9；bellucci等人，blood.2005年5月15日；105(10):3945-50；moreaux等人，blood.2004年4月15日；103(8):3148-57)。本领域需要特异且有效地靶向表达bcma的细胞的有效治疗剂。技术实现要素：本发明通过提供bcma特异性fn3结构域、包含fn3结构域的靶向bcma的car、表达car的工程化靶向bcma的免疫细胞、它们的制备方法和使用方法来满足该需求。当靶向bcma的car表达于pant细胞的表面时，该细胞特异性地杀伤表达bcma的肿瘤细胞系。因此，本发明的靶向bcma的car可用于有效地重定向t细胞，从而以高度特异性的方式杀伤表达bcma的细胞。不受理论的束缚，认为将fn3结构域而非scfv用作car的胞外结构域将允许更稳定而可控的car分子，因为scfvs本质上更易受生物物理攻击。此外，较小尺寸的fn3结构域将允许更好的免疫突触优化，并且靶向taa的非常特定的结构域的灵活性更大。在一个总的方面，本发明涉及特异性地结合bcma，优选bcma的胞外结构域的分离的fn3结构域。在一些实施方案中，fn3来源于tencon。在一个实施方案中，分离的fn3结构域包含与seqidno:1有至少80％同一性的氨基酸序列，其中fn3结构域以小于1×10-6m的kd结合人bcma，如通过使用表面等离振子共振所测定。在另一个实施方案中，分离的fn3结构域包含seqidno:7的氨基酸序列。在另一个实施方案中，分离的fn3结构域包含与seqidno:8-44和58-145中的一者有至少90％同一性的氨基酸序列；优选地，fn3包含seqidno:8-44和58-145中一者的氨基酸序列。在其它一般方面，本发明涉及编码本发明fn3结构域的分离的多核苷酸，包含编码本发明fn3结构域的分离的多核苷酸的载体，以及包含编码本发明fn3结构域的分离的核酸的宿主细胞。本发明还涉及制备本发明fn3结构域的方法，包括在产生fn3结构域的条件下培养包含编码fn3结构域的多核苷酸序列的宿主细胞，并从细胞或细胞培养物回收fn3结构域。根据另一个总的方面，本发明涉及编码本发明的嵌合抗原受体(car)的分离的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含：胞外结构域，具有特异性地结合bcma的fn3结构域；跨膜结构域；以及胞内信号结构域。car还可包含处于氨基末端的信号肽以及使所述胞外结构域连接于所述跨膜结构域的铰链区。在一些实施方案中，分离的多核苷酸编码car，所述car包含：信号肽，具有与seqidno:2有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:2的氨基酸序列；胞外结构域，包含本发明的fn3结构域，诸如具有与seqidno:8-44和58-145中的一者有至少90％同一性的氨基酸序列，优选具有seqidno:8-44和58-145中的一者的氨基酸序列的fn3结构域；铰链区，具有与seqidno:3有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:3的氨基酸序列；跨膜结构域，具有与seqidno:4有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:4的氨基酸序列；以及胞内信号结构域，包含具有与seqidno:5有至少90％同一性的氨基酸序列，优选具有seqidno:5的氨基酸序列的共同刺激结构域以及具有与seqidno:6有至少90％同一性的氨基酸序列，优选具有seqidno:6的氨基酸序列的初级信号结构域。在另一个总的方面，本发明涉及本发明的car，包含编码本发明car的多核苷酸的载体，以及包含载体或编码本发明car的分离的多核苷酸的宿主细胞。本发明还涉及产生本发明car的方法，包括在产生car的条件下培养包含编码car的多核苷酸序列的宿主细胞，并且回收car。car可与宿主细胞或从宿主细胞分离的细胞膜相结合。根据另一个总的方面，本发明涉及包含本发明car的工程化免疫细胞。优选地，工程化免疫细胞是t细胞受体敲除免疫细胞。优选地，工程化免疫细胞是hlai/b2-微球蛋白敲除免疫细胞。任选地，hlai/b2-微球蛋白敲除免疫细胞另外是缺乏宿主患者的同种异体免疫应答的hlaii敲除免疫细胞。工程化免疫细胞可包含具有特异性地结合不同于bcma的靶标的胞外结构域的第二car。工程化免疫细胞也可对至少一种抗癌症化学疗法有抗性。在另一个总的方面，本发明涉及包含本发明的工程化免疫细胞的药物组合物。在另一个总的方面，本发明涉及在对其有需要的受试者中治疗b细胞相关病症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在一个优选的实施方案中，b细胞相关病症是多发性骨髓瘤。在另一个总的方面，本发明涉及使本发明的免疫细胞工程化的方法，包括提供免疫细胞，并且将编码本发明car的多肽引入该细胞中。在另一个总的方面，本发明涉及制备药物组合物的方法，包括使本发明的工程化免疫细胞与药学上可接受的载体组合，以获得药物组合物。根据以下的公开，包括本发明的详细描述和其优选的实施例以及所附权利要求书，本发明的其它方面、特征和优点将显而易见。附图说明当结合附图阅读时，将更好地理解上述
发明内容以及下文本发明的详细描述。应当理解，本发明不限于附图中示出的精确实施方案。在附图中：图1示出根据本发明实施方案的靶向bcma的car的结构域结构，其中n末端处的信号肽(hucd8sp)在成熟car蛋白质中被切除掉；图2示出根据本发明实施方案的抗bcmafn3结构域结合至瞬时表达人bcma的hek293f细胞的剂量反应曲线(drc)的评估的归一化和校准过的数据，对数据进行prism曲线拟合分析(采用结合饱和、单位点特异性结合)；图3示出根据本发明实施方案的靶向bcma的car在原代t细胞中的表达；以及图4示出根据本发明实施方案的靶向bcma的car在原代t细胞中的表达，以及它们对表达bcma的细胞的特异性杀伤，其中u2932细胞是cd19+/bcma+，h929细胞是cd19–/bcma+，并且k562细胞是cd19–/bcma–；并且效应物:靶比率基于绝对细胞数，未对表面表达归一化。图5示出根据本发明实施方案的靶向bcma的car在原代t细胞中的表达，以及它们对表达bcma的细胞的特异性杀伤。图6示出根据本发明实施方案的靶向bcma的car在原代t细胞中的表达，以及它们对表达bcma的细胞的特异性杀伤。图7示出根据本发明实施方案的靶向bcma的car在原代t细胞中的表达，以及它们对表达bcma的细胞的特异性杀伤。具体实施方式背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、物质、设备、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。除非另行指出，任何数值，诸如本文所述的浓度或浓度范围被理解为在所有情况下用术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值±10％。例如，1mg/ml的浓度包括0.9mg/ml至1.1mg/ml。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确表示，如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围内的所有单个数值，包括此类范围内的整数和该范围内的分数。如本文所用，术语“分离的”意指生物组分(诸如核酸、肽或蛋白质)已经与组分天然存在的生物体的其它生物组分(即其它染色体和染色体外dna和rna以及蛋白质)基本上分离、分开得到或从其中纯化出来。因此，已经“分离”的核酸、肽和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。“分离”核酸、肽和蛋白质可为组合物的一部分，并且如果这样的组合物不是核酸、肽或蛋白质自身环境的一部分，则仍然是分离的。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。如本文所用，“分离的”fn3结构域旨在意指基本上不含具有不同抗原特异性的其它fn3结构域的fn3结构域(例如，特异性地结合至人bcma的分离的fn3结构域基本上不含特异性地结合除bcma以外的抗原的fn3结构域)。然而，特异性地结合至bcma的表位、同工型或变体的分离的fn3结构域可以与其它相关抗原，例如来自其它物种(诸如bcma物种同源物)的抗原具有交叉反应性。如本文所用，术语“iii型纤连蛋白结构域”或“fn3结构域”指在蛋白质中频繁出现的结构域，所述蛋白质包括纤连蛋白、腱生蛋白、细胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核酶(bork和doolittle,pnasusa89:8990-8994,1992；meinke等人，jbacteriol175:1910-1918,1993；watanabe等人，jbiolchem265:15659-15665,1990)，或它们的衍生物。示例性fn3结构域是存在于人腱生蛋白c中的15个不同的fn3结构域、存在于人纤连蛋白(fn)中的15个不同的fn3结构域以及非天然合成的fn3结构域(例如us8278419中)。单个的fn3结构域用结构域编号和蛋白质名称来表示，例如腱生蛋白的第三fn3结构域(tn3)或纤连蛋白的第十fn3结构域(fn10)。如本文所用，“tencon”是指具有seqidno:1中所示以及us2010/0216708中所述的序列的合成fn3结构域蛋白质。如本文所用，术语“特异性结合”或“特异结合”是指本发明的fn3结构域以约1×10-6m或更低(例如，约1×10-7m或更低、约1×10-8m或更低、约1×10-9m或更低、约1×10-10m或更低、约1×10-11m或更低、约1×10-12m或更低或约1×10-13m或更低)的解离常数(kd)与预定靶标结合的能力。鉴于本公开，kd值可使用本领域的方法测定。例如，fn3结构域蛋白质的kd可通过使用表面等离振子共振，例如通过使用生物传感器系统(例如系统或proteon仪器(biorad))，或者通过使用生物层干涉测量技术(例如octetred96系统)进行测定。通常，fn3结构域与预定靶标(即，人bcma)结合的kd为其对于非特异性靶标的kd的至少十分之一，如通过使用例如proteon仪器(biorad)的表面等离子体共振所测得。然而，与bcma特异性结合的fn3结构域可与其它相关靶标(例如，与来自其它物种(同源物)(诸如，食蟹猕猴(macacafascicularis，cynomolgousmonkey，cyno)或黑猩猩(pantroglodytes，chimpanzee))的相同预定靶标)具有交叉反应性。如本文所用，术语“bcma”是指b细胞成熟抗原蛋白质(也称为tnfrsf17、bcm或cd269)，即肿瘤坏死因子受体(tnfr)家族成员，表达于浆细胞和成熟b细胞上。例如，人bcma是由994个核苷酸长的初级mrna转录物(nm_001192.2)编码的184个氨基酸长的蛋白质。人bcma的氨基酸序列用genbank登录号np_001183.2表示。如本文所用，术语“bcma”包括包含全长野生型bcma的突变，例如点突变、片段、插入、缺失和剪接变体的蛋白质。术语“bcma”还涵盖bcma氨基酸序列的翻译后修饰。翻译后修饰包括但不限于n-和o-连接型糖基化。如本文所用，“bcma特异性fn3结构域”是指特异性地结合bcma的fn3结构域。如本文所用，术语“使随机化”或“随机化的”或“多样化的”或“使多样化”是指在多核苷酸或多肽序列中进行至少一个取代、插入或缺失。如本文所用，术语“文库”是指变体的集合。文库可由多肽或多核苷酸变体构成。如本文所用，术语“变体”是指因一处或多处修饰(例如，置换、插入或缺失)而不同于参考多肽或参考多核苷酸的多肽或多核苷酸。如本文所用，术语“取代”或“取代的”或者“突变”或“突变的”是指在多肽或多核苷酸序列中改变、缺失或插入一个或多个氨基酸或核苷酸以生成该序列的变体。如本文所用，“tencon文库”是指tencon变体的集合。tencon文库内的分子也称为“centyrins”。如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(car)是指至少包含特异性地结合抗原或靶标的胞外结构域、跨膜结构域以及胞内t细胞受体-活化信号结构域的重组多肽。car的胞外结构域与靶细胞表面上的靶抗原结合导致car聚簇并将激活刺激传送给含car细胞。car重定向免疫效应细胞的特异性，并且触发了增殖、细胞因子产生、能够以不依赖主要组织相容性(mhc)的方式介导表达靶抗原的细胞死亡的分子的吞噬作用和/或产生。如本文所用，术语“信号肽”是指处于新生car蛋白的氨基末端(n-末端)的前导序列，其在翻译时或在翻译后将新生蛋白引导到内质网并后续表面表达。如本文所用，术语“胞外抗原结合结构域”、“胞外结构域”或“胞外配体结合结构域”是指位于细胞膜外侧并且能够结合抗原、靶标或配体的car的一部分。如本文所用，术语“铰链区”是指连接car蛋白质的两个相邻结构域，例如胞外结构域和跨膜结构域的car的一部分。如本文所用，术语“跨膜结构域”是指跨越细胞膜延伸并使car锚定于细胞膜的car的一部分。如本文所用，术语“胞内t细胞受体-活化信号结构域”、“细胞质信号结构域”或“胞内信号结构域”是指位于细胞膜内侧并能够转导效应信号的car的一部分。如本文所用，术语“刺激性分子”是指由t细胞表达的分子，提供以对t细胞信号转导途径的至少一些方面的刺激方式来调节t细胞受体(tcr)复合物的初步活化的初级细胞质信号序列。刺激性分子包含两类不同的细胞质信号序列——引发抗原依赖性初步活化的那些(称为“初级信号结构域”)，以及以抗原非依赖性方式起作用来提供第二共同刺激信号的那些(称为“共同刺激信号结构域”)。如本文所用，同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”的术语“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰的rna或dna或者修饰的rna或dna。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的dna、为单链区和双链区的混合物的dna、单链和双链的rna以及为单链区和双链区的混合物的rna、包含可为单链或更典型地为双链或者为单链区和双链区的混合物的dna和rna的杂合分子。此外，“多核苷酸”是指包含rna或dna或rna和dna两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的dna或rna，以及具有出于稳定性或其它原因而被修饰的主链的dna或rna。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可以对dna和rna进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的dna和rna的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。如本文所用，术语“载体”是复制子，其中可以可操作地插入另一核酸区段以引起该区段的复制或表达。如本文所用，术语“宿主细胞”是指包含本发明的核酸分子的细胞。“宿主细胞”可为任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在一个实施方案中，“宿主细胞”是用本发明的核酸分子转染的细胞。在另一个实施方案中，“宿主细胞”是此类经转染细胞的后代或潜在后代。细胞的后代可以或不可与亲本细胞相同，例如，由于可在后代中发生的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中。如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成。该术语涵盖基因到rna的转录。该术语还涵盖rna到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。表达的fn3结构域或car可处于宿主细胞的细胞质之内，处于胞外环境诸如细胞培养物的生长培养基中，或锚定至细胞膜。如本文所用，术语“免疫细胞”或“免疫效应细胞”是指参与免疫应答，例如促进免疫效应应答的细胞。免疫细胞的示例包括t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、肥大细胞、以及来源于骨髓的吞噬细胞。根据特定实施方案，工程化免疫细胞是t细胞，并且称为car-t细胞，因为它们被工程化成用于表达本发明的car。如本文所用，术语“工程化免疫细胞”是指通过将dna或rna形式的额外遗传物质加入细胞的总遗传物质而被基因修饰的免疫细胞，也称为免疫效应细胞。根据本文的实施方案，工程化免疫细胞已经过基因修饰以表达根据本发明的靶向bcma的car。如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知用于药物制剂的其它材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。如本文所用，术语“受试者”是指动物，并优选哺乳动物。根据特定实施方案，受试者是哺乳动物，包括非灵长类(例如骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、犬、大鼠、兔子、豚鼠或小鼠)或灵长类(例如猴、黑猩猩或人)。在特定实施方案中，受试者是人。如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引起所期望的生物学或药物学应答的活性成分或组分的量。治疗有效量可相对于指定目的根据经验以常规方式进行确定。如本文所用，术语“治疗”和“处理”均旨在意指与癌症或自体免疫性疾病有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是受试者中可识别的，但能够在受试者中识别。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症发展。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻、预防发展或发作，或缩短与疾病、障碍或病症(诸如肿瘤或更优选癌症)相关的一种或多种症状的持续时间。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指防止疾病、障碍或病症的复发。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、障碍或病症的受试者的存活提高。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受试者中疾病、障碍或病症的消除。基于fn3序列的文库tencon是由来自人腱生蛋白-c的十五个fn3域的共有序列设计的非天然存在的fn3结构域(jacobs等人，proteinengineering,design,andselection,25:107-117,2012；us2010/0216708)。tencon的晶体结构示出六个表面暴露环，这些环连接七个β-链作为fn3域的特性，所述β-链称为a、b、c、d、e、f和g，并且所述环称为ab、bc、cd、de、ef和fg环(bork和doolittle,pnasusa89:8990-8992,1992；us6673901)。这些环或每个环中所选择的残基可随机化，以便构建可用于选择出结合bcma的新型分子的fn3结构域文库。表1示出了tencon(seqidno:1)中的每个环和β-链的位置和序列。表1fn3结构域tencon(seqidno:1)a链1-12ab环13-16b链17-21bc环22-28c链29-37cd环38-43d链44-50de环51-54e链55-59ef环60-64f链65-74fg环75-81g链82-89根据tencon序列设计的文库可因此在一个或多个环或链中具有随机化序列。例如，基于tencon的文库可在ab环、bc环、cd环、de、ef环和fg环中的一者或多者具有随机化序列。例如，tenconbc环的长度为7个氨基酸，因此1、2、3、4、5、6或7个氨基酸可在bc环处多样化的基于tencon序列的文库中随机化。tenconcd环的长度为6个氨基酸，因此1、2、3、4、5或6个氨基酸可在cd环处多样化的基于tencon序列的文库中随机化。tenconef环的长度为5个氨基酸，因此1、2、3、4或5个氨基酸可在ef环处多样化的基于tencon序列的文库中随机化。tenconfg环的长度为7个氨基酸，因此1、2、3、4、5、6或7个氨基酸可在fg环处多样化的基于tencon序列的文库中随机化。tencon文库中的环处的进一步多样性可通过环处残基的插入和/或缺失来实现。例如，bc、cd、ef和/或fg环可延伸1-22个氨基酸，或减少1-3个氨基酸。tencon中的fg环的长度为7个氨基酸，而抗体重链中的相应环在4-28个残基的范围内。为了提供最大的多样性，fg环在序列以及长度方面可为多样化的以对应于4-28个残基的抗体cdr3长度范围。例如，fg环在长度方面可通过将环延伸额外的1、2、3、4或5个氨基酸进一步多样化。根据tencon序列设计的文库也可具有随机化可选表面，所述表面在fn3结构域的侧面上形成并且包含两条或更多条β链，以及至少一个环。一个这样的可选表面由cβ-链和fβ-链以及cd环和fg环中的氨基酸形成(c-cd-f-fg表面)。基于tencon可选c-cd-f-fg表面的文库设计在us2013/0226834中有所描述。基于tencon序列设计的文库还包括基于tencon变体设计的文库，诸如在第11、17、46和/或86位残基位置处具有取代的tencon变体(残基编号对应于seqidno:1)，并且所述变体显示出改善的热稳定性。示例性tencon变体在us2011/0274623中有所描述，并且包括tencon27(seqidno:45)，其与seqidno:1的tencon相比具有取代e11r、l17a、n46v和e86i。可使用随机的或定义的氨基酸集合在所选残基位置处使tencon文库和基于其它fn3序列的文库随机化。例如，可使用nnk密码子(其编码所有20种天然存在的氨基酸)产生具有随机取代的文库中的变体。在其它多样化方案中，dvk密码子可用于编码氨基酸ala、trp、tyr、lys、thr、asn、lys、ser、arg、asp、glu、gly和cys。另选地，nns密码子可用于产生所有20种氨基酸残基，与此同时降低终止密码子的频率。可例如使用技术(http:_//www_sloning_com)来合成在待多样化的位置具有偏向氨基酸分布的fn3结构域文库。这种技术使用预先制备的双链三体的文库，其用作对于成千上万的基因合成工艺而言为足够的通用构建模块。该三体文库代表对构建任何期望的dna分子所必需的所有可能的序列组合。密码子命名根据熟知的iub码。bcma特异性fn3结构域及其用途在一个总的方面，本发明涉及特异性地结合bcma的分离的fn3结构域。根据本发明的实施方案，分离的fn3结构域特异性地结合bcma的胞外结构域，诸如人bcma的残基1至54之内的序列。在一些实施方案中，分离的bcma特异性fn3结构域包含连接至分子的n末端的起始甲硫氨酸(met)。在一些实施方案中，分离的fn3结构域包含与seqidno:1有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，并且fn3结构域以小于1×10-6m的kd结合bcma，优选人bcma，如通过使用表面等离振子共振所测。例如，fn3结构域以小于1×10-6m、5×10-7m、1×10-7m、5×10-8m、1×10-8m、5×10-9m、1×10-9m、5×10-10m、1×10-10m、5×10-11m、1×10-11m、5×10-12m、1×10-12m、5×10-13m或1×10-13m的kd结合人bcma，如通过使用生物传感器系统(例如proteon仪器(biorad))所测定。在一些其它实施方案中，特异性地结合bcma，优选人bcma的分离的fn3结构域包含与seqidno:7有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。根据本发明的其它实施方案，分离的fn3结构域包含与选自seqidno:8-44和58-145中的一者有至少90％同一性的氨基酸序列，其中fn3结构域特异性地结合bcma，优选地人bcma。在一些实施方案中，分离的bcma特异性fn3结构域相比于seqidno:8-44和58-145之一的氨基酸序列时具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个置换。优选地，分离的fn3结构域包含seqidno:8-44和58-145的氨基酸序列中的一者。在特定实施方案中，bcma特异性fn3结构域可包含如seqidno:8-44和58-145中一者所示的序列的变体，其中a-链、b-链、bc环、c-链、cd环、d-链、ef环、f-链、fg-环和/或g环用任何所述bcma特异性fn3结构域序列(即seqidno:8-44和58-145)的相应一组a-链、b-链、bc环、c-链、cd环、d-链、ef环、f-链、fg-环和/或g环序列，或与任何所述bcma特异性fn3结构域序列(即seqidno:8-44和58-145)的a-链、b-链、bc环、c-链、cd环、d-链、ef环、f-链、fg-环和/或g环序列有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列替换。根据本公开，可使用任何fn3结构域作为模板以生成文库，并使用本领域的技术人员已知的方法筛选文库中特异性结合bcma的分子，从而生成根据本发明实施方案的特异性结合bcma(诸如人bcma)的fn3结构域。可使用的示例性fn3结构域为腱生蛋白c的第三fn3结构域(tn3)、fibcon以及纤连蛋白的第十fn3结构域(fn10)。参见例如us9200273。标准的克隆和表达技术用于将文库克隆到载体中或合成文库的双链cdna盒，以在体外表达或翻译文库。可使用例如核糖体展示(hanes和pluckthun，pnasusa,94,4937-4942,1997)、mrna展示(roberts和szostak，pnasusa,94,12297-12302,1997)或其它无细胞系统(us5643768)。fn3结构域变体的文库可表达为在例如任何合适的噬菌体的表面上展示的融合蛋白。用于在噬菌体表面展示融合多肽的方法是公知的(us2011/0118144、wo2009/085462、us6969108、us6172197、us5223409、us6582915、us6472147)。根据本发明的实施方案，特异性地结合人bcma的fn3结构域可通过以下方式分离：使用顺式展示产生fn3文库(诸如tencon文库)以将编码fn3支架蛋白的dna片段连接至编码repa的dna片段，从而生成在体外翻译之后形成的蛋白质-dna复合物池，其中每种蛋白质与编码其的dna稳定关联(us7842476odegrip等人，pnasusa101,2806-2810,2004)；以及通过本领域已知以及如实施例中描述的任何方法针对与人bcma特异性结合对文库进行分析。可使用的示例性熟知的方法为elisa法、夹心免疫测定法以及竞争性和非竞争性测定法(参见例如，ausubel等人编辑，1994,currentprotocolsinmolecularbiology,vol.1,johnwiley&sons,inc.,newyork)。根据所期望的特征，对所鉴定的特异性结合人bcma的fn3结构域进一步表征。特异性结合bcma(诸如人bcma)的fn3结构域可被修饰以改善其特性，诸如改善热稳定性以及热折叠和解折叠的可逆性。多种方法已应用于增加蛋白质和酶的表观热稳定性，包括基于与高度相似的热稳定序列比较的合理设计、稳定二硫桥的设计、增加α-螺旋倾向的突变、对盐桥进行工程改造、蛋白质的表面电荷的改变、定向进化和共有序列的构成(lehmann和wyss，curropinbiotechnol,12,371-375,2001)。高度的热稳定性可增加所表达蛋白质的收率、改善溶解度或活性、降低免疫原性并且使生产中对冷链的需要最小化。能够被置换以改善tencon(seqidno:1)的热稳定性的残基包括但不限于seqidno:1的位置11、14、17、37、46、73和86处的一个或多个残基，如us2011/0274623所述(其以引用方式并入本文)。对应于这些残基的取代可结合到根据本发明的实施方案的fn3结构域中。根据本发明的实施方案的特异性地结合bcma，诸如人bcma的fn3结构域可用于治疗目的、诊断目的或期望特异性结合bcma的任何其它目的。例如，fn3结构域可用于诊断目的，以检测生物样品中bcma的存在或定量bcma的水平。fn3结构域也可用于治疗目的，以预防或治疗与bcma相关的疾病或障碍，诸如本文所公开的那些。在一些实施方案中，本发明还涉及药物组合物，该药物组合物包含本发明的fn3结构域和药学上可接受的载体，诸如本文所公开的那些。fn3结构域还可与例如根据本发明的car的胞外结构域中的一种或多种其它组分一起使用。靶向bcma的嵌合抗原受体(car)在其它总的方面，本发明涉及包含bcma特异性fn3结构域的靶向bcma的car。在一个方面，本发明涉及car，其包含：胞外结构域，具有特异性地结合bcma的fn3结构域；跨膜结构域；以及胞内信号结构域。在一些实施方案中，在新生car中，胞外结构域处在n末端的信号肽之后。本发明可使用任何合适的信号肽。信号肽可源于天然、合成、半合成或重组来源。根据一个实施方案，信号肽是人cd8信号肽、人cd3δ信号肽、人cd3ε信号肽、人gmcsfr信号肽、人41-bb信号肽、或它们的衍生物。根据特定实施方案，信号肽具有与seqidno:2有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:2的氨基酸序列。根据其它特定实施方案，信号肽具有与seqidno:50-53中的一者有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:50-53中一者的氨基酸序列。信号肽可在完全易位期间或之后被信号肽酶裂解，以生成不含信号肽的成熟car。根据本发明的实施方案，car的胞外结构域包含bcma特异性fn3结构域。根据本发明实施方案的任何bcma特异性fn3结构域(包括但不限于本文所述的那些)可用于car的胞外结构域。根据本发明的实施方案，car还可包含使胞外结构域和跨膜结构域连接的铰链区。铰链区用于使胞外结构域远离工程化免疫细胞的表面移动以实现适当的细胞/细胞接触，从而结合靶标或抗原并且活化(patel等人，genetherapy,1999；6:412-419)。任何合适的铰链区均可用于本发明的car。其可源于天然、合成、半合成或重组来源。根据一些实施方案，car的铰链区是6xgs肽或其片段，或来自cd8蛋白质的铰链区，或它们的衍生物。在特定实施方案中，铰链区具有与seqidno:3有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:3的氨基酸序列。任何合适的跨膜结构域均可用于本发明的car。跨膜结构域可源于天然、合成、半合成或重组来源。根据一些实施方案，跨膜结构域是来自诸如cd8、cd28、cd4、cd2、gmcsfr等分子的跨膜结构域。在特定实施方案中，跨膜结构域具有与seqidno:4有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:4的氨基酸序列。在其它实施方案中，跨膜结构域具有与seqidno:54-57中的一者有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:54-57中一者的氨基酸序列。任何合适的胞内信号结构域均可用于本发明的car。在特定实施方案中，使用整个胞内信号结构域。在其它特定实施方案中，使用转导效应信号的信号结构域的截短部分。根据本发明的实施方案，胞内信号结构域产生的信号促进含car细胞(例如car-t细胞)的免疫效应功能，包括但不限于增殖、活化和/或分化。在特定实施方案中，该信号促进例如car-t细胞的溶细胞活性、辅助细胞活性和/或细胞因子分泌。根据一些实施方案中，胞内信号结构域包含源于以下项的功能信号结构域：cd3ζ、tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd16、cd22、cd27、cd28、cd30、cd79a、cd79b、cd134(也称为tnfrsf4或ox-40)、4-1bb(cd137)、cd278(也称为icos)、fcεri、dap10、dap12、itam结构域或cd66d等。根据特定实施方案，胞内信号结构域包含初级信号结构域以及一个或多个共同刺激信号结构域。在一个实施方案中，胞内信号结构域包含具有源于人cd3ζ的功能信号结构域的初级胞内信号结构域。在特定实施方案中，初级胞内信号结构域具有与seqidno:6有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:6的氨基酸序列。根据一些实施方案，胞内信号结构域还包含源于人4-1bb的共同刺激胞内信号结构域。在特定实施方案中，共同刺激胞内信号结构域具有与seqidno:5有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:5的氨基酸序列。在一个实施方案中，胞内信号结构域具有与seqidno:49有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:49的氨基酸序列。在特定实施方案中，car具有图1所示的结构，从n末端到c末端包含bcma特异性fn3结构域(centyrin)、人cd8铰链区、人cd8跨膜区、人4-1bb胞内结构域、以及人cd3ζ胞内结构域。新生car还包含人cd8信号肽，其随后在成熟car中被切除。在一个实施方案中，本发明的car与表达car的宿主细胞结合。在另一个实施方案中，本发明的car存在于表达car的宿主细胞的分离的细胞膜中。在另一个实施方案中，将本发明的car从表达car的宿主细胞的其它组分中纯化或分离。多核苷酸、载体和宿主细胞在其它总的方面，本发明涉及编码本发明的fn3结构域或car的分离的多核苷酸和载体，以及包含该载体的重组细胞。鉴于本公开，编码本文所公开的任何各种蛋白质或多肽的核酸能够以化学方式或使用本领域内的其它方法进行合成。密码子使用可被选择成使得改善细胞中的表达。此类密码子使用将取决于所选的细胞类型。特化的密码子使用模式已被开发成用于大肠杆菌(e.coli)及其它细菌，以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞。参见例如：mayfield等人，pnasusa.2003100(2):438-42；sinclair等人《蛋白表达与纯化杂志》2002(1):96-105；connell,curropinbiotechnol.2001(5):446-9；makrides等人microbiolrev.199660(3):512-38；andsharp等人yeast.19917(7):657-78。用于核酸操作的一般技术在本领域的技术人员视野范围内，并且还描述于例如sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual，第1-3卷，coldspringharborlaboratorypress，第2版，1989，或ausubel等人编辑，1994,currentprotocolsinmolecularbiology，第1卷，johnwiley&sons,inc.,newyork并定期更新(以引用方式并入本文)。编码蛋白质的dna可操作地连接至源于哺乳动物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调控元件。此类调控元件包含转录启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。另外掺入通常由复制起点所赋予的宿主内复制能力，以及有助于识别转化体的选择基因。合适的调控元件是本领域中已知的。本领域的技术人员将理解，可以改变蛋白质的编码序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。因此，本领域的技术人员将理解，可变更编码本发明的fn3结构域或car的核酸序列而不改变蛋白质的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明涉及包含编码本发明的fn3结构域或car的分离的核酸的载体。根据本公开，可使用本领域内的技术人员已知的任何载体，诸如质粒、粘端质粒、噬菌体载体或病毒载体。在一个实施方案中，载体是包含编码本发明的fn3结构域或car的多核苷酸序列的表达载体，该多核苷酸序列可操作地连接至启动子序列，任选地一个或多个其它调控序列。在其它实施方案在，本发明涉及通过编码car的mrna来瞬时表达本发明的car。在一个方面，将编码car的mrna以瞬时转染形式引入免疫效应细胞中，其中非整合的转基因的表达被表达数小时、数天或数周的时段，其中该表达的时间段少于整合进基因组或包含在宿主细胞的稳定质粒复制子之内情况下的基因表达的时间段。在一个方面，使用pcr产生的模板，通过体外转录产生mrna。在另一个总的方面，本发明涉及包含编码本发明的fn3结构域或car的分离的核酸的宿主细胞。宿主细胞可以用本发明的核酸分子稳定或瞬时转染。合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞、或细菌细胞。合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或芽孢杆菌属(bacillusspp.)。优选地来自于酵母属(saccharomyces)物种的酵母，诸如酿酒酵母(s.cerevisiae)也可用于产生多肽。各种哺乳动物或昆虫细胞培养物体系也可用于表达重组蛋白质。luckow和summers(bio/technology,6:47,1988)综述了用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统。在某些情况下，期望在脊椎动物细胞中产生蛋白质，诸如对于糖基化，在培养物(组织培养物)中增殖脊椎动物细胞已经成为常规方法。合适的哺乳动物宿主细胞系的示例包括内皮细胞、cos-7猴肾细胞、cv-1、l细胞、c127、3t3、中国仓鼠卵巢(cho)、人胚肾细胞、hela、293、293t和bhk细胞系。本发明的宿主细胞可为工程化靶向bcma的免疫细胞，其在下文有详细描述。蛋白质产生在另一个总的方面，本发明涉及产生本发明的fn3结构域的方法，包括在产生本发明的fn3结构域的条件下培养包含编码fn3结构域的核酸的宿主细胞，并且从细胞或细胞培养物(例如从上清液)回收fn3结构域。根据本公开，可以从细胞或细胞培养物收获表达的fn3结构域并根据本领域已知的常规技术进行纯化。在另一个总的方面，本发明涉及产生本发明的car的方法，包括在产生本发明的car的条件下培养包含编码car的核酸的宿主细胞，并且回收car。可以从细胞收获表达的car，并且根据本领域已知以及如本文所述的常规技术进行纯化。用表达或克隆载体转化宿主细胞以用于蛋白质产生，并且在常规营养基中培养，该营养基被改良为适于例如诱导启动子、选择转化体或扩增编码所期望序列的基因。可在多种培养基中培养用于产生本发明的蛋白质的宿主细胞。市售的培养基诸如ham’sf10(sigma)、极限必需培养基((mem)，sigma)、rpmi-1640(sigma)，以及dulbecco改良eagle培养基((dmem)，sigma)适用于培养宿主细胞。此外，ham等人，meth.enz.58:44(1979)；barnes等人，anal.biochem.102:255(1980)；us4767704；us4657866；us4927762；us4560655；us5122469；wo90/03430；wo87/00195或usre30985所述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基可根据需要补充有激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如hepes)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如gentamycintm药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)，以及葡萄糖或等同形式的能量源。还可包括本领域的技术人员已知的适当浓度的任何其它需要的补充剂。培养条件，诸如温度、ph等是先前选择用于表达的宿主细胞所使用的那些，并且对于普通的技术人员是显而易见的。本文所公开的蛋白质也可用细胞翻译系统在体外产生。为此，编码蛋白质的核酸必须被修饰成允许体外转录产生mrna并在所用的特定无细胞体系中无细胞翻译mrna。示例性无真核细胞翻译系统包括例如无哺乳动物或酵母细胞翻译系统，并且示例性无原核细胞翻译系统包括例如无细菌细胞翻译系统。本文所公开的蛋白质也可通过化学合成产生(例如solidphasepeptidesynthesis，第2版，1984,thepiercechemicalco.,rockford,il所述的方法)。蛋白质修饰也可通过化学合成产生。本文所公开的蛋白质可通过蛋白质化学领域通常已知的蛋白质的分离/纯化方法进行纯化。非限制性示例包括提取、重结晶、盐析(例如用硫酸铵或硫酸钠)、离心、渗析、超滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、正相色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、凝胶渗透色谱法、亲和色谱法、电泳、反流分布法或这些的任何组合。在纯化之后，可使蛋白质交换到不同的缓冲液中，并且/或者通过本领域已知任何多种方法，包括但不限于过滤和渗析对蛋白质进行浓缩。经纯化的蛋白质优选地为至少85％的纯度，更优选地至少95％的纯度，并且最优选地至少98％的纯度。工程化靶向bcma的car-t细胞、其组合物和方法在另一个总的方面，本发明涉及包含本发明的靶向bcma的car的工程化靶向bcma的免疫细胞，制备工程化免疫细胞的方法，包含工程化免疫细胞的组合物，以及使用工程化免疫细胞治疗疾病诸如多发性骨髓瘤的方法。在一个总的方面，本发明涉及包含本发明的靶向bcma的car的工程化免疫细胞。根据一些实施方案，可例如通过以下方式制备异源性较小的免疫细胞：使表达t细胞受体(tcr)的一种或多种组分的至少一种基因失活，如wo2013/176915中所述，其能够与使编码或调节hlai/b2-微球蛋白(b2m)的蛋白质表达的基因失活相结合。因此，移植物抗宿主综合征以及移植物排斥的风险显著下降。缺乏功能tcr(称为“tcr敲除”或“tcr-ko”细胞)的t细胞能够被工程化成使得其不在它表面表达任何功能tcr；工程化成使得其不表达包含功能tcr的一个或多个亚基(例如，工程化成使得其不表达(或表现出减少的表达)tcrα、tcrβ、tcrγ、tcrδ、tcrε和/或tcrζ)；或工程化成使得其在它表面产生极少的功能tcr。另选地，t细胞可例如通过表达tcr的一种或多种亚基的突变或截短形式来表达明显削弱的tcr(即在宿主中不引发不良免疫反应的tcr)。缺乏功能tcr和/或b2m表达的经修饰t细胞可通过任何合适的方式获得，包括敲除或敲去tcr和/或b2m的一个或多个亚基。例如，t细胞可包括使用sirna、shrna、成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)、类转录激活因子效应物核酸酶(talen)、megatal、大范围核酸酶、或锌指内切核酸酶(zfn)敲去tcr和/或b2m。在特定实施方案中，包含本发明的靶向bcma的car的免疫效应细胞是t细胞、nkt细胞或nk细胞，优选地人t细胞或人nk细胞，更优选地tcr敲除细胞，最优选地人tcr敲除细胞和/或hlai/b2m敲除细胞。在其它实施方案中，包含本发明的靶向bcma的car的免疫效应细是工程化t细胞系，诸如tall-104t细胞系(即表达cd8和cd3而非cd16的il-2-依赖性人非限制性细胞毒性t细胞系)。本发明的免疫效应细胞可为自体同源(即“自体”，例如同源)或非自体同源(即“非自体”，例如异源、同系、异种)。自体同源是指源于同一个体的任何物质，该物质稍后被重新引入该个体。非自体同源是指源于同一物种的不同个体的任何物质，该物质稍后被引入该个体。在另一个总的方面，本发明涉及制备包含本发明的靶向bcma的car的工程化靶向bcma的免疫细胞的方法。编码car的载体可被直接转导到免疫细胞中。另选地，可将编码car的体外转录的rna或合成rna引入免疫细胞中。根据特定实施方案，制备工程化靶向bcma的免疫细胞的方法包括转染或转导分离自个体的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达根据本发明实施方案的一种或多种car。制备用于免疫疗法的免疫细胞的方法描述于例如wo2014/130635、wo2013/176916和wo2013/176915，这些专利以引用方式并入本文。公开了可用于制备工程化免疫细胞的单个步骤，例如wo2014/039523、wo2014/184741、wo2014/191128、wo2014/184744和wo2014/184143，这些专利以引用方式并入本文。在一个特定实施方案中，将免疫效应细胞诸如t细胞用本发明的car遗传修饰(例如用包含编码car的核酸的病毒载体转导)，随后活化并在体外扩增。在各种实施方案中，可使用如例如us6352694,us6534055,us6905680,us6692964,us5858358,us6887466,us6905681,us7144575,us7067318,us7172869,us7232566,us7175843,us5883223,us6905874,us6797514,us6867041,us2006/121005(它们以引用方式并入本文)所述的方法，在基因修饰以表达car之前或之后，使t细胞活化并扩增。t细胞可在体外或体内扩增。一般来讲，本发明的t细胞可通过接触其上附着有刺激cd3/tcr复合物相关的信号的试剂以及刺激t细胞表面的共同刺激分子的配体的表面来扩增。作为非限制性示例，如此处所述，可例如通过接触固定于表面上的抗cd3抗体或其抗原结合片段、或抗cd2抗体，或通过接触连有钙离子载体的蛋白激酶c活化剂(例如苔藓虫素)，或通过活化car自身来刺激t细胞群。为共刺激t细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配基。例如，可在适于刺激t细胞增殖的条件下使t细胞群与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。适于t细胞培养的条件包括例如适当的培养基(例如极限必需培养基或rpmi培养基1640或x-vivo5(lonza))，其中可包含增殖和存活所需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白细胞因子诸如il-2、il-7、il-15和/或il-21、胰岛素、ifn-g、gm-csf、tgfb和/或技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。在其它实施方案中，可使用诸如us6040177、us5827642和wo2012129514(它们以引用方式并入本文)中所述的那些的方法，采用饲养细胞以及适当的抗体和细胞因子使t细胞活化和刺激以进行增殖。在一些实施方案中，本发明表达的car细胞还可包含具有特异性地结合相同靶标或不同靶标的胞外结构域的第二car。优选地，免疫细胞表达特异性地结合两种不同靶标的两种car，或者免疫细胞表达双特异性受体，诸如包含特异性地结合至与所感兴趣的相同疾病相关的两种不同靶标(即bcma及另一种靶标)的两个fn3结构域的car。例如，其它靶标也可与多发性骨髓瘤相关，诸如cd19、cd20、cs-1、k轻链、cd138、lewisy抗原、或cd38(garfall等人，discoverymedicine,2014,17(91):37-46)。更优选地，两种car还具有不同的胞内信号结构域，例如第一car具有共刺激性信号结构域而不具有初级信号结构域，并且第二car具有初级信号结构域而不具有共刺激性信号结构域，或者反之亦然。通过将共刺激性信号结构域(诸如来自4-1bb、cd28、cd27icos或ox-40)定位到一种car上，并将初级信号结构域(来自诸如cd3ζ)定位到另一种car上，可以限制针对表达两种靶标的细胞的car活性，例如用于增强特异性。在一些实施方案中，本发明的表达car的细胞还可包含抑制性car作为我调节安全开关来约束基于t细胞的疗法并避免肿瘤细胞毒性。例如，抑制性car可包括特异性地结合正常细胞而非靶癌细胞上所见的靶标的胞外结构域。抑制性car也包括具有抑制性受体信号结构域的胞内结构域，诸如包括但不限于pd1、pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、ceacam(例如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、hvem(tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、i类mhc、ii类mhc、gal9、腺苷和tgfrβ的抑制性分子的胞内结构域。表达靶向bcma的car和抑制性car的细胞遇到正常细胞时受到抑制，但在遇到不表达正常细胞靶标的肿瘤细胞时被激活。在一些其它实施方案中，本发明的表达car的细胞还可包含提高表达car的细胞的活性的试剂。例如，该试剂能够抑制宿主细胞中抑制性分子的活性，诸如本文所述的那些。根据特定实施方案，工程化免疫car表达细胞被进一步基因工程化成对至少一种抗癌症化学疗法有抗性。该药物抗性可允许工程化免疫细胞在药物存在下存活，同时选择性地靶向表达bcma的细胞。根据一些实施方案，通过使表达car的细胞遗传工程成表达至少一种药物抗性基因而使其具有药物抗性。本发明的药物抗性基因可编码抗代谢物、甲氨蝶呤、长春碱、顺铂、烷基化剂、蒽环类抗生素、细胞毒性抗生素、抗免疫亲和素、它们的类似物或衍生物等的抗性。已经鉴定出可用于赋予本发明的工程化免疫car表达细胞药物抗性的几种药物抗性基因。参见例如takebe等人，molther.2001年1月；3(1):88-96.；sugimoto等人，jgenemed.2003年5月；5(5):366-76；zielske等人，jclininvest.2003年11月；112(10):1561-70；nivens等人，cancerchemotherpharmacol.2004年2月；53(2):107-15；bardenheuer等人，leukemia.2005年12月；19(12):2281-8；kushman等人，carcinogenesis.2007年1月；28(1):207-14。可在细胞中表达的药物抗性基因的示例包括二氢叶酸还原酶(dhfr)的突变或修饰形式、肌苷-5'-单磷酸脱氢酶ii(impdh2)的突变或修饰形式、多药物抗性蛋白1(mdr1)、钙调磷酸酶、甲基鸟嘌呤转移酶(mgmt)、微rna-21、抗生素抗性基因ble和mcra等。根据特定实施方案，可通过任何合适的方式，包括例如将至少一种载体所编码的转基因引入细胞中，使所述药物抗性基因在细胞中表达。也可例如通过使负责细胞对药物的敏感性的基因失活而赋予对抗癌症化学疗法的抗性。可失活以赋予细胞药物抗性的基因的示例包括例如cd52、糖皮质素受体、cd3、人次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)、人脱氧胞苷激酶(dck)等。负责细胞对抗癌药物的敏感性的基因可通过任何合适的方式失活，包括敲除或敲去基因，例如使用sirna、shrna、crispr、talen、或zfn。在另一个总的方面，本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含本发明的工程化靶向bcma的免疫细胞和药学上可接受的载体。根据本公开，适用于car-t药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本发明。在另一个总的方面，本发明涉及在对其有需要的受试者中治疗b细胞相关疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。b细胞相关疾病包括与不适当的b细胞活性和b细胞恶性肿瘤相关的疾病、障碍或病症，例如增殖性疾病诸如癌症或恶性肿瘤、癌症前期病症、或与表达bcma的细胞相关的非癌症病症。根据特定实施方案，本发明涉及在对其有需要的受试者中治疗多发性骨髓瘤的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。根据本发明的实施方案，治疗有效量的药物组合物在对其有需要的受试者中刺激免疫应答，优选地导致治疗疾病、障碍或病症；预防或减缓疾病、障碍或病症的发展；或减轻或完全缓解与免疫疾病、障碍或病症相关的症状。根据特定实施方案，所治疗的疾病、障碍或病症是过度增殖疾病。根据其它特定实施方案，所治疗的疾病、障碍或病症是癌症或肿瘤，或恶性过度增殖疾病，优选选自以下的癌症：实体瘤、血液性癌症、膀胱癌、胆管癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌、胃癌、胶质瘤、头癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、颈癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、肾癌、涎腺癌、胃部癌症、胸腺上皮癌、以及甲状腺癌。优选地，所治疗的疾病、障碍或病症是癌症或恶性肿瘤、或癌症前期病症，选自脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征或白血病前期中的一种或多种。根据一些实施方案，所治疗的疾病、障碍或病症是选自b细胞急性淋巴细胞白血病(ball)、t细胞急性淋巴细胞白血病(tall)、急性淋巴细胞白血病(all)中的一种或多种的急性白血病；慢性髓细胞性白血病(cml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)；b细胞幼稚淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增殖疾病、malt淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞瘤、华氏巨球蛋白血症；前列腺癌、胰腺癌、肺癌；或浆细胞增殖性障碍、未明确诊断意义的单克隆丙种球蛋白病(mgus)、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、以及poems综合征，或它们的组合。根据一个实施方案，所治疗的疾病、障碍或病症是多发性骨髓瘤。根据特定实施方案，多发性骨髓瘤选自显性多发性骨髓瘤、郁积型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌型骨髓瘤、igd骨髓瘤、骨硬化骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤、以及髓外浆细胞瘤。根据特定实施方案，治疗有效量的靶向bcma的免疫细胞组合物足以在对其有需要的受试者中实现以下效应中的一者、两者、三者、四者、或更多者：(i)减轻或缓解所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的严重性；(ii)减少所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的持续时间；(iii)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状发展；(iv)引起所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状消退；(v)防止所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状发展或发作；(vi)防止所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状复发；(vii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的住院治疗；(viii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的住院时间；(ix)提高患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的存活；(xi)抑制或减少受试者中所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。在特定实施方案中，治疗有效量是指足以实现以下效应中的一者、两者、三者、四者、或更多者的治疗量：(i)减小肿瘤体积；(ii)减少肿瘤细胞数；(iii)降低转移瘤数量；(iv)增大预期寿命；(v)降低肿瘤细胞增殖；(vi)降低肿瘤细胞存活；(vii)改善与癌症病症相关的生理症状；和/或(viii)防止肿瘤出现。治疗有效的量或剂量可根据各种因素变化，诸如所治疗的疾病、障碍或病症；施用方式；目标部位；受试者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康状态)，受试者是人还是动物；所施用的其它药物，并且治疗是预防性还是治疗性。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。确切剂量可使用已知技术由本领域的技术人员确定。一般来讲，将靶向bcma的免疫细胞以约105至108个细胞/kg体重的剂量施用。根据一些实施方案，细胞的总剂量可经由剂量分次施用给受试者，例如一次、两次、三次或更多次分开施用部分剂量。根据特定实施方案，本文所述组合物被配制成适于施用于受试者的预期途径。例如，本文所述组合物可被配制成适于静脉内、皮下或肌内注射施用。根据特定实施方案，用于治疗癌症的组合物可以与另一种治疗联合使用，包括但不限于化学疗法、淋巴细胞清除疗法、放射疗法、其它免疫-肿瘤药物、靶向疗法、癌症疫苗、或其它抗癌药物。如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受试者的情形中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。使用的术语“联合”并不限制疗法施用于受试者的次序。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可在第二疗法施用于受试者之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)，同时，或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以后)施用。在另一个总的方面，本发明涉及在对其有需要的受试者中重定向免疫细胞以使它们靶向杀伤bcma呈递细胞的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。在另一个总的方面，本发明涉及产生包含本发明的靶向bcma的免疫细胞的药物组合物的方法，包括使靶向bcma的免疫细胞与药学上可接受的载体组合，以获得药物组合物。本发明还提供一些非限制性实施方案。实施方案实施方案1是分离的fn3结构域，其中所述fn3结构域特异性地结合bcma，优选地人bcma。实施方案2是根据实施方案1所述的分离的fn3结构域，其中所述fn3结构域特异性地结合bcma的胞外结构域，诸如人bcma的残基1至54之内的序列。实施方案3是根据实施方案1所述的分离的fn3结构域，其包含与seqidno:1有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，并且fn3结构域以小于1×10-6m、5×10-7m、1×10-7m、5×10-8m、1×10-8m、5×10-9m、1×10-9m、5×10-10m、1×10-10m、5×10-11m、1×10-11m、5×10-12m、1×10-12m、5×10-13m或1×10-13m的kd结合bcma，优选地人bcma，如通过使用表面等离振子共振所测，例如通过使用生物传感器系统(例如proteon仪器(biorad))。实施方案4是根据实施方案1所述的分离的fn3结构域，其包含与seqidno:7有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。实施方案5是根据实施方案1所述的分离的fn3结构域，其包含与seqidno:8-44和58-145中的一者有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地包含seqidno:8-44和58-145中一者的氨基酸序列。实施方案6是编码根据实施方案1-5中任一项所述的fn3结构域的分离的多核苷酸。实施方案7是包含根据实施方案6所述的多核苷酸的载体。实施方案8是包含根据实施方案6所述的多核苷酸或根据实施方案7所述的载体的宿主细胞。实施方案9是产生根据实施方案1-5中任一项所述的fn3结构域的方法，包括在产生fn3结构域的条件下培养包含编码fn3结构域的核酸的宿主细胞，并从细胞或细胞培养物回收fn3结构域。实施方案10是包含根据实施方案1-5中任一项所述的fn3结构域以及药学上可接受的载体的药物组合物。实施方案11是检测生物样品中的bcma的方法，包括使生物样品与根据实施方案1-5中任一项所述的fn3结构域接触，并且检测特异性地结合bcma的fn3结构域，优选地fn3结构域是标记的。实施方案12是在对其有需要的受试者中治疗与bcma相关的疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的根据实施方案10所述的药物组合物。实施方案13是编码靶向bcma的嵌合抗原受体(car)的分离的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含：胞外结构域，具有特异性地结合bcma的fn3结构域；跨膜结构域；以及胞内信号结构域。实施方案14是根据实施方案13所述的分离的多核苷酸，其中所述fn3结构域特异性地结合bcma的胞外结构域，诸如人bcma的残基1至54之内的序列。实施方案15是根据实施方案13所述的分离的多核苷酸，其中fn3结构域包含与seqidno:1有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，并且fn3结构域以小于1×10-6m、5×10-7m、1×10-7m、5×10-8m、1×10-8m、5×10-9m、1×10-9m、5×10-10m、1×10-10m、5×10-11m、1×10-11m、5×10-12m、1×10-12m、5×10-13m或1×10-13m的kd结合bcma，优选地人bcma，如通过使用表面等离振子共振所测，例如通过使用生物传感器系统(例如proteon仪器(biorad))。实施方案16是根据实施方案13所述的分离的多核苷酸，其中fn3结构域包含与seqidno:7有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。实施方案17是根据实施方案13所述的分离的多核苷酸，其中fn3结构域包含与seqidno:8-44和58-145中的一者有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地包含seqidno:8-44和58-145中一者的氨基酸序列。实施方案18是根据实施方案13-18中任一项所述的分离的多核苷酸，其中car还包含使胞外结构域连接于跨膜结构域的铰链区；优选地，铰链区包含与seqidno:3有至少90％同一性的氨基酸序列；更优选地，铰链区包含seqidno:3的氨基酸序列。实施方案19是根据实施方案13-18中任一项所述的分离的多核苷酸，其中car还在氨基末端包含信号肽；优选地，信号肽包含与seqidno:2有至少90％同一性的氨基酸序列；更优选地，信号肽包含seqidno:2的氨基酸序列。实施方案20是根据实施方案13-19中任一项所述的分离的多核苷酸，其中跨膜结构域包含与seqidno:4有至少90％同一性的氨基酸序列；更优选地，跨膜结构域包含seqidno:4的氨基酸序列。实施方案21是根据实施方案13-20中任一项所述的分离的多核苷酸，其中胞内信号结构域包含源于以下的功能性信号结构域：cd3ζ、tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd16、cd22、cd27、cd28、cd30、cd79a、cd79b、cd134(也称为tnfrsf4或ox-40)、4-1bb(cd137)、cd278(也称为icos)、fcεri、dap10、dap12、itam结构域或cd66d等。实施方案22是根据实施方案13-21中任一项所述的分离的多核苷酸，其中胞内信号结构域包含初级信号结构域以及一个或多个共同刺激信号结构域。实施方案23是根据实施方案13-22中任一项所述的分离的多核苷酸，其中胞内信号结构域包含具有与seqidno:6有至少90％同一性的氨基酸序列的初级胞内信号结构域；更优选地，初级胞内信号结构域具有seqidno:6的氨基酸序列。实施方案24是根据实施方案13-23中任一项所述的分离的多核苷酸，其中胞内信号结构域包含具有与seqidno:5有至少90％同一性的氨基酸序列的共同刺激胞内信号结构域；更优选地，共同刺激胞内信号结构域具有seqidno:5的氨基酸序列。实施方案25是编码嵌合抗原受体(car)的分离的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含：信号肽，具有与seqidno:2有至少90％同一性的氨基酸序列；胞外结构域，包含具有与seqidno:1有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列的fn3结构域，并且fn3结构域以小于1×10-6m、5×10-7m、1×10-7m、5×10-8m、1×10-8m、5×10-9m、1×10-9m、5×10-10m、1×10-10m、5×10-11m、1×10-11m、5×10-12m、1×10-12m、5×10-13m或1×10-13m的kd结合bcma，优选地人bcma，如通过使用表面等离振子共振所测，例如通过使用生物传感器系统(例如proteon仪器(biorad))；铰链区，具有与seqidno:3有至少90％同一性的氨基酸序列；跨膜结构域，具有与seqidno:4有至少90％同一性的氨基酸序列；以及胞内信号结构域，包含具有与seqidno:5有至少90％同一性的氨基酸序列的共同刺激结构域以及具有与seqidno:6有至少90％同一性的氨基酸序列的初级信号结构域。实施方案26是编码嵌合抗原受体(car)的分离的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含：信号肽，具有与seqidno:2有至少90％同一性的氨基酸序列；包含fn3结构域的胞外结构域，所述fn3结构域具有与seqidno:7有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列，优选地fn3结构域包含seqidno:7的氨基酸序列，其中fn3特异性地结合bcma；铰链区，具有与seqidno:3有至少90％同一性的氨基酸序列；跨膜结构域，具有与seqidno:4有至少90％同一性的氨基酸序列；以及胞内信号结构域，包含具有与seqidno:5有至少90％同一性的氨基酸序列的共同刺激结构域以及具有与seqidno:6有至少90％同一性的氨基酸序列的初级信号结构域。实施方案27是编码嵌合抗原受体(car)的分离的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含：信号肽，具有与seqidno:2有至少90％同一性的氨基酸序列；胞外结构域，具有与seqidno:8-44和58-145中的一者有至少90％同一性的氨基酸序列的fn3结构域，其中fn3特异性地结合bcma；铰链区，具有与seqidno:3有至少90％同一性的氨基酸序列；跨膜结构域，具有与seqidno:4有至少90％同一性的氨基酸序列；以及胞内信号结构域，包含具有与seqidno:5有至少90％同一性的氨基酸序列的共同刺激结构域以及具有与seqidno:6有至少90％同一性的氨基酸序列的初级信号结构域。实施方案28是根据实施方案27所述的分离的多核苷酸，其中：信号肽具有seqidno:2的氨基酸序列；胞外结构域具有seqidno:8-44和58-145中一者的氨基酸序列；铰链区具有seqidno:3的氨基酸序列；跨膜结构域具有seqidno:4的氨基酸序列；以及胞内信号结构域包含seqidno:5的氨基酸序列以及seqidno:6的氨基酸序列。实施方案29是编码嵌合抗原受体(car)的分离的多核苷酸。实施方案30是根据实施方案13-29中任一项所述的多核苷酸的载体，优选地是包含可操作地连接至根据实施方案13-29中任一项所述的多核苷酸的启动子的表达载体。实施方案31是包含根据实施方案13-29中任一项所述的多核苷酸或根据实施方案30所述的载体的宿主细胞。实施方案32是根据实施方案31所述的宿主细胞的分离的细胞膜。实施方案33是制备分离的细胞膜的方法，包括：在产生car的条件下培养根据实施方案31所述的宿主细胞，并且从宿主细胞分离细胞膜。实施方案34是包含根据实施方案13-29中任一项所述的多核苷酸或根据实施方案30所述的载体的工程化免疫细胞，其中根据实施方案13-29中任一项所述的多核苷酸可操作地连接至启动子。实施方案35是根据实施方案34所述的工程化免疫细胞，其中免疫细胞是工程化t细胞受体敲除免疫细胞。实施方案36是根据实施方案34或35所述的工程化免疫细胞，其中免疫细胞还表达具有特异性地结合不同于bcma的第二靶标的胞外结构域的第二car。实施方案37是根据实施方案36所述的工程化免疫细胞，其中第二靶标是与多发性骨髓瘤相关的靶标，诸如cd19、cd20、cs-1、k轻链、cd138、lewisy抗原、cd38等。实施方案38是根据实施方案36所述的工程化免疫细胞，其中第二靶标是表达于正常细胞而非癌细胞上的靶标，并且第二car包含具有抑制性受体信号结构域的胞内结构域。实施方案39是根据实施方案34-38中任一项所述的工程化免疫细胞，其中细胞对至少一种抗癌症化学疗法有抗性。实施方案40是根据实施方案39所述的工程化免疫细胞，其中细胞还表达一种或多种药物抗性基因，诸如选自二氢叶酸还原酶(dhfr)、肌苷-5'-单磷酸脱氢酶ii(impdh2)的突变或修饰形式、多药物抗性蛋白1(mdr1)、钙调磷酸酶、甲基鸟嘌呤转移酶(mgmt)、微rna-21、抗生素抗性基因ble和mcra等。实施方案41是根据实施方案39所述的工程化免疫细胞，其中细胞还表达负责细胞对药物的敏感性的一种或多种失活基因，诸如选自cd52、糖皮质激素受体、cd3、人次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)、人脱氧胞苷激酶(dck)等的失活基因。实施方案42是包含根据实施方案34-41中任一项所述的工程化免疫细胞以及药学上可接受的载体的药物组合物。实施方案43是在对其有需要的受试者中治疗b细胞相关病症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的根据实施方案42所述的药物组合物。实施方案44是根据实施方案43所述的方法，其中b细胞相关病症是癌症或恶性肿瘤、或癌症前期病症，选自脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征或白血病前期中的一种或多种。实施方案45是根据实施方案43所述的方法，其中b细胞相关病症是选自b细胞急性淋巴细胞白血病(ball)、t细胞急性淋巴细胞白血病(tall)、急性淋巴细胞白血病(all)中的一种或多种的急性白血病；慢性髓细胞性白血病(cml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)；b细胞幼稚淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴增殖疾病、malt淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞瘤、华氏巨球蛋白血症；前列腺癌、胰腺癌、肺癌；或浆细胞增殖性障碍、未明确诊断意义的单克隆丙种球蛋白病(mgus)、沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症、浆细胞瘤、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变性、以及poems综合征，或它们的组合。实施方案46是根据实施方案45所述的方法，其中b细胞相关病症是多发性骨髓瘤，诸如选自以下的多发性骨髓瘤：显性多发性骨髓瘤、郁积型多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、非分泌型骨髓瘤、igd骨髓瘤、骨硬化骨髓瘤、骨孤立性浆细胞瘤、以及髓外浆细胞瘤，或它们的组合。实施方案47根据实施方案43至46所述的方法，还包括向受试者施用另一种治疗，诸如化学疗法、淋巴细胞清除疗法、放射疗法、另一种免疫-肿瘤药物、靶向疗法、或另一种抗癌药物。实施方案48是使免疫细胞工程化的方法，包括：(a)提供免疫细胞；并且(b)将根据实施方案13-29中任一项所述的多核苷酸或根据实施方案30所述的载体引入该细胞中。实施方案49是制备药物组合物的方法，包括使根据实施方案34-41中任一项所述的工程化免疫细胞与药学上可接受的载体组合，以获得药物组合物。实施方案50是根据实施方案13-29任一项所述的多核苷酸、根据实施方案30所述的载体、根据实施方案34-41中任一项所述的工程化免疫细胞、或根据实施方案42所述的药物组合物用于制造在对其有需要的受试者中治疗b细胞相关病症的药物的用途，优选地，b细胞相关病症是多发性骨髓瘤。实施方案51是用于在对其有需要的受试者中治疗b细胞相关病症的根据实施方案13-29中任一项所述的多核苷酸、根据实施方案30所述的载体、根据实施方案34-41中任一项所述的工程化免疫细胞、或根据实施方案42所述的药物组合物，优选地，b细胞相关病症是多发性骨髓瘤。实施例本发明的以下实施例旨在进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求书确定。实施例1——通过cis展示针对重组bcma蛋白质淘选fn3结构域文库用于bcma重组蛋白靶抗原的两种构建体购自abbiosiences。一种为单独的bcma蛋白质(目录#p011xp)，并且另一种为融合于小鼠igg2a的fc结构域的bcma(目录#p001f)。fn3结构域cis-展示文库选择cis展示用于选择tcl18、tcl19、tcl21、tcl23和tcl24文库的bcma结合fn3结构域。tcl19、tcl21和tcl23tencon文库(seqidno:46)在c和f链之内以及cd和fg环之内的位置处随机化，这些位置出现的氨基酸分布如表2所示。tcl19和tcl21被设计为在每个位置处包括18个天然氨基酸的平均分布(每个位置5.55％)，仅排除半胱氨酸和甲硫氨酸。tcl23被设计成使得每个随机化位置接近在功能性抗体的cdr-h3环中发现的氨基酸分布(birtalan等人，jmolbiol2008年4月11日；377(5):1518-28)，半胱氨酸和甲硫氨酸排除在外。tcl24tencon文库(seqidno:47)被设计成相比于文库tcl19、tcl21和tcl23而言包括四个附加的随机化tencon位置。这些位置包括来自d链的n46和t48以及来自g链的s84和i86。选择这些位置，因为这些残基的侧链是从d和gβ-链暴露的表面，并且它们在结构上与c和f链的随机化部分相邻，因此增加了可与目标蛋白结合的表面积。tcl24的每个位置处所用的氨基酸分布与表2中所述的tcl19和tcl21的氨基酸分布相同。表2tcl18tencon文库(seqidno:48)在bc和fg环之内随机化，并且其包括6至9个残基的随机化bc环长度以及7至12个残基的随机化fg环长度的组合。对于体外转录和翻译(itt)，将3μg的文库dna与0.1mm完全氨基酸、1×s30预混合组分和15μl的s30提取物(promega)以50μl的总体积一起温育并在30℃下温育。1小时后，加入375μl的封闭溶液(1×tbs，ph7.4，2％bsa，100μg/ml鲱鱼精dna)，并将反应在冰上温育15分钟。itt反应采用融合于小鼠igg2a的fc结构域的生物素酰化重组bcma蛋白质(abbiosciences，目录#p011f)进行温育。实施4um小鼠igg2a(cnto1037)的竞争性结合测定，以富集特异性地结合bcma而非小鼠fc的fn3结构域。生物素酰化重组蛋白和结合的文库成员被捕获在亲和素或链霉亲和素包被的磁珠上。通过用tbst和tbs连续洗涤，去除未结合的文库成员。洗涤之后，通过加热至85℃并保持10分钟，从目标蛋白中洗脱dna，并通过pcr扩增以便进一步多轮淘选。通过在每轮期间将靶bcma-mfc蛋白质的浓度从400nm连续降低到100nm以及增加洗涤严格性来分离高亲和力结合物。执行连续五轮选择。解除率选择使来自第五轮选择的输出经受四轮解除率选择。将itt反应采用融合于小鼠igg2a的fc的生物素酰化重组bcma胞外结构域蛋白质进行温育。生物素酰化靶蛋白的浓度从前两轮的25nm相继下降至最后两轮的2.5nm，以选择fn3结构域与靶蛋白的亲和力增大的fn3结构域。实施2.5um小鼠igg2a(cnto1037)的竞争性结合测定，以富集特异性地结合bcma而非小鼠fc的fn3结构域。生物素酰化靶蛋白和结合的文库成员被捕获在亲和素或链霉亲和素包被的磁珠上，并用tbst充分洗涤。随后，将结合的复合物用5um冷重组bcma-mfc蛋白质洗涤1小时，并相继地用tbst和tbs洗涤，然后洗脱dna，以选择具有较低解离速率的fn3结构域。5轮淘选的克隆将淘选的输出注入-克隆到pet15b载体中并转化到bl21(de3)gold感受态细胞中。使用自动菌落挑选器挑选出单个菌落并且在2ml96孔板的luria肉汤+100ug/ml氨苄青霉素中生长6小时。细菌生长物用于接种terrific肉汤+100ug/ml氨苄青霉素+自诱导培养基中的培养物。在24小时之后，使细菌经离心法沉淀并用bugbusterht+0.2mg/ml溶菌酶(sigma)裂解。5轮淘选的筛选将nuncmaxisorp板用溶于pbs的5ug/ml中和亲和素以100ul/孔包被过夜。次日，将平板用biotek平板洗涤器(3x300ultbst)洗涤，并用startingblockt20(thermo)封闭1小时。将平板用3x300ultbst洗涤。使抗原(1ug/mlbt-bcma，1ug/mlbt-bcma-mfc，或5ug/mlcnto1037对照)在每孔100ul的startingblockt20中包被1小时。制备新鲜的细菌溶解物并以1:5稀释度添加至elisa板中维持1小时。随后将平板再洗涤一次，并添加1:5000稀释度的100ul抗tencon25抗体pab25-hrp维持1小时以上。将平板洗涤最后一次，并将50ul的pod底物(roche)以1:100稀释度添加至各平板(每次一个)，然后在spectramaxm5读板机上读取发光。在3dx中分析信号(s)与背景(b)之比，并且弃去具有小于10倍s/b和小于50,000的相对发光单位(rlu)的克隆。使用不具有fc标记的bt-bcma抗原鉴定出总共7个命中，而使用bt-bcma-mfc鉴定出281个命中。在序列分析之后，鉴定出142种独特的序列。9轮淘选的克隆将淘选的输出注入-克隆到pd444-ch载体中并转化到bl21(de3)gold感受态细胞中。使用自动菌落挑选器挑选出单个菌落并且在2ml96孔板的luria肉汤+100ug/ml氨苄青霉素中生长6小时。细菌生长物用于接种terrific肉汤+100ug/ml氨苄青霉素+自诱导培养基中的培养物。在24小时之后，使细菌经离心法沉淀并用bugbusterht+0.2mg/ml溶菌酶(sigma)裂解。290盘9轮淘选的筛选使用以上对r5所述的方法来筛选输出，不同的是使用10,000倍的溶解物稀释，并且仅使用bt-bcma-mfc(1ug/ml)和bt-cnto1037(2ug/ml)抗原。弃去该稀释度下具有小于10倍s/b的克隆。鉴定出总共145个命中并测序。在序列分析之后，鉴定出77种独特的序列(参见例如seqidno:8-44和58-145)。实施例2——结合瞬时表达人bcma的hek293f细胞的bcma特异性fn3结构域的筛选对hbcma表达型hek293f和模拟hek293f细胞测量细胞计数和细胞活力，并且将25×106个每种细胞类型以175g旋转沉淀5min。抽吸培养基并用25mlfacs缓冲液替换。将每种细胞类型以100,000个细胞接种到两个v底96孔板的各孔中，在整个实验中使平板保持于冰上。样品如下设定：hbcma细胞；2um治疗hbcma细胞；0.2um治疗模拟细胞；2um治疗模拟细胞；0.2um治疗阳性和阴性抗体对照包括在内。将12.5ul的对照抗体添加至238.5ulfacs缓冲液，以实现5ul抗体(2.5ug)/100ul处理体积。缓冲液对照也包括在内。缓冲液对照孔仅包含250ulfacs缓冲液。将平板以1200rpm在4℃下离心5min，以沉淀细胞。通过倒置平板弃去缓冲液，并将100ul的经稀释fn3结构域或对照添加至细胞并通过移液管混合。倒置平板之后有一些残余液体保留在孔中，但量在孔间相当一致。该平板在冰上温育1小时。然后，从一个“模拟；2um治疗”平板的4个孔收集细胞，以使用台盼蓝在vi-cell系统上检查细胞计数和活力。细胞计数为约75,000/孔，活力>90％。在1小时之后，将平板以1200rpm在4℃下离心5min，以沉淀细胞。通过倒置平板弃去缓冲液，并将100ulfacs缓冲液添加至孔。将facs缓冲液洗涤重复两次以上。将平板以1200rpm在4℃下离心5min以沉淀细胞，并通过倒置平板弃去缓冲液。将含50ul二抗的facs缓冲液添加至孔。将抗hismab以1/100稀释度添加至所有的孔，除了抗小鼠mab以1/1000稀释度添加到其中的二抗对照孔，或缓冲液对照孔之外。该平板在冰上温育1小时。然后，从一个“模拟；2um治疗”平板的4个孔收集细胞，以使用台盼蓝在vi-cell系统上检查细胞计数和活力。细胞计数为约67,000/孔，活力为96％。在1小时之后，将平板以1200rpm在4℃下离心5min，以沉淀细胞。通过倒置平板弃去缓冲液，并将100ulfacs缓冲液添加至孔。将facs缓冲液洗涤重复两次以上。将平板以1200rpm在4℃下离心5min以沉淀细胞，并通过倒置平板弃去缓冲液。使细胞重悬于30ulintellicyt缓冲液(facs缓冲液，0.1％普流罗尼酸、1mmedta，1:1000稀释度的sytox红活/死染色剂)中并充分混合以破碎团块。将平板保持在冰上并在intellicyt读板机上读取。按以下次序分选细胞：(a)细胞，(b)单细胞，(c)活细胞。计算alexa488通道的几何平均值，并且计算活细胞的百分比。将数据收集在表中，hbcma/mockalexa488信号的比率用作参考终点。基于数据，选择14种bcma特异性fn3结构域以供进一步分析。实施例3——抗bcmafn3结构域结合瞬时表达人bcma的hek293f细胞的剂量反应曲线(drc)的评估用bdfacs缓冲液滴定十种fn3结构域的3倍稀释液，起始浓度为5um。用facs缓冲液稀释对照样品。以单点剂量滴定的各自具有7种fn3结构域的源平板与非特异性tencon25对照平行产生，以覆盖到瞬时表达人bcma的hek293f细胞上。测定对照包括：各平板上的tencon25剂量反应曲线系列，以测量非特异性结合；用抗hisalexa-488染色的未经处理的细胞，以测量非特异性标记；未用抗his抗体染色的未经处理的细胞，以测量绝对背景；1um的fn3结构域的阳性对照(称为“g10”)用作参考，以控制板与板的信号强度波动；以及活力测试孔，以故障诊断明显较低的活力。对hbcma表达型hek293f细胞测量细胞计数和细胞活力，并将45×106个hbcma表达型细胞以175g旋转沉淀5min。抽吸培养基并用25mlfacs缓冲液替换。将100,000个细胞接种到四个v底96孔板的各孔中，在整个实验中使平板保持于冰上。使不用于铺板的5×106个细胞保持在冰上，以供后续比较活力测试。将平板以1200rpm在4℃下离心5min，以沉淀细胞。通过倒置平板弃去缓冲液，并将60ul的经稀释fn3结构域或对照添加至细胞并通过涡旋平板轻轻混合。该平板在冰上温育1小时。在1小时之后，将平板以1200rpm在4℃下离心5min，以沉淀细胞。通过倒置平板弃去缓冲液，并将100ulfacs缓冲液添加至孔。将facs缓冲液洗涤重复两次以上。将平板以1200rpm在4℃下离心5min以沉淀细胞，并通过倒置平板弃去缓冲液。通过涡旋平板轻轻混合细胞。将含50ul二抗的facs缓冲液添加至孔。将抗hismab以1/100稀释度添加至所有的孔，除了仅facs缓冲液的阴性对照孔之外。该平板在冰上温育1小时。然后，从所有四个平板的两个孔收集细胞并且合并，以使用台盼蓝在vi-cell系统上检查细胞计数和活力。细胞计数为约67,500/孔，活力为96.6％。保持于冰上以供比较的对照细胞的细胞计数为1×106个/ml(95.1％活力)。在染色1小时之后，将平板以1200rpm在4℃下旋转5min，以沉淀细胞。通过倒置平板弃去缓冲液，并将100ulfacs缓冲液添加至孔。将facs缓冲液洗涤重复两次以上。将平板以1200rpm在4℃下离心5min以沉淀细胞，并通过倒置平板弃去缓冲液。使细胞重悬于30ulintellicyt缓冲液(facs缓冲液，0.1％普流罗尼酸、1mmedta，1:1000稀释度的sytox红活/死染色剂)中并通过涡旋平板轻轻混合。将平板保持在冰上并在intellicyt读板机上读取。按以下次序分选细胞：(a)细胞，(b)单细胞，(c)活细胞。计算alexa488通道的几何平均值，并且计算活单细胞的百分比。经归一化和校准的数据结果示于图2(prism曲线拟合分析，使用结合饱和、单位点特异性结合曲线-拟合程序)和表3，其示出bmax和用prism软件计算的解离常数(kd)。表3实施例4——包含bcma特异性fn3结构域的car的产生二十三种bcma特异性fn3结构域(seqidno:8-19和58-68)选自待工程化成根据图1所示的结构域结构的car构建体的125种列表(seqidno:8-44和58-145)。靶向bcma的car构建体的组分的氨基酸序列示于表4中。表4合成各个靶向bcma的car基因的引物以进行dsdnapcr模板扩增，包括用于mrna合成的5’t7启动子。使用市售的mmessaget7ultra转录试剂盒产生靶向bcma的carmrna。实施例5——表达靶向bcma的car的工程化免疫细胞的产生和分析使用ecm830方波电穿孔系统(btx)，将mrna电穿孔到源于正常人血液(正常献血服务——tsri)的pant细胞中。在采用或不采用10ug的靶向bcma的carmrna情况下，根据制造商规程，使5×106个pant细胞接受单电脉冲(500v，750us)。24小时后使用多克隆抗fn3结构域ab评估car的表面表达。结果示于图3中。然后，在铬释放细胞毒性测定中评估靶向bcma的car细胞。效应物是靶向bcma的car-表达t细胞、scfv-表达t细胞、cd19car-t细胞和野生型t细胞。t细胞用对应的mrna进行电穿孔，并且实现约90％的表面表达。所用靶细胞是u2932(cd19+/bcma+b细胞淋巴瘤细胞系)、h929(cd19–/bcma+浆细胞瘤骨髓瘤细胞系)、以及k562(cd19–/bcma–慢性粒细胞白血病细胞系)。在37℃下，使靶标负载每10×106个肿瘤靶细胞100ucicr-51维持1小时，随后洗涤3次。然后，将10,000个靶细胞以工程化效应t细胞与肿瘤靶标(e:t)的指定比率温育约13-14小时。“最大释放”样品是用triton-x温育的靶标；“无t细胞，自发释放”样品是单独的靶标。将计数采集60秒，并将测定一式三份设置。细胞毒性％的计算如下：细胞毒性％＝(实验cpm–自发释放cpm)×100％/(最大释放cpm–自发释放cpm)分析如图4-7所示的数据并在prism作图，并且显示为细胞毒性％平均值+/-sem。结果示出原代t细胞上含有fn3结构域的car的表达可诱导taa特异性细胞杀伤。尽管本发明结合其具体实施方案进行了详细描述，但对于本领域普通技术人员来说将显而易见的是，可以在不脱离本发明的实质和范围的情况下进行各种变化和修改。参考文献ausubel等人编辑，1994,currentprotocolsinmolecularbiology，第1卷，johnwiley&sons,inc.,newyorkbarnes等人，anal.biochem.102:255(1980)bellucci等人，blood.2005年5月15日；105(10):3945-50birtalan等人，jmolbiol.2008年4月11日；377(5):1518-28bork和doolittle,pnasusa89:8990-8992,1992connell,curropinbiotechnol.2001(5):446-9coquery和erickson,critrevimmunol.2012；32(4):287-305curran和brentjens,jclinoncol.2015年5月20日；33(15):1703-6dai等人，jnatlcancerinst.2016年1月27日；108(7)ham等人，meth.enz.58:44(1979)hanes和pluckthun,pnasusa,94,4937-4942,1997jacobs等人，proteinengineering,design,andselection,25:107-117,2012lehmann和wyss,curropinbiotechnol,12,371-375,2001makrides等人microbiolrev.199660(3):512-38maus等人，blood.2014年4月24日；123(17):2625-35mayfield等人，pnasusa.2003100(2):438-42meinke等人，jbacteriol175:1910-1918,1993moreaux等人，blood.2004年4月15日；103(8):3148-57naymagon和abdul-hay,jhematoloncol.2016年6月30日；9(1):52neri等人，clincancerres.2007年10月1日；13(19):5903-9novak等人，blood.2004年1月15日；103(2):689-94odegrip等人，pnasusa101,2806-2810,2004patel等人，genetherapy,1999；6:412-419roberts和szostak,pnasusa,94,12297-12302,1997sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual，第1-3卷，coldspringharborlaboratorypress，第2版，1989sharp等人yeast.19917(7):657-78.sinclair等人《蛋白表达与纯化杂志》2002(1):96-105solidphasepeptidesynthesis，第2版，1984,thepiercechemicalco.,rockford,ilwatanabe等人，jbiolchem265:15659-15665,1990当前第1页12