用于促进免疫细胞功能的组合物和方法与流程

本申请要求2016年6月13日提交的美国申请序列号62/349,473的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文。
背景技术：
：免疫细胞疗法，例如过继细胞疗法(act)，包括从对象收集免疫细胞，扩增细胞，以及将细胞重新引入同一对象或不同对象的步骤。例如，供体衍生的，体外扩增的人细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的act已经成为有希望的癌症治疗方法。act的示例包括培养的肿瘤浸润淋巴细胞(til)，分离和扩增的t细胞克隆，以及表达常规t细胞受体或嵌合抗原受体的基因工程淋巴细胞(例如t细胞)。基因工程淋巴细胞被设计用于消除表达特定抗原的癌细胞并扩增并递送给患者。act可以提供肿瘤特异性淋巴细胞(例如，t细胞)，其导致患者中肿瘤细胞的减少。基于免疫细胞的疗法的一个重要限制是离体免疫细胞的活力和功能的快速下降，特别是在冷冻-解冻处理后。现有的免疫细胞分离，储存，冷冻，解冻和/或扩增方案的局限性仍然存在。因此，需要保存，例如，优化来自对象的免疫细胞的功能，例如，在重新引入相同或不同的对象之前。技术实现要素：本公开内容至少部分的特征在于产生(例如，离体)有核细胞(例如，免疫细胞)的优化方法和组合物，该细胞具有至少一种保留的功能(例如，保留一种或多种存活，增殖，细胞毒活性或活化)。在一些实施方式中，本文公开了用于保留有核细胞的细胞功能(例如，免疫细胞功能)的方法，例如，在一个或多个冷冻和/或解冻循环后。在实施方式中，本文公开了通过使有核细胞(例如免疫细胞)与包含保留剂(conservationagent)的颗粒(例如纳米颗粒)，例如，包含蛋白质的纳米颗粒(例如，如本文所述的蛋白质纳米凝胶)接触来制备和/或解冻有核细胞的冷冻组合物的方法。在一些实施方式中，接触步骤在体外发生。在某些实施方式中，免疫细胞是从对象获得的免疫细胞群。在实施方式中，纳米颗粒中的所述蛋白质可以选自一种或多种(例如，2，3，4，5种或更多种)治疗性蛋白质，例如细胞因子分子(例如，il-2，il-7，il-12，il-15，il-18，il-21，il-23，il-4，il-1α，il-1β，il-5，ifnγ，tnfα(tnfa)，ifnα，ifnβ，gm-csf，或gcsf，包括其变体形式，例如突变体；包含细胞因子分子与多肽的复合物，例如细胞因子受体复合物；其融合或激动剂形式)；生长因子；和其他分子，例如，抗共刺激分子的抗体分子或激动剂配体，例如，其中共刺激分子选自ox40，cd28，gitr，vista，cd40，cd3，或cd137的激动剂。在实施方式中，保留剂，例如，治疗性蛋白质例如通过可降解的接头(例如二硫键接头)与纳米颗粒共价偶联(例如交联)。在一些实施方式中，保留剂保持生物活性，例如，在至少一次冻融循环后从纳米颗粒中释放后保持其作为保留剂的功能。与未处理的有核细胞相比，纳米颗粒处理的有核细胞在冻融循环后可显示出显著增加的功能，例如活力，增殖，细胞毒活性或活化中的一种或多种。因此，本文公开的方法和组合物可为细胞疗法(例如免疫疗法)提供显著益处。因此，在一个方面，本发明的特征在于包含有核细胞和纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含至少一种保留剂，例如本文所述的保留剂(在本文中也称为“有核细胞-纳米颗粒复合物”)。在一些方面，本公开内容提供了包含有核细胞和至少一种保留剂，例如本文所述的保留剂的组合物。在一个实施方式中，至少部分组合物是冷冻的。在其他方面，本公开提供了制备有核细胞的冷冻组合物的方法。该方法包括：a)提供本文所述的未冷冻的有核细胞组合物，例如，包含有核细胞和包含至少一种保留剂，例如本文所述的保留剂的纳米颗粒的有核细胞组合物，和b)降低组合物的温度足以使组合物冷冻，从而冷冻有核细胞组合物。在一些方面，本公开内容提供了制备解冻的有核细胞组合物的方法，其包括：a)提供包含有核细胞和纳米颗粒的有核细胞冷冻组合物，所述纳米颗粒包含至少一种保留剂，例如，本文所述的保留剂；和b)充分加热有核细胞冷冻组合物以解冻有核细胞冷冻组合物，从而制备解冻的有核细胞组合物。在其他方面，本公开内容提供了组合物，其包含：a)保留剂，例如本文所述的il-15复合物，和b)平均长度为10-150，20-100，20-80，20-60，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸，和c)任选地还包含peg分子，例如分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg分子。在一些实施方式中，聚赖氨酸和peg形成嵌段共聚物。在一些实施方式中，聚赖氨酸偶联，例如，共价偶联或非共价偶联(例如通过静电)至保留剂。在一些实施方式中，保留剂形成蛋白质纳米凝胶。在一些方面，本公开内容提供了包含有核细胞和纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含至少一种保留剂，其中：(a)至少部分组合物是冷冻的，(b)保留剂包括细胞因子分子或共刺激分子，和(c)其中：(i)细胞因子分子选自il15，il2，il6，il7，il12，il17，il18，il21，il-23，il-4，il1α，il1β，il-5，ifnγ，tnfα，ifnα，ifnβ，gm-csf，或gcsf；或(ii)共刺激分子选自cd137的激动剂，ox40，cd28，gitr，vista，cd40，或cd3。在实施方式中，在组合物解冻时，与不存在纳米颗粒的有核细胞相比，保留剂改善了有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化中的一种或多种。在一些方面，本公开内容提供了包含有核细胞和纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含至少一种保留剂，其中：(a)至少部分组合物是冷冻的；和(b)保留剂包含与多肽复合的il-15分子，所述多肽包含：第一结构域，所述第一结构域包含seqidno：7或seqidno：8的氨基酸序列，或与其具有至少85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列；和任选的第二异源结构域，包含抗体分子或fc结构域。在实施方式中，在组合物解冻时，与不存在纳米颗粒的有核细胞相比，保留剂改善了有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化中的一种或多种。在实施方式中，fc结构域是野生型或突变的。在实施方式中，fc结构域包含seqidno：11或seqidno：12的氨基酸序列。在一些方面，本公开内容提供了包含多肽的纳米颗粒，所述多肽包含il-15受体或其片段，包含寿司(sushi)结构域(例如，seqidno：7或seqidno：8)，和第二异源结构域，所述第二异源结构域包含：效应-减毒的fc结构域，例如人igg2fc结构域，例如seqidno：11的人igg2结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列。以下方面和实施方式可与本文的任何方面和实施方式组合，包括上述方法和组合物。在实施方式中，保留剂是用于维持有核细胞活力，增殖，细胞毒活性或活化的刺激分子。在实施方式中，保留剂是免疫刺激细胞因子；例如，属于共同γ链或四个α-螺旋束家族的细胞因子。在实施方式中，组合物(例如纳米颗粒和/或保留剂)包含il-15复合物，所述il-15复合物包含il-15分子，所述il-15分子与多肽，例如，il-15受体或其il-15结合片段(例如，共价或非共价)复合。在一个实施方式中，多肽包含il-15受体α或il-15结合片段，例如，其il-15结合结构域。在一个实施方式中，多肽包含il-15受体α的细胞外结构域。在一个实施方式中，多肽包含seqidno：2的氨基酸序列(全长野生型il-15受体α)或其il-15结合片段；或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列。在其他实施方式中，多肽包含seqidno：3的氨基酸序列(野生型il-15受体α的细胞外结构域(ecd))或其il-15结合片段；或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列。在其他实施方式中，多肽包含seqidno：4的氨基酸序列(il-15受体α同种型cra_d的ecd)或其il-15结合片段；或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，多肽包含：第一结构域，其包含seqidno：2，seqidno：3或seqidno：4的氨基酸序列，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列；和任选地，第二异源结构域，例如免疫球蛋白fc结构域或抗体分子，例如免疫球蛋白fab或scfv片段，fab片段，fab2片段，或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段，单结构域抗体，双特异性或多特异性抗体。在一个实施方式中，第二异源结构域是fc结构域或fab。在另一个实施方式中，多肽包含：第一结构域，所述第一结构域包含seqidno：7或seqidno：8的氨基酸序列，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列；和任选地，第二异源结构域，例如免疫球蛋白fc结构域或抗体分子，例如免疫球蛋白fab或scfv片段，fab片段，fab2片段，或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段，单结构域抗体，双特异性或多特异性抗体。在一个实施方式中，第二异源结构域是fc结构域或fab。在实施方式中，组合物(例如纳米颗粒和/或保留剂)包含il-15复合物，所述il-15复合物包含il-15分子，所述il-15分子与包括il-15受体或其il-15结合片段的多肽(例如，共价或非共价)复合。在实施方式中，il-15分子包括il-15突变体，例如具有一个或多个氨基酸取代的人il-15多肽。在一些实施方式中，il-15分子在72位包含取代，例如n向d的取代。在一个实施方式中，il-15分子是seqidno：6的il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％的相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性。在实施方式中，包含il-15受体或其片段的多肽包含seqidno：5的寿司-fc多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性。在一些方面，包含il-15受体或其片段的多肽包含寿司结构域(例如，seqidno：7或seqidno：8)和第二异源结构域，其包含：效应-减毒的fc结构域，例如人igg2fc结构域，例如seqidno：11的人igg2结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列。在实施方式中，所述组合物还包含缓冲剂。在实施方式中，所述组合物还包含水性介质。在实施方式中，在冷冻组合物解冻后，保留剂例如il-15复合物促进，例如，保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化。在实施方式中，促进活力包括与没有纳米颗粒的其他类似的有核细胞相比，将活力提高至少1％，2％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，4倍或5倍，例如，通过用吖啶橙和碘化丙锭染色测量，例如通过实施例32的试验测量。在实施方式中，促进增殖包括与没有纳米颗粒的其他类似的有核细胞相比，将增殖提高至少1％，2％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，4倍或5倍，例如，通过在第一和第二时间点计数活细胞来测量，例如通过实施例33的试验来测量。在实施方式中，促进细胞毒活性包括与没有纳米颗粒的其他类似的有核细胞相比，将细胞毒活性提高至少1％，2％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，4倍或5倍，例如，在针对癌细胞系(例如道迪细胞)的细胞毒活性的试验中，例如实施例28的试验中。在实施方式中，促进活化包括与没有纳米颗粒的其他类似的有核细胞相比，将活化提高至少1％，2％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，2倍，3倍，4倍或5倍，例如，在使用针对cd45ra的抗体的流式细胞术测定中，例如实施例26的测定中。在实施方式中，保留剂，例如il-15复合物，从纳米颗粒中释放。在实施方式中，在解冻时，与参照物(例如包含有核细胞但缺少纳米颗粒的其他类似组合物)相比，促进(例如保留或增强)有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化。在实施方式中，在冷冻组合物解冻时，保留剂促进，例如，保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化。在实施方式中，促进干扰素γ产生。在实施方式中，通过干扰素γ产生来测量活化。在一些实施方式中，促进有核细胞的活力、增殖、细胞毒活性、活化或干扰素γ产生中的一种，两种，三种，四种或更多种。在实施方式中，组合物包含刺激和维持细胞活力和增殖的化合物。在实施方式中，组合物包含在冷冻和解冻期间保护细胞的化合物。在实施方式中，组合物包含第二保留剂，例如本文所述的保留剂。在实施方式中，保留剂从纳米颗粒的释放发生在1小时至3周，例如1小时至24小时，1天至3天，4天至6天，1周至2周，或2周至3周期间。在实施方式中，纳米颗粒与有核细胞的表面关联，从而形成有核细胞-纳米颗粒复合物。在实施方式中，有核细胞包括免疫细胞，例如免疫效应细胞(例如，选自淋巴细胞，t细胞，b细胞或自然杀伤细胞的免疫细胞)或造血干细胞。在实施方式中，有核细胞包括淋巴细胞。在实施方式中，有核细胞包括t细胞。在实施方式中，有核细胞包含b细胞。在实施方式中，有核细胞包括自然杀伤(nk)细胞。在实施方式中，有核细胞包括造血干细胞。在一些实施方式中，有核细胞是免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞)，其包含(例如表达)嵌合抗原受体(car)，例如结合癌抗原的car。在其他实施方式中，有核细胞表达外源高亲和力fc受体。在实施方式中，有核细胞是从患者(例如患者的血液)获得的免疫细胞，例如nk细胞。在其他实施方式中，有核细胞是从健康供体获得的免疫细胞，例如nk细胞。例如，它是缺乏同种异体t细胞的nk细胞群。在实施方式中，有核细胞是来自胚胎干细胞和/或ipsc细胞的免疫细胞，例如nk细胞。在一些实施方式中，有核细胞是细胞系，例如稳定的或永生化的细胞系(例如，nk细胞永生化细胞系)。在一些实施方式中，有核细胞获自患者，例如患有血液癌症，例如白血病或淋巴瘤的患者。在实施方式中，有核细胞是nk细胞系，例如选自nk-92(例如，atcc目录号crl-2407)，nk-ys，khyg-1，nkl，nkg，snk-6，imc-1的nk细胞系，例如，如klingemann，h.等，(2016)frontiersinimmunology卷7(文章91)：1-7所述，在此通过引用纳入。在一个实施方式中，有核细胞是nk92细胞系，例如表达高亲和力fc受体的变体nk92细胞，例如表达fcγriiia的细胞(例如158v)。在其他实施方式中，nk92细胞系包含结合癌抗原的car，例如，也如上文klingemann等所述。在实施方式中，纳米颗粒通过对有核细胞的静电吸引与细胞表面关联。在实施方式中，纳米颗粒包含至少一种配体，其中配体对有核细胞表面上的蛋白质，碳水化合物或脂质具有亲和性。在实施方式中，纳米颗粒共价偶联至，例如，有核细胞的表面。在实施方式中，纳米颗粒不与有核细胞共价偶联。在实施方式中，纳米颗粒包括脂质体，蛋白质纳米凝胶，核苷酸纳米凝胶，聚合物纳米颗粒或固体纳米颗粒。在实施方式中，纳米颗粒包括脂质体。在实施方式中，纳米颗粒包括蛋白质纳米凝胶。在一些实施方式中，纳米颗粒是由多种彼此共价连接的保留剂形成的蛋白质纳米凝胶。在实施方式中，纳米颗粒在纳米颗粒表面上包含至少一种聚合物，阳离子聚合物或阳离子嵌段共聚物。在一些实施方式中，阳离子聚合物包含聚赖氨酸，例如polyk30或polyk200。在一些实施方式中，聚赖氨酸是聚-l-赖氨酸。在实施方式中，聚赖氨酸的平均长度为20-30，30-40，40-50，50-100，100-150，150-200，200-250，250-300，300-400或400-500个氨基酸。在实施方式中，聚赖氨酸的平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸。在实施方式中，聚赖氨酸的平均长度为100-300，150-250或约200个氨基酸。在一些实施方式中，聚赖氨酸的平均长度为10-150，20-100，20-80，20-60，20-40或约30个氨基酸。在实施方式中，纳米颗粒包括聚乙二醇(peg)。在实施方式中，peg具有1-2，2-3，3-4，4-5，5-6，6-7，7-8，8-9或9-10kd的分子量。在实施方式中，peg具有约1-10，2-8，4-6或约5kd的分子量。在一些实施方式中，纳米颗粒包含含有peg的阳离子嵌段共聚物(例如，如本文所述的peg，例如，分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg)和聚赖氨酸(例如，如本文所述的聚赖氨酸，例如平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；或平均长度为100-300，150-250或约200个氨基酸的聚赖氨酸)。在实施方式中，阳离子嵌段共聚物包括peg5k-polyk30或peg5k-polyk200。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：6的il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：5的寿司-fc多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：1的il-15多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；寿司-fc多肽，包含seqidno：7或seqidno：8的寿司结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性，和seqidno：11的fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性的氨基酸序列；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：6的il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：15的寿司-fc2da多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：1的il-15多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：15的寿司-fc2da多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在实施方式中，组合物包含(例如，在溶液中或与纳米颗粒关联，例如，与纳米颗粒共价偶联，例如，作为保留剂的一部分)化合物，其使纳米颗粒稳定在溶液中或细胞表面上和/或增加纳米颗粒与有核细胞表面之间的相互作用。在实施方式中，化合物选自鱼精蛋白，壳聚糖，碳水化合物，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，天然聚合物，多糖，葡聚糖多聚物(dextramer)，纤维素，纤连蛋白，胶原，纤维蛋白或蛋白多糖。在实施方式中，组合物包含(例如，在溶液中或与纳米颗粒关联，例如，与纳米颗粒共价偶联，例如作为保留剂的一部分)细胞因子分子，生长因子分子，共刺激分子。在实施方式中，组合物包含(例如，在溶液中或与纳米颗粒关联，例如，与纳米颗粒共价偶联，例如，作为保留剂的一部分)细胞因子分子，例如il-2，il-7，il-12，il-15，il-18，il-21，il-23，il-4，il1α，il1β，il-5，ifnγ，tnfa，ifna，ifnβ，gm-csf，或gcsf，其变体，或细胞因子复合物，例如il-15复合物(例如，如本文所述的il-15超激动剂)。在实施方式中，组合物包含(例如，在溶液中或与纳米颗粒关联，例如，与纳米颗粒共价偶联，例如，作为保留剂的一部分)或分子，例如针对共刺激分子的抗体分子或激动剂配体，例如，其中共刺激分子选自ox40，cd28，gitr，vista，cd40，cd3，或cd137的激动剂。在实施方式中，纳米颗粒包含实体，所述实体减少(例如，抑制，减弱或降低)由有核细胞的纳米颗粒内化。在实施方式中，纳米颗粒包含针对cd45，cd11a(整联蛋白a-l)，cd18(整联蛋白β-2)，cd11b，cd11c，cd25，cd8或cd4的抗体分子。在一些实施方式中，纳米颗粒包含结合存在于nk细胞上的蛋白质(例如受体)的实体。例如，纳米颗粒可包含结合nk细胞上的刺激性受体或抑制性受体的实体。在实施方式中，该实体是nk细胞上的刺激性受体的激动剂，例如，该实体可以是激动剂配体或激动剂抗体分子。在实施方式中，刺激性受体是trail，cd16，nkp30a，b，dnam-1，cd137，ox40，cd27，dap12，fcεri-γ，cd3-ζ，nkg2d，dap10或cd225(2b4)。在实施方式中，刺激受体包含itam基序，例如(d/e)xxyxx(l/i)x6-8yxx(l/i)。在实施方式中，刺激性受体是天然细胞毒性受体或mhc结合活化受体。在实施方式中，该实体是nk细胞上抑制性受体的抑制剂，例如，该实体可以是抑制剂配体或抑制剂抗体分子。在实施方式中，抑制性受体是kir，lilr，ly49或nkg2a。在实施方式中，抑制性受体包含itim基序，例如(i/l/v/s)xyxx(l/v)。在实施方式中，抑制性受体是mhci类抑制性受体或非mhc结合抑制性受体。在实施方式中，nk细胞受体是以下中描述的受体：lanier“走钢丝：自然杀伤细胞活化和抑制(uponthetightrope：naturalkillercellactivationandinhibition)”natimmunol.2008年5月；9(5)：495-502，sentman等，“nk细胞受体作为癌症免疫疗法的工具(nkcellreceptorsastoolsincancerimmunotherapy)”advancesincancerresearch2006249-292，或pardoll“阻止癌症免疫治疗中的免疫检查点(theblockadeofimmunecheckpointsincancerimmunotherapy)”natrevcancer.2012年3月22日；12(4)：252-64。在一些实施方式中，纳米颗粒是高密度蛋白质结构(按重量计大于80％蛋白质)，其中蛋白质通过交联分子交联，所述交联分子在降解时释放功能性，例如天然形式。在实施方式中，纳米颗粒包含通过对氧化还原(例如，接头包含二硫键)或ph(例如，接头包含可水解基团)或酶(例如，接头包含蛋白酶切割位点)敏感的可逆接头交联的纳米凝胶。在实施方式中，本文的组合物包含颗粒，例如纳米颗粒或微粒，或纳米颗粒和微粒两者。在实施方式中，颗粒(例如，纳米颗粒)具有在30nm和1200nm之间，40nm和1100nm之间，50nm和1000nm之间，例如50和500nm之间，更典型地，70和400nm之间的平均流体动力学直径(例如，通过动态光散射测量)。在实施方式中，颗粒(例如纳米颗粒)具有100nm至400nm，150nm至350nm，或200nm至300nm之间的基于平均强度的尺寸(例如，通过动态光散射测量)。在实施方式中，颗粒(例如纳米颗粒)具有60nm至100nm，或70nm至90nm的基于平均数量的尺寸(例如，通过动态光散射测量)。在实施方式中，组合物是冷冻的。在实施方式中，组合物包含冷冻部分和液体部分。在实施方式中，组合物的温度降低至小于0摄氏度。在实施方式中，组合物的温度降低至小于-10摄氏度。在实施方式中，组合物的温度降低至小于负10，负20，负30，负40，负50，负60，负70，负80，负100，负120，负140，负160，负180，或负200摄氏度。在实施方式中，该方法包括将冷冻的有核细胞组合物保持冷冻至少1小时。在实施方式中，该方法包括将冷冻的有核细胞组合物保持冷冻至少2，4，6，12或24小时，或1，2，3，4，5或6天，或1，2，3或4周，或1，2，3或6个月，或1年，2年，3年，4年或5年。在实施方式中，所述提供包括将有核细胞与包含保留剂的纳米颗粒合并。在实施方式中，所述提供包括从另一实体接收纳米颗粒并将纳米颗粒与有核细胞合并。在实施方式中，所述提供包括从另一个实体接收未冷冻的有核细胞组合物。在实施方式中，该方法包括将有核细胞冷冻组合物提供或释放到另一个实体，例如医疗提供者，例如医院，诊所或医生办公室。在实施方式中，该方法包括解冻有核细胞冷冻组合物以提供解冻的有核细胞组合物。在实施方式中，该方法包括在加热有核细胞冷冻组合物之前，将有核细胞冷冻组合物保持冷冻至少1小时。在实施方式中，在解冻组合物的冷冻制剂时，与在没有纳米颗粒的情况下冷冻和解冻缓冲的水性介质溶液中的有核细胞相比，保留剂从纳米颗粒中释放并促进(例如，保留或增强)有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化。在实施方式中，该方法包括将解冻的有核细胞组合物给予对象。在实施方式中，所述提供包括从另一个实体接收冷冻组合物，例如，制造和/或冷冻有核细胞组合物的实体。在实施方式中，所述提供包括将有核细胞与缓冲的水性介质溶液和包含至少一种保留剂的纳米颗粒合并。在实施方式中，所述提供包括从另一实体接收纳米颗粒并将纳米颗粒与有核细胞合并。在实施方式中，该方法包括例如在解冻后扩增细胞。在实施方式中，细胞扩增至少2倍(例如，超过2天)。在实施方式中，细胞扩增至少2，3，4，5，10，20，50或100倍。在实施方式中，该方法还包括例如在解冻后活化细胞。在实施方式中，活化细胞，例如活化的cd8+细胞(以cd45ra+分数测量，例如，在使用针对cd45ra的抗体的流式细胞术测定中，例如，实施例26的试验中)的百分比为至少40％，50％，60％，70％，80％或90％。在实施方式中，用本文组合物处理的细胞(例如，解冻的细胞)具有细胞毒活性，例如，使用实施例27中描述的试验测定。在实施方式中，细胞毒活性包括在实施例27的试验中杀死至少10％，20％，30％，40％或50％的部分。在实施方式中，细胞毒活性包括在针对癌细胞系，例如道迪细胞，细胞毒性活性的测定，例如，实施例28的测定中杀死至少10％，20％，30％，40％或50％的部分。在实施方式中，细胞毒活性包括在实施例29的试验中杀死至少10％，20％，30％，40％或50％的部分。在实施方式中，细胞毒活性包括在实施例30的试验中杀死至少10％，20％，30％，40％或50％的部分。在实施方式中，用本文组合物处理的细胞(例如，解冻的细胞)具有体内扩增活性，例如，在将细胞注射到对象中的测定中，在稍后的时间点抽血，并且通过以下流式细胞术测定计数扩增的供体细胞，例如，在实施例35的测定中。在实施方式中，与未用该组合物处理的其他类似细胞相比，用本文组合物处理的解冻细胞在体内扩增产生多至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％的细胞。在实施方式中，用本文组合物处理的细胞(例如，解冻的细胞)具有肿瘤浸润活性，例如，当切除肿瘤并通过流式细胞术计数扩增的供体细胞时，例如，在实施例36的测定中。在实施方式中，用本发明组合物处理的细胞产生至少200，400，600或800个细胞/mg肿瘤。在实施方式中，与未用组合物处理的其他类似细胞相比，用本文组合物处理的细胞导致更高的肿瘤浸润水平，例如高至少1倍，2倍，3倍，4倍或5倍。在实施方式中，对象是提供有核细胞的供体对象。在实施方式中，供体对象患有癌症，糖尿病，自身免疫疾病或心血管疾病，或者需要移植。在实施方式中，对象是供体对象以外的对象。在实施方式中，除供体对象以外的对象是健康对象。在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含有核细胞，缓冲水性介质溶液和纳米颗粒，所述纳米颗粒包含至少一种保留剂，其促进，例如，保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化，其中在解冻组合物的冷冻制剂时，保留剂任选地从纳米颗粒中释放，并且与在没有纳米颗粒的情况下在缓冲水性介质溶液中冷冻和解冻的有核细胞相比促进，例如，保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化，其中所述保留剂包含与包含例如il-15受体或其il-15结合片段的多肽复合(例如，共价或非共价)的il-15分子。在一个实施方式中，多肽包含il-15受体α或其il-15结合片段。在一个实施方式中，多肽包含il-15受体α的细胞外结构域。在一个实施方式中，多肽包含seqidno：2的氨基酸序列(全长野生型il-15受体α)或其il-15结合片段；或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列。在其他实施方式中，多肽包含seqidno：3的氨基酸序列(野生型il-15受体α的ecd)或其il-15结合片段；或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列。在其他实施方式中，多肽包含seqidno：4的氨基酸序列(il-15受体α同种型cra_d的ecd)或其il-15结合片段；或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，多肽包含：第一结构域，其包含seqidno：2，seqidno：3或seqidno：4的氨基酸序列，或具有与其至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性，并具有il-15结合活性的氨基酸序列；和任选地，第二异源结构域，例如免疫球蛋白fc结构域或抗体分子，例如免疫球蛋白fab或scfv片段，fab片段，fab2片段，或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段，单结构域抗体，双特异性或多特异性抗体。在一个实施方式中，第二异源结构域是fc结构域或fab。在实施方式中，组合物(例如纳米颗粒和/或保留剂)包含il-15复合物，所述il-15复合物包含与多肽(例如，共价或非共价)复合的il-15分子，所述多肽包含il-15受体或其il-15结合片段。在实施方式中，il-15分子包含seqidno：6的人il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％的相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性。在实施方式中，包含il-15受体或其片段的多肽包含seqidno：5的il15rasu-fc多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性。在一些方面，包含il-15受体或其片段的多肽包含寿司结构域(例如，seqidno：7或seqidno：8)和第二异源结构域，其包含：效应-减毒的fc结构域，例如人igg2fc结构域，例如seqidno：11的人igg2结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：6的il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：5的寿司-fc多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：1的il-15多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；寿司-fc多肽，包含seqidno：7或seqidno：8的寿司结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性，和seqidno：11的fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性的氨基酸序列；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：6的il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：15的寿司-fc2da多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：1的il-15多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：15的寿司-fc2da多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在实施方式中，保留剂是用于维持有核细胞活力，增殖，细胞毒活性或活化的刺激分子。在实施方式中，促进干扰素γ产生。在实施方式中，通过干扰素γ产生来测量活化。在实施方式中，培养基含有刺激和维持细胞活力和增殖的化合物。在实施方式中，培养基包含在冷冻和解冻期间保护细胞的化合物。在实施方式中，保留剂从纳米颗粒的释放发生在1小时至3周，例如1小时至24小时，1天至3天，4天至6天，1周至2周，或2周至3周期间。在实施方式中，纳米颗粒与有核细胞的表面关联。在实施方式中，有核细胞是免疫细胞，例如免疫效应细胞(例如，淋巴细胞，t细胞，b细胞或自然杀伤细胞)，或造血干细胞。在一些实施方式中，有核细胞是如本文所述的免疫细胞或细胞系。在实施方式中，纳米颗粒通过对有核细胞的静电吸引与细胞表面关联。在实施方式中，纳米颗粒包含至少一种配体，其中配体对有核细胞表面上的蛋白质，碳水化合物或脂质具有亲和性。在实施方式中，纳米颗粒共价偶联至有核细胞的表面。在实施方式中，纳米颗粒非共价偶联至有核细胞的表面。在实施方式中，纳米颗粒包含脂质体，蛋白质纳米凝胶，核苷酸纳米凝胶，聚合物纳米颗粒或固体纳米颗粒。在实施方式中，纳米颗粒包括脂质体。在实施方式中，纳米颗粒包括蛋白质纳米凝胶。在实施方式中，纳米颗粒在纳米颗粒表面上包含至少一种聚合物，阳离子聚合物或阳离子嵌段共聚物。在实施方式中，纳米颗粒包括聚乙二醇(peg)。在实施方式中，组合物包含化合物，所述化合物使纳米颗粒在溶液中或细胞表面上稳定和/或增加纳米颗粒与有核细胞表面之间的相互作用。在一些实施方式中，化合物选自鱼精蛋白，壳聚糖，碳水化合物，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，天然聚合物，多糖，葡聚糖多聚物，纤维素，纤连蛋白，胶原，纤维蛋白或蛋白多糖。在实施方式中，保留剂包含细胞因子分子，生长因子分子，共刺激分子。在实施方式中，组合物包含第一和/或第二保留剂，其包含细胞因子分子。在一些实施方式中，细胞因子分子选自il-2，il-7，il-12，il-15，il-18，il-21，il-23，il-4，il1α，il-1β，il-5，ifnγ，tnfα，ifnα，ifnβ，gm-csf或gcsf，其变体，或细胞因子复合物，或前述的任何组合。在一些实施方式中，细胞因子分子包含il-15复合物，例如本文所述的il-15超激动剂。在实施方式中，组合物包含针对共刺激分子的抗体分子或激动剂配体，例如，其中共刺激分子选自cd137的激动剂，ox40，cd28，gitr，vista，cd40，或cd3。在实施方式中，纳米颗粒包含实体，所述实体减少(例如，抑制，减弱或降低)由有核细胞的纳米颗粒内化。在实施方式中，纳米颗粒包含针对cd45，cd11a(整联蛋白α-l)，cd18(整联蛋白β-2)，cd11b，cd11c，cd25，cd8或cd4的抗体分子。在实施方式中，纳米颗粒包含通过对氧化还原(例如二硫化物)或ph(例如可水解基团)或酶(例如蛋白酶)敏感的可逆接头交联的纳米凝胶。在实施方式中，组合物是冷冻的。在实施方式中，组合物包含冷冻部分和液体部分。另一方面，本发明的特征在于一种促进，例如增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化的方法。在实施方式中，有核细胞是或已经从患者分离。该方法包括通过将有核细胞与缓冲水溶液，纳米颗粒合并来修饰有核细胞，所述纳米颗粒包含至少一种保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化的试剂，例如本文所述的保留剂。另一方面，本发明的特征在于一种促进，例如增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化的方法。在实施方式中，有核细胞是或已经从患者中分离并且通过与缓冲水溶液，纳米颗粒合并进行修饰，所述纳米颗粒包含至少一种保留或增强成核活力，增殖，细胞毒活性或活化的试剂，例如本文所述的保留剂。该方法包括使有核细胞经历至少一个冻融循环。在某些方面，本发明的特征在于一种制备有核细胞的冷冻组合物的方法，包括：a)提供包含有核细胞，缓冲水性介质溶液和包含至少一种保留剂的纳米颗粒的未冷冻组合物，所述保留剂是例如在解冻有核细胞的冷冻制剂时促进，例如，保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化的试剂(例如，提供未冷冻的有核细胞-纳米颗粒复合物)；b)任选地，降低组合物的温度以使组合物充分冷冻，从而冷冻有核细胞的组合物。在实施方式中，组合物的温度降低至小于0摄氏度。在实施方式中，组合物的温度降低至小于-10摄氏度。在实施方式中，该方法包括将冷冻的有核细胞组合物冷冻至少1小时。在实施方式中，所述提供包括将有核细胞与缓冲的水性介质溶液和包含至少一种保留剂的纳米颗粒合并，从而形成有核细胞-纳米颗粒复合物。在实施方式中，所述提供包括从另一实体接收纳米颗粒并将纳米颗粒与有核细胞和缓冲水性介质溶液合并。在实施方式中，所述提供包括从另一个实体接收未冷冻的有核细胞组合物。在实施方式中，该方法包括将有核细胞冷冻组合物提供或释放到另一个实体，例如医疗提供者，例如医院，诊所或医生办公室。在实施方式中，该方法包括解冻有核细胞冷冻组合物以提供解冻的有核细胞组合物。在实施方式中，在解冻组合物的冷冻制剂时，与在没有纳米颗粒的情况下冷冻和解冻缓冲的水性介质溶液中的有核细胞相比，保留剂从纳米颗粒中释放并促进(例如，保留或增强)有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化。在实施方式中，该方法包括将解冻的有核细胞组合物给予对象。在实施方式中，该对象是供体对象。在实施方式中，供体对象患有癌症，糖尿病，自身免疫疾病，或者需要移植。在实施方式中，对象是供体对象以外的对象。在实施方式中，供体对象以外的对象是健康对象。在任何上述组合物和方法的一些实施方式中，保留剂包含il-15超激动剂，例如具有比野生型il-15更高活性的il-15分子。在实施方式中，保留剂包含il-15分子和多肽，例如il-15多肽受体α片段(例如，il-15受体α的细胞外结构域)。在一个实施方式中，多肽包含：第一结构域，其包含seqidno：2的氨基酸序列(野生型il-15受体α)，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列；和任选地，第二异源结构域，例如免疫球蛋白fc结构域或抗体分子，例如免疫球蛋白fab或scfv片段，fab片段，fab2片段，或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段，单结构域抗体，双特异性或多特异性抗体。在一个实施方式中，第二异源结构域是fc结构域或fab。在另一个实施方式中，多肽包含：第一结构域，包含seqidno：3的氨基酸序列，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列；和任选地，第二异源结构域，例如免疫球蛋白fc结构域或抗体分子，例如免疫球蛋白fab或scfv片段，fab片段，fab2片段，或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段，单结构域抗体，双特异性或多特异性抗体。在一个实施方式中，第二异源结构域是fc结构域或fab。在一个实施方式中，多肽包含：第一结构域，其包含seqidno：4的氨基酸序列(il-15受体α同种型cra_d的ecd)，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列；和任选地，第二异源结构域，例如免疫球蛋白fc结构域或抗体分子，例如免疫球蛋白fab或scfv片段，fab片段，fab2片段，或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段，单结构域抗体，双特异性或多特异性抗体。在一个实施方式中，第二异源结构域是fc结构域或fab。在实施方式中，组合物(例如纳米颗粒和/或保留剂)包含il-15复合物，所述il-15复合物包含il-15分子，所述il-15分子与包含il-15受体或其il-15结合片段的多肽(例如，共价或非共价)复合。在实施方式中，il-15分子包含seqidno：6的人il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％的相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性。在实施方式中，包含il-15受体或其片段的多肽包含seqidno：5的il15rasu-fc多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性。在一些方面，包含il-15受体或其片段的多肽包含寿司结构域(例如，seqidno：7或seqidno：8)和第二异源结构域，所述第二异源结构域包含：效应-减毒的fc结构域，例如人igg2fc结构域，例如seqidno：11的人igg2结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：6的il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：5的寿司-fc多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：1的il-15多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；寿司-fc多肽，包含seqidno：7或seqidno：8的寿司结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性，和seqidno：11的fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性的氨基酸序列；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：6的il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：15的寿司-fc2da多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：1的il-15多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：15的寿司-fc2da多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在实施方式中，保留剂是用于维持有核细胞活力，增殖，细胞毒活性或活化的刺激分子。在实施方式中，促进干扰素γ产生。在实施方式中，可通过干扰素γ产生来测量活化。在实施方式中，培养基含有刺激和维持细胞活力和增殖的化合物。在实施方式中，培养基包含在冷冻和解冻期间保护细胞的化合物。在实施方式中，保留剂从纳米颗粒的释放发生在1小时至3周，例如1小时至24小时，1天至3天，4天至6天，1周至2周，或2周至3周期间。在实施方式中，纳米颗粒与有核细胞(例如有核细胞的表面)共价或非共价结合，从而形成有核细胞-纳米颗粒复合物。在实施方式中，有核细胞是免疫效应细胞(例如，淋巴细胞，t细胞，b细胞或自然杀伤细胞)或造血干细胞。在一些实施方式中，有核细胞是免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞)，其包含，例如，表达嵌合抗原受体(car)，例如结合癌抗原的car。在其他实施方式中，有核细胞表达外源高亲和力fc受体。在实施方式中，有核细胞是从患者或健康供体获得的nk细胞。在其他实施方式中，有核细胞是nk细胞系，例如，如本文所述的稳定或永生化细胞系。在一个实施方式中，nk细胞是nk-92细胞系。在实施方式中，纳米颗粒包含至少一种配体，其中配体对有核细胞表面上的蛋白质，碳水化合物或脂质具有亲和性。在实施方式中，纳米颗粒共价偶联至有核细胞的表面。在实施方式中，纳米颗粒非共价偶联至有核细胞的表面。在实施方式中，纳米颗粒包含脂质体，蛋白质纳米凝胶，核苷酸纳米凝胶，聚合物纳米颗粒或固体纳米颗粒。在实施方式中，纳米颗粒包括脂质体。在实施方式中，纳米颗粒包括蛋白质纳米凝胶。在实施方式中，纳米颗粒任选地在纳米颗粒表面上包含至少一种聚合物，阳离子聚合物或阳离子嵌段共聚物。在实施方式中，纳米颗粒包括聚乙二醇(peg)。在实施方式中，组合物包含化合物，所述化合物使纳米颗粒在溶液中或细胞表面上稳定和/或增加纳米颗粒与有核细胞表面之间的相互作用。在实施方式中，试剂选自鱼精蛋白，壳聚糖，碳水化合物，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，天然聚合物，多糖，葡聚糖多聚物，纤维素，纤连蛋白，胶原，纤维蛋白或蛋白多糖。在实施方式中，保留剂包含细胞因子分子，生长因子分子，或共刺激分子。在实施方式中，保留剂包含细胞因子分子，例如il-2，il-7，il-12，il-15，il-18，il-21，il-23，il-4，il-1α，il-1β，il-5，ifnγ，tnfα，ifnα，ifnβ，gm-csf或gcsf，其变体，或细胞因子复合物，例如il-15复合物(例如，如本文所述的il-15超激动剂)。在一些实施方式中，细胞因子分子进一步包含，例如，与抗体分子偶联(例如，融合)，(例如，免疫球蛋白fab或scfv片段，fab片段，fab2片段或亲和体片段或衍生物，例如，sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段，例如，免疫球蛋白fc，单结构域抗体，双特异性抗体或多特异性抗体。在实施方式中，组合物包含共刺激分子的激动剂(例如，抗体分子或激动剂配体)，例如cd137的激动剂，ox40，cd28，gitr，vista，cd40，或cd3。在实施方式中，纳米颗粒包含实体，所述实体减少(例如，抑制，减弱或降低)由有核细胞的纳米颗粒内化。在实施方式中，纳米颗粒包含针对cd45，cd11a(整联蛋白α-l)，cd18(整联蛋白β-2)，cd11b，cd11c，cd25，cd8或cd4的抗体分子。在实施方式中，纳米颗粒包含与纳米颗粒表面偶联的抗cd45亲和性或结合配体。在实施方式中，纳米颗粒包含通过对氧化还原(例如二硫化物)或ph(例如可水解基团)或酶(例如蛋白酶)敏感的可逆接头交联的纳米凝胶。在一些方面，本发明的特征在于一种制备有核细胞的解冻组合物的方法，包括：a)提供包含有核细胞，缓冲的含水介质溶液和纳米颗粒的有核细胞的冷冻组合物，所述纳米颗粒包含至少一种保留剂，所述保留剂例如在解冻有核细胞的冷冻制剂时促进(例如保留或增强)有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化(例如，提供如本文所公开的有核细胞-纳米颗粒复合物)；和b)充分加热有核细胞的冷冻组合物以解冻有核细胞的冷冻组合物，从而制备有核细胞的解冻组合物。在一些实施方式中，所述提供包括从另一个实体接收冷冻组合物，例如，制造和/或冷冻有核细胞组合物的实体。在一些实施方式中，所述提供包括将有核细胞与缓冲的水性介质溶液和包含至少一种保留剂的纳米颗粒合并，从而形成有核细胞-纳米颗粒复合物。在一些实施方式中，所述提供包括从另一实体接收纳米颗粒并将纳米颗粒与有核细胞和缓冲水性介质溶液合并。在一些实施方式中，该方法包括在加热有核细胞冷冻组合物之前，将有核细胞冷冻组合物保持冷冻至少1小时。在实施方式中，对象是贡献有核细胞的供体对象。在实施方式中，供体对象，例如，患者患有癌症，糖尿病，自身免疫疾病或心血管疾病，或者需要移植。在实施方式中，对象是供体对象以外的对象。在实施方式中，供体对象以外的对象是健康对象。在一些实施方式中，保留剂包含：选自以下之一的il-15多肽受体α片段：i)seqidno：2的氨基酸序列，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列；ii)seqidno：3的氨基酸序列，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列；iii)seqidno：4的氨基酸序列，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并具有il-15结合活性的氨基酸序列；和任选地，第二异源结构域，例如免疫球蛋白fc结构域或抗体分子，例如免疫球蛋白fab或scfv片段，fab片段，fab2片段，或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段，单结构域抗体，双特异性或多特异性抗体。在一个实施方式中，第二异源结构域是fc结构域或fab。在一些实施方式中，保留剂包含il-15分子和il-15多肽受体α片段的复合物。在实施方式中，组合物(例如纳米颗粒和/或保留剂)包含il-15复合物，所述il-15复合物包含il-15分子，所述il-15分子与包含il-15受体或其il-15结合片段的多肽(例如，共价或非共价)复合。在实施方式中，il-15分子包含seqidno：6的人il－15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％的相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性。在实施方式中，包含il-15受体或其片段的多肽包含seqidno：5的ill5rasu-fc多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性。在一些方面，包含il-15受体或其片段的多肽包含寿司结构域(例如，seqidno：7或seqidno：8)和第二异源结构域，其包含：效应-减毒的fc结构域，例如人igg2fc结构域，例如seqidno：11的人igg2结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：6的il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：5的寿司-fc多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：1的il-15多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；寿司-fc多肽，包含seqidno：7或seqidno：8的寿司结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性，和seqidno：11的fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性的氨基酸序列；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：6的il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：15的寿司-fc2da多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在一些实施方式中，组合物(例如，纳米颗粒)包含：seqidno：1的il-15多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：15的寿司-fc2da多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸；和任选地，针对cd45的抗体分子。在实施方式中，保留剂是用于维持有核细胞活力，增殖，细胞毒活性或活化的刺激分子。在实施方式中，干扰素γ产生受到促进。在实施方式中，可通过干扰素γ产生来测量活化。在实施方式中，培养基含有刺激和维持细胞活力和增殖的化合物。在实施方式中，培养基包含在冷冻和解冻期间保护细胞的化合物。在实施方式中，保留剂从纳米颗粒的释放发生在1小时至3周，例如1小时至24小时，1天至3天，4天至6天，1周至2周，或2周至3周期间。在实施方式中，纳米颗粒与有核细胞的表面关联。在实施方式中，有核细胞是免疫效应细胞(例如，淋巴细胞，t细胞，b细胞或自然杀伤细胞)或造血干细胞。在实施方式中，纳米颗粒通过对有核细胞的静电吸引与细胞表面关联。在实施方式中，纳米颗粒包含至少一种配体，其中配体对有核细胞表面上的蛋白质，碳水化合物或脂质具有亲和性。在实施方式中，纳米颗粒共价偶联至有核细胞的表面。在实施方式中，纳米颗粒非共价偶联至有核细胞的表面。在实施方式中，纳米颗粒包含脂质体，蛋白质纳米凝胶，核苷酸纳米凝胶，聚合物纳米颗粒或固体纳米颗粒。在实施方式中，纳米颗粒包括脂质体。在实施方式中，纳米颗粒包括蛋白质纳米凝胶。在实施方式中，纳米颗粒在纳米颗粒表面上包含至少一种聚合物，阳离子聚合物或阳离子嵌段共聚物。在实施方式中，纳米颗粒包括聚乙二醇(peg)。在实施方式中，组合物包含使纳米颗粒在溶液中或细胞表面上稳定和/或增加纳米颗粒与有核细胞表面之间的相互作用的化合物，例如鱼精蛋白，壳聚糖，碳水化合物，硫酸乙酰肝素蛋白多糖，天然聚合物，多糖，葡聚糖多聚物，纤维素，纤连蛋白，胶原，纤维蛋白或蛋白多糖。在一些实施方式中，保留剂包含细胞因子分子，与多肽复合的细胞因子，例如其受体或其受体的片段或部分，生长因子分子，或共刺激分子。在实施方式中，保留剂包含细胞因子分子，例如il-2，il-7，il-12，il-15，il-18，il-21，il-23，il-4，il-1α，il-1β，il-5，ifnγ，tnfα，ifnα，ifnβ，gm-csf或gcsf，其变体，或细胞因子复合物，例如il-15复合物(例如，如本文所述的il-15超激动剂)。在实施方式中，保留剂包含与il-15受体α链的片段(例如本文所述的片段)关联的细胞因子分子，例如il-15。在一些实施方式中，细胞因子分子进一步包含，例如，与抗体分子偶联(例如，融合)，所述抗体分子例如，免疫球蛋白fab或scfv片段，fab片段，fab2片段或亲和体片段或衍生物，例如，sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段，例如，免疫球蛋白fc，单结构域抗体，双特异性抗体或多特异性抗体。在实施方式中，组合物包含激动剂，例如，针对共刺激分子的抗体分子或激动剂配体，例如，其中共刺激分子选自cd137的激动剂，ox40，cd28，gitr，vista，cd40，或cd3。在实施方式中，纳米颗粒包含实体，所述实体减少(例如，抑制，减弱或降低)由有核细胞的纳米颗粒内化。在实施方式中，纳米颗粒包含针对cd45，cd11a(整联蛋白α-l)，cd18(整联蛋白β-2)，cd11b，cd11c，cd25，cd8或cd4的抗体分子。在实施方式中，纳米颗粒包含通过对氧化还原(例如二硫化物)或dh(例如可水解基团)或酶(例如蛋白酶)敏感的可逆接头交联的纳米凝胶。在一些方面，本发明的特征在于一种用于冷冻有核细胞和纳米颗粒(例如，有核细胞-纳米颗粒复合物)的方法，其中有核细胞在低于负10摄氏度时冷冻并在至少1小时后解冻，其中所述纳米颗粒包含至少一种在解冻后任选地从纳米颗粒中释放的试剂，与没有纳米颗粒冷冻的有核细胞的组合物相比，其保持细胞的功能，例如，保留细胞活力。在一些实施方式中，所述试剂是用于维持有核细胞活力的刺激分子。在实施方式中，有核运载体细胞是淋巴细胞。在实施方式中，纳米颗粒与有核细胞的表面关联。在实施方式中，纳米颗粒共价偶联至有核细胞的表面。另一方面，本发明的特征在于包含本文所述组合物的药物组合物，例如包含有核细胞和纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含至少一种保留剂(例如，有核细胞-纳米颗粒复合物)和药学上可接受的运载体。在实施方式中，本文的对象需要基于细胞的疗法，例如免疫细胞疗法。例如，对象需要过继细胞疗法。在一些实施方式中，对象是患者，例如人类患者。在一些实施方式中，所述对象患有选自癌症，糖尿病，自身免疫疾病，过敏或过敏性疾病，哮喘或心血管疾病的疾病。在实施方式中，对象需要移植。在实施方式中，本文的方法还包括，例如在解冻后，评估复合物中有核细胞的功能，例如，评估有核细胞的增殖，细胞因子释放或细胞毒性作用中的一种或多种。本发明的其他特征、目的和优势通过描述、附图以及权利要求书将是显而易见的。除非另外定义，否则，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。附图说明图1a-1b描绘了il-15/寿司-fc融合构建体的示意图。图1a是il-15wt/寿司-fc的示意图：wt人il-15，其与融合至人igg1fc区的n末端的人il-15rα的寿司结构域非共价结合。图1b是il-15n72d/寿司-fc的示意图：含有n72d突变的人il-15，其与融合至人igg1fc区的n末端的人il-15rα的寿司结构域非共价结合。图2描绘了用于蛋白质纳米凝胶(背包)形成的ill5/寿司-igg1-fc构建体的sds-page分析。用可逆交联剂交联后分析il-15wt/寿司-fc(黑色)和il-15n72d/寿司-fc(蓝色)蛋白纳米凝胶(泳道1和2)。所得蛋白质纳米凝胶是高度交联的并且不能有效地进入聚丙烯酰胺凝胶。还包括显示还原的(泳道3和4)和非还原的(泳道5和6)il-15变体的对照。图中省略了相同sds-page上的无关数据。图3显示了在biosep4000尺寸排阻色谱柱上通过hplc分析的交联il-15n72d/寿司-fc蛋白纳米凝胶(11分钟处的峰是未掺入的接头)；5分钟的峰是交联的il-15n72d/寿司-fc。图4显示了通过hplc在biosep4000尺寸排阻色谱柱上分析的非交联的il-15n72d/寿司-fc。图5显示在biosep4000尺寸排阻色谱柱上用polyk30官能化的交联il-15n72d/寿司-fc蛋白纳米凝胶的hplc。图6显示通过hplc在biosep4000尺寸排阻色谱柱上分析的非交联抗cd45igg。图7：在biosep4000尺寸排阻色谱柱上通过hplc分析用抗cd45igg(如上所述的相同初始浓度的抗cd45igg)官能化的交联il-15n72d/寿司-fc蛋白纳米凝胶。图8：在biosep4000尺寸排阻色谱柱上通过hplc分析用抗cd45igg和polyk30官能化的交联的il-15n72d/寿司-fc蛋白纳米凝胶。图9描绘了蛋白纳米凝胶与cd8t细胞的关联。cd8t细胞与含有3％重量的alexa-647偶联的il-15n72d/寿司-fc的il-15n72d/寿司-fc蛋白纳米凝胶(背包)关联。将cd8t细胞在fbs+5％dmso中冷冻过夜。解冻后，将cd8t细胞在含有il-2的培养基(20ng/ml)中培养，并通过流式细胞术在指定的时间点测量它们的alexa-647荧光。图10描绘了t细胞扩增分析。将cd8t细胞与il-15n72d/寿司-fc背包偶联(右组)或不与之偶联(左组)，然后在fbs+5％dmso中冷冻过夜。解冻后，将两组在含有il-2的培养基(20ng/ml)中培养，并在4小时后(灰色条)和第2天(黑色条)通过流式细胞术测量活细胞数。该实验的完全培养基是imdm(龙沙公司(lonza))，glutamaxx(生命技术公司(lifetech))，20％fbs(生命技术公司)，2.5ug/ml人白蛋白(奥卡医药公司(octapharma))，0.5ug/ml肌醇(西格玛公司(sigma))。图11a-11b显示了t细胞扩增分析。在图11a中，在无血清培养基(bambanker)中冷冻2周之前，cd3t细胞与il-15n72d/寿司-fc蛋白纳米凝胶(背包)相关联(最右侧组)或不关联(最左侧3组)。解冻后，第一组在完全培养基中培养(仅培养基)，第二组在含有il-2(20ng/ml)的完全培养基(il-2(可溶))中培养，第三组在含有il-15n72d/寿司-fc(0.6ug/ml)的完全培养基(il-15n72d/寿司-fc(0.6ug/ml))中培养，并且第四组在完全培养基(il-15n72d/寿司-fc背包)中培养。通过流式细胞术在16小时(灰色条)和第9天(黑色条)后测量活细胞数。在图11b中，cd3t细胞与il-15wt/寿司-fc背包偶联(最右边的组)或不之偶联(最左边的3个组)，然后在无血清培养基(bambanker)中冷冻过夜。解冻后，第一组在完全培养基中培养(仅培养基)，第二组在含有il-2(20ng/ml)的完全培养基(il-2(可溶))中培养，第三组在含有il-15wt/寿司-fc(12ug/ml)完全培养基(il-15wt/寿司-fc(12ug/ml))中培养，并且第四组在完全培养基(il-15wt/寿司-fc背包)中培养。通过显微镜在第2天(浅灰色条)，第6天(深灰色条)和第7天(黑色条)测量活细胞数。该实验的完全培养基是imdm(龙沙公司)，glutamaxx(生命技术公司)，20％fbs(生命技术公司)，2.5ug/ml人白蛋白(奥卡医药公司)，0.5ug/ml肌醇(西格玛公司)。图12a-12b描绘了nk-92细胞系和原代nk细胞扩增分析。在图12a中，nk-92细胞与il-15wt/寿司-fc蛋白凝胶(背包)相关联(最右边2个组)或不关联(最左边3个组)。前4组在无血清培养基(bambanker)中冷冻2小时，洗涤第五组并在完全培养基(il-15wt/寿司-fc背包(无冷冻))中培养。解冻4个最左侧组后，第一组在完全培养基中培养(仅培养基)，第二组在含有il-2(20ng/ml)的完全培养基(il-2(可溶))中培养，第三组在含有il-15wt/寿司-fc(12ug/ml)的完全培养基(il-15wt/寿司-fc(12ug/ml))中培养，并且第四组在完全培养基(il-15wt/寿司-fc背包)中培养。通过显微镜在第1天(浅灰色条)，第5天(深灰色条)和第6天(黑色条)测量活细胞数。在图12b中，在无血清培养基(bambanker)中冷冻2周之前，原代nk细胞与il-15n72d/寿司-fc蛋白纳米凝胶(背包)相关联(最右侧组)或不关联(最左侧3组)。解冻后，第一组在完全培养基中培养(仅培养基)，第二组在含有il-2(20ng/ml)的完全培养基(il-2(可溶))中培养，第三组在含有il-15n72d/寿司-fc(0.6ug/ml)的完全培养基(il-15n72d/寿司-fc(0.6ug/ml))中培养，并且第四组在完全培养基(il-15n72d/寿司-fc背包)中培养。通过流式细胞术在16小时(灰色条)和第9天(黑色条)后测量活细胞数。用于该实验的完全培养基是含有重组转铁蛋白(龙沙公司)，glutamaxx(生命技术公司)，5％人血清ab(康宁公司(corning))的xvivo10。图13a-13b描绘了t细胞亚群分析。在图13a中，在无血清培养基(bambanker)中冷冻2周之前，cd3t细胞与il-15n72d/寿司-fc蛋白纳米凝胶(背包)相关联(最右侧组)或不关联(最左侧3组)。解冻后，第一组在完全培养基中培养(仅培养基)，第二组在含有il-2(20ng/ml)的完全培养基(il-2(可溶))中培养，第三组在含有il-15n72d/寿司-fc(0.6ug/ml)的完全培养基(il-15n72d/寿司-fc(0.6ug/ml))中培养，并且第四组在完全培养基(il-15n72d/寿司-fc背包)中培养。培养9天后，通过流式细胞术分析cd3t细胞的子集表达(图13a)和活化(图13b)标志物。图14a-14b描绘了t细胞效力分析。在图14a中，在无血清培养基(bambanker)中冷冻2周之前，cd3t细胞与il-15n72d/寿司-fc蛋白纳米凝胶(背包)相关联(最右边的组)或不关联(最左边的3个组)。解冻后，第一组在完全培养基中培养(仅培养基)，第二组在含有il-2(20ng/ml)的完全培养基(il-2(可溶))中培养，第三组在含有il-15n72d/寿司-fc(0.6ug/ml)完全培养基(il-15n72d/寿司-fc(0.6ug/ml))中培养，并且第四组在完全培养基(il-15n72d/寿司-fc背包)中培养。培养1天后，将cd3t细胞与靶细胞(道迪)以不同的效应物与靶(e∶t)比例共培养。16小时后通过流式细胞术测量靶细胞的杀伤。通过双向anova和tukey多重比较检验计算统计学显著性。*：p＜0.05；**：p＜0.01。图14b显示了从与图14a中相同细胞释放ifng的测量结果。该实验的完全培养基是imdm(龙沙公司)，glutamaxx(生命技术公司)，20％fbs(生命技术公司)，2.5ug/ml人白蛋白(奥卡医药公司)，0.5ug/ml肌醇(西格玛公司)。图15a-15b描绘了t细胞效力分析。在图15a中，cd8t细胞与il-15n72d/寿司-fc蛋白纳米凝胶(背包)结合，并在完全培养基中洗涤和培养，或在无血清培养基(bambanker)中冷冻2天。解冻后，将cd8t细胞在完全培养基中培养。培养18天后(“无冷冻”组20天)，将cd8t细胞与靶细胞(道迪)以不同的效应物与靶标(e∶t)比例共培养。16小时后通过流式细胞术测量靶细胞的杀伤。通过sidak多重比较检验的双向anova计算统计学显著性。n.s.：非显著的。图15b显示了从与图15a中相同细胞释放ifng的测量结果。该实验的完全培养基是imdm(龙沙公司)，glutamaxx(生命技术公司)，20％fbs(生命技术公司)，2.5ug/ml人白蛋白(奥卡医药公司)，0.5ug/ml肌醇(西格玛公司)。图16a-16b描绘了t细胞效力分析。在图16a中，cd8t细胞与il-15n72d/寿司-fc蛋白纳米凝胶(背包)相关联(最右侧组)或不关联(最左侧2组)，并在含有il-2的培养基(20ng/ml)中洗涤和培养(最左边的组)或在fbs+5％dmso(最右边的2个组)中冷冻过夜。解冻后，将两组在含有il-2的培养基(20ng/ml)中培养。培养3天后，将cd8t细胞与靶细胞(道迪)以不同的效应物与靶标(e∶t)比例共培养。16小时后通过流式细胞术测量靶细胞的杀伤。通过sidak多重比较检验的双向anova计算统计学显著性。****：p＜0.0001。图16b显示了从与图16a中相同细胞释放的ifng的测量结果。该实验的完全培养基是imdm(龙沙公司)，glutamaxx(生命技术公司)，20％fbs(生命技术公司)，2.5ug/ml人白蛋白(奥卡医药公司)，0.5ug/ml肌醇(西格玛公司)。图17a-17b描绘了原代nk细胞效力分析。在图17a中，在无血清培养基(bambanker)中冷冻2周之前，将nk细胞与il-15n72d/寿司-fc背包偶联(最右侧组)或不与之偶联(最左侧3个组)。解冻后，第一组在完全培养基中培养(仅培养基)，第二组在含有il-2(20ng/ml)的完全培养基(il-2(可溶))中培养，第三组在含有il-15n72d/寿司-fc(0.6ug/ml)的完全培养基(il-15n72d/寿司-fc(0.6ug/ml))中培养，并且第四组在完全培养基(il-15n72d/寿司-fc背包)中培养。培养1天后，将nk细胞与靶细胞(道迪)以不同的效应物与靶标(e∶t)比例共培养。16小时后通过流式细胞术测量靶细胞的杀伤。图17b显示了从与图17a中相同细胞释放的ifng的测量结果。用于该实验的完全培养基是含有重组转铁蛋白(龙沙公司)，glutamaxx(生命技术公司)，5％人血清ab(康宁公司)的xvivo10。图18a-18b描绘了原代小鼠t细胞活力分析。在图18a中，体外活化的t细胞(参见实施例14)与汉克斯平衡盐溶液(hbss；黑色条)孵育(在第0天)或与il-15mut/寿司-fc2da背包(灰色条)偶联或与il-15wt/寿司-fc2da背包(灰色阴影条)偶联。il-15mut/寿司-fc2da背包在il15蛋白质中携带d8n突变，使其失活。洗涤后(参见实施例21)，将t细胞分成两半并在cm-mt中培养(参见实施例31)或在无血清培养基(bambanker)中冷冻5天。通过双荧光显微镜(吖啶橙/溴化乙锭，目录号cs2-0106；cellometer，nexcelom生物科学有限责任公司)在解冻后和培养2天后测量t细胞活力。na：不适用。f/t：冷冻/解冻。bp：背包。在图18b中，由独立的操作者重复相同的实验但没有il-15mut/寿司-fc2da背包并且将t细胞保持培养3天而不是2天。图19描绘了培养中的原代小鼠t细胞扩增。将体外活化的t细胞(参见实施例31)与汉克斯平衡盐溶液(hbss；黑色条)孵育(在第0天)或与il-15wt/寿司-fc2da背包(灰色阴影条)偶联。洗涤后(参见实施例21)，将t细胞分成两半并在cm-mt中培养(参见实施例31)或在无血清培养基(bambanker)中冷冻5天。通过双荧光显微镜(吖啶橙/碘化丙啶，目录号cs2-0106；cellometer，nexcelom)在解冻后和培养3和6天后计数t细胞。结果报告为相对第0天的倍数变化。f/t：冷冻/解冻。bp：背包。图20a-20b描绘了培养中的原代人t细胞扩增。在两个组中，cd8t细胞与汉克斯平衡盐溶液(hbss；黑色条)或il-15wt/寿司-fc2da(深灰色条)一起孵育，或与不含peg5kpolyk30的il-15wt/寿司-fc2da背包(浅灰色条纹)偶联或与含peg5kpolyk30(空心条)的il-15wt/寿司-fc2da背包偶联。在图20a中，在没有冷冻的情况下新鲜培养t细胞，在图20b中，将t细胞冷冻(在90％fbs+10％dmso中)7天，解冻并再培养7天。在两个组中，培养条件不包括细胞因子。通过流式细胞术在指定的时间点测量活细胞的数量。结果报告为相对第0天的倍数变化。bp：背包。图21a-21b描绘了受体小鼠循环中转移的小鼠pmelt细胞的浓度。在两个组中，从pmel转基因小鼠的脾中分离原代鼠t细胞并在体外活化(实施例31)。在图21a中，活化的t细胞与il-15mut/寿司-fc2da或il-15wt/寿司-fc2da背包偶联并冷冻(bambanker)。在图21b中，将活化的t细胞与汉克斯平衡盐溶液(hbss)或偶联的il-15wt/寿司-fc2da背包一起孵育并冷冻(bambanker)。解冻后，洗涤t细胞并静脉内注射，每只小鼠107个。通过流式细胞术在第5天(图21a)或第7天(图21b)测量活细胞数。这两个实验由独立的操作者完成。结果报告为每u1血液中t细胞的数量。由曼-惠特尼检验进行统计分析。bp：背包。图22描绘了受体小鼠的肿瘤微环境中转移的小鼠pmelt细胞的浓度。从pmel转基因小鼠的脾中分离原代鼠t细胞并在体外活化(实施例31)。将活化的t细胞与汉克斯平衡盐溶液(hbss)一起孵育，与il-15mut/寿司-fc2da背包偶联或与il-15wt/寿司-fc2da背包偶联。给动物注射新鲜或冷冻细胞(每只小鼠107个)。在第26天通过流式细胞术测量浸润肿瘤的活转移的t细胞的数量。结果报告为每mg肿瘤的t细胞数。由曼-惠特尼检验进行统计分析。bp：背包。具体实施方式本公开内容在于(例如，离体)产生有核细胞(例如，免疫细胞)的优化方法和组合物(在本文中也称为“背包枕”(backpackpillow))，该细胞具有至少一种保留的功能(例如，保留存活，增殖，细胞毒活性或激活中的一种或多种)。在一些实施方式中，本文公开了用于保留免疫细胞功能的方法。该方法包括使有核细胞接触(例如，离体接触，例如，从对象获得的免疫细胞群)包含保留剂的颗粒(例如纳米颗粒)，例如，包含蛋白质的纳米颗粒(例如，蛋白质纳米凝胶)。如本文所用，“保留剂”是指促进(例如，保留或增强)下述的试剂(例如蛋白质)：有核细胞的活力，有核细胞增殖的能力或有核细胞的另一种生物活性，例如细胞毒活性，有核细胞的活化(例如，在免疫细胞的情况下，所述活化包括以下一种或多种的增加：免疫细胞增殖，细胞因子分泌或靶细胞杀伤)，分泌因子(例如细胞因子，例如促炎细胞因子)的能力中的一种或多种。在一个实施方式中，保留剂促进分泌干扰素γ的能力。在实施方式中，所述保留剂选自一种或多种(例如，2，3，4，5或更多种)治疗或生物活性蛋白质，例如一种或多种细胞因子分子(例如，il-15il-2，il-7和il-21，包括其变体形式，例如突变体；包含细胞因子分子与多肽的复合物，例如细胞因子受体复合物；其融合体或激动剂形式)；生长因子；和其他分子，例如激动剂，例如针对共刺激分子的抗体分子或配体，例如cd137的激动剂，ox40，cd28，gitr，vista，cd40，或cd3。在一些实施方式中，保留剂包括融合物，例如细胞因子与免疫球蛋白fc结构域或抗体分子，例如免疫球蛋白fab或scfv片段，fab片段，fab2片段，或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段，单结构域抗体，双特异性或多特异性抗体的融合物。作为另外一种选择或组合，背包枕包括以下一种或多种：抗体分子(例如，如本文所述的抗体分子)，人血清白蛋白或其他结合部分，包括例如纤连蛋白分子，darp蛋白，受体胞外域，适体或结合肽。在实施方式中，治疗性蛋白质例如通过可降解的接头(例如二硫键接头)与纳米颗粒共价偶联(例如交联)。因此，本文公开的方法和组合物可为细胞疗法(例如免疫疗法)提供显著益处。定义某些术语在下文中定义。在整个申请中提供了其他定义。本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或一个以上的(即至少一个)该冠词语法上的宾语。术语“一种”或“一个”当与“包含”在本文中联用时，可表示“一个”，但也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或多于一个”的意思一致。如本文所用，“约”和“近似”通常表示在考虑测量的性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差度。示例性误差程度在给定值范围的20％(％)内，通常在10％内，更通常在5％内。术语“自体的”是指来自个体的任何材料，后来将其重新引入同一个体。术语“同种异体的”是指衍生自与引入材料的个体相同物种的不同动物的任何材料。本文使用的术语“获取”或“获得”是指得到物理实体(例如，样品，细胞或细胞群，多肽，核酸或序列)或值，例如，数值的过程，该过程通过“直接获取”或“间接获取”物理实体或值实现。在一个实施方式中，获得是指得到或收获细胞或细胞群(例如，如本文所述的免疫效应细胞或群)。“直接获取”意指执行过程(例如，执行合成或分析或纯化方法)以获得物理实体或值。“间接获取”是指从另一方或来源(例如，直接获得物理实体或值的第三方实验室)接收物理实体或值。如本文所用的术语“免疫细胞”是指参与免疫应答的细胞，例如促进免疫应答。在一些实施方式中，免疫细胞是免疫效应细胞。免疫效应细胞的示例包括但不限于t细胞，例如cd4+和cd8+t细胞，α/βt细胞和γ/δt细胞，b细胞，自然杀伤(nk)细胞，自然杀伤t(nkt)细胞和肥大细胞。“免疫细胞”还指参与免疫应答的细胞的修饰形式，例如，修饰的nk细胞，包括nk细胞系nk-92(atcc目录号crl-2407)，hank(表达高亲和力fc受体fcγriiia(158v)的nk-92变体)和tank(靶向的nk-92细胞，其用表达给定肿瘤抗原的car的基因转染)，例如，如上文klingemann等所述。如本文所用的“细胞毒性t淋巴细胞”(ctl)是指具有杀死靶细胞能力的t细胞。当发生以下两个步骤时可以发生ctl活化：1)靶细胞上的抗原结合的mhc分子和ctl上的t细胞受体之间产生相互作用；2)通过共刺激分子与t细胞和靶细胞的接合而产生共刺激信号。然后，ctl识别靶细胞上的特异性抗原并诱导这些靶细胞的破坏，例如通过细胞裂解。“肿瘤浸润淋巴细胞”(til)在本文中用于指已迁移到肿瘤中的淋巴细胞。在实施方式中，til可以是处于成熟或分化的不同阶段的细胞，例如，til可以包括ctl，tregs和/或效应记忆t细胞，以及其他类型的淋巴细胞。术语“同源的”或“相同性”是指两个聚合分子之间的亚基序列相同性，例如两个核酸分子之间，例如两个dna分子或两个rna分子之间，或两个多肽分子之间。当两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个dna分子中的每一个中的位置被腺嘌呤占据，那么它们在该位置是同源的或相同的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数量的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，长度为10个亚基的聚合物中的5个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则两个序列是90％同源的。如本文所用，“因子分子”是指全长天然存在的野生型分子，以及具有天然存在的分子的至少10％活性的变体，例如功能变体(例如，截短，片段，突变(例如，基本上相似的序列)或其衍生形式)。在实施方式中，因子分子具有天然存在的分子的至少30％，50％或80％活性。在一个实施方式中，变体与天然存在的野生型分子的相应部分具有70％，80％，90％或95％的同源性。在实施方式中，因子分子是抗体分子，细胞因子分子，受体分子，共刺激分子。在多肽的上下文中，术语“功能变体”是指能够具有天然存在的序列的一种或多种活性的至少10％的多肽。在一些实施方式中，功能变体与天然存在的序列具有显著的氨基酸序列相同性，或由基本相同的核苷酸序列编码，使得功能变体具有天然存在的序列的一种或多种活性。如本文所用的“抗体分子”是指包含至少一种免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。抗体分子包括抗体(例如，全长抗体)和抗体片段。例如，全长抗体是天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的免疫球蛋白(ig)分子(例如，igg抗体)。在实施方式中，抗体分子是指免疫球蛋白分子的免疫活性的抗原结合部分，例如抗体片段。抗体片段，例如功能片段，是抗体的一部分，例如fab，fab′，f(ab′)2，f(ab)2，可变片段(fv)，结构域抗体(dab)或单链可变片段(scfv)。功能性抗体片段结合与由完整(例如全长)抗体识别的同一抗原。术语“抗体片段”或“功能片段”还包括由可变区组成的分离片段，例如由重链和轻链的可变区组成的“fv”片段或其中轻和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scfv蛋白”)。在一些实施方式中，抗体片段不包括没有抗原结合活性的抗体部分，例如fc片段或单个氨基酸残基。示例性抗体分子包括全长抗体和抗体片段，例如dab(结构域抗体)，单链，fab，fab′和f(ab’)2片段，以及单链可变片段(scfv)。在实施方式中，抗体分子是单特异性的，例如，其包含对单个表位的结合特异性。在一些实施方式中，抗体分子是多特异性的，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施方式中，抗体分子是双特异性抗体分子。如本文所用的“双特异性抗体分子”是指对超过一种(例如，两种，三种，四种或更多种)表位和/或抗原具有特异性的抗体分子。如本文所用，“细胞因子分子”是指天然存在的野生型细胞因子的全长，片段或变体(包括其具有天然存在的细胞因子分子的至少10％活性的片段和功能变体)。在实施方式中，细胞因子分子具有天然存在的分子的至少30％，50％或80％的活性，例如免疫调节活性。在实施方式中，细胞因子分子还包含任选地，与免疫球蛋白fc区偶联的受体结构域，例如，细胞因子受体结构域。在其他实施方式中，细胞因子分子与免疫球蛋白fc区偶联。在一些实施方式中，细胞因子分子与抗体分子(例如，免疫球蛋白fab或scfv片段，fab片段，fab2片段或亲和体片段或衍生物，例如，sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段，单结构域抗体，双特异性抗体或多特异性抗体)偶联。如本文所用的“细胞因子激动剂”可包括细胞因子受体的激动剂，例如针对细胞因子受体的抗体分子(例如，激动性抗体)，其引发天然存在的细胞因子的至少一种活性。“样品”或“组织样品”是指从对象或患者的组织或体液获得的生物样品。组织样品的来源可以是来自新鲜，冷冻和/或保存的器官，组织样品，活组织检查或抽吸物的实体组织；血液或任何血液成分(例如血清，血浆)；骨髓或任何骨髓成分；体液如尿液，脑脊髓液，全血，血浆和血清。样品可包括非细胞部分(例如，尿液，血浆，血清或其他非细胞体液)。在其他实施方式中，从个体获得样品的体液包含血液(例如全血)。术语“对象”包括可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物，人)。在一个实施方式中，对象是患者，例如需要免疫细胞疗法的患者。在另一个实施方式中，对象是供体，例如，免疫细胞的同种异体供体，例如，用于同种异体移植。术语“基本上纯化的细胞”是指基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下通常相关的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经与天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在一些方面，细胞在体外培养。在其他方面，细胞不在体外培养。在整个说明书中提供了其他定义。保留剂在一些实施方式中，保留剂是蛋白质，其促进，例如，保留或增强以下一种或多种：有核细胞(例如，免疫细胞)的活力，有核细胞增殖的能力，或有核细胞的另一种生物学活性，例如细胞毒活性，有核细胞的活化，分泌因子(例如细胞因子，例如促炎细胞因子)的能力。在一个实施方式中，保留剂促进分泌干扰素γ的能力。在实施方式中，所述保留剂选自一种或多种(例如，2，3，4，5或更多种)治疗性或生物活性蛋白质，例如一种或多种细胞因子分子(例如，免疫刺激性细胞因子，例如il-15，il-2，il-7和il-21，包括其变体，例如突变体形式，或细胞因子复合物，例如本文所述的il-15复合物)。在一些实施方式中，细胞因子分子促进例如，免疫效应细胞如t或nk细胞的增殖。在其他实施方式中，保留剂是生长因子。在其他实施方式中，保留剂包括分子，例如激动剂，例如针对共刺激分子的抗体分子或配体，例如cdl37的激动剂，ox40，cd28，gitr，vista，cd40，或cd3。在实施方式中，保留剂包括t细胞的激动剂，例如激动性抗体或其片段或共刺激分子的活化剂/激动剂。在实施方式中，t细胞的激动剂包含或是共刺激分子。共刺激分子是需要的细胞表面分子，其增强淋巴细胞(例如t细胞)对抗原的有效反应。在实施方式中，共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的分子。不希望受理论束缚，据信共刺激增强t细胞的扩增，存活和效应功能(例如，增强t细胞持久性和/或抗癌活性。参见，例如，song等，blood.2012；119(3)：696-706)。示例性共刺激分子包括但不限于cd28，icos(cd278)，btla，light，hvem(lightr)，cd160(by55)，ox40，cd27，cd2，cd7，cd40，cd30，4-1bb(cd137)，icam-1，b7-1，toll样受体，lfa-1(cd11a/cd18)，gitr，baffr，b7-h3，信号传导淋巴细胞活化分子(slam蛋白)，slamf7，slam(slamf1，cd150，ipo-3)，slamf4(cd244，2b4)，整联蛋白，il2rβ，itga4，mhci类分子，tnf受体，cd49d，cd49f，lfa-1，cd29，cd18，tnfr2，cd84，rankl，cd229，cd69，cd100(sema4d)和slamf6(ntb-a，ly108)。在一些实施方式中，保留剂包括针对共刺激分子的激动剂(例如，抗体分子或激动剂配体)，例如cd137的激动剂，ox40，cd28，gitr，vista，cd40，或cd3。在一些实施方式中，保留剂包括融合物，例如细胞因子分子，生长因子或共刺激分子与免疫球蛋白fc区的融合物。作为另外一种选择或组合，保留剂包括以下一种或多种：抗体分子(例如，免疫球蛋白fab或scfv片段，单结构域抗体，双特异性或多特异性抗体)，人血清白蛋白或其他结合部分，包括例如纤连蛋白分子，darp蛋白，受体胞外域，适体或结合肽。在一些实施方式中，保留剂包括以下一种或多种：鱼精蛋白，壳聚糖碳水化合物，硫酸乙酰肝素蛋白多糖，天然聚合物，多糖，葡聚糖多聚物，纤维素，纤连蛋白，胶原，纤维蛋白或蛋白多糖。在一些实施方式中，保留剂包括一种或多种(例如，2，3，4，5或更多种)治疗性蛋白质，特别是免疫刺激性细胞因子或抗体(例如，il-15，il-2，il-7，il-21，cd3激动剂，或cd137激动剂)，包括这些细胞因子的突变或超激动剂形式，以及此类细胞因子与以下的遗传融合物：免疫球蛋白fc区，免疫球蛋白fab或scfv片段，人血清白蛋白，单结构域抗体，其他细胞因子，双特异性分子，纤连蛋白，darp蛋白，受体胞外域，适体或结合肽。生长因子分子本文所述的方法和组合物(例如纳米颗粒)可包括一种或多种生长因子分子。在实施方式中，生长因子分子是生长因子的全长，片段或变体，例如包含一个或多个突变的生长因子。在实施方式中，生长因子包括骨形态发生蛋白(bmp)，白血病抑制因子(lif)，表皮生长因子(egf)，肝配蛋白(例如，a1，a2，a3，a4，a5，b1，b2或b3)，促红细胞生成素(epo)，成纤维细胞生长因子(例如，fgf1，fgf2，fgf3，fgf4，fgf5，fgf6，fgf7，fgf8，fgf9，fgf10，fgf11，fgf12，fgf13，fgf14，fgf15，fgf16，fgf17，fgf18，fgf19，fgf20，fgf21，fgf22或fgf23)，gdnf家族配体胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)，生长分化因子-9(gdf9)，肝细胞生长因子(hgf)，肝癌衍生生长因子(hdgf)，胰岛素，胰岛素样生长因子(如igf-1或igf-2)，角质形成细胞生长因子(kgf)，迁移刺激因子(msf)，巨噬细胞刺激蛋白(msp)，肌肉生长抑制素(gdf-8)，神经调节蛋白(例如，nrg1，nrg2，nrg3，nrg4)，神经营养因子脑源性神经营养因子(bdnf)，神经生长因子(ngf)，神经营养因子-3(例如nt-3或nt-4)，胎盘生长因子(pgf)，血小板衍生物d生长因子(pdgf)，t细胞生长因子(tcgf)，血小板生成素(tpo，转化生长因子(如tgf-α或tgf-β)，或血管内皮生长因子(vegf)，或片段或其变体。细胞因子分子本文所述的方法和组合物(例如纳米颗粒)可包括一种或多种细胞因子分子。在实施方式中，细胞因子分子是细胞因子的全长，片段或变体，例如包含一个或多个突变的细胞因子。在一些实施方式中，细胞因子分子包含选自以下的细胞因子：白细胞介素-1α(il-1α)，白细胞介素-1β(il-1β)，白细胞介素-2(il-2)，白细胞介素-4(il-4)，白细胞介素-5(il-5)，白细胞介素-6(il-6)，白细胞介素-7(il-7)，白细胞介素-12(il-12)，白细胞介素-15(il-15)，白细胞介素-17(il-17)，白细胞介素-18(il-18)，白细胞介素-21(il-21)，白细胞介素-23(il-23)，干扰素(ifn)α，ifnβ，ifnγ，肿瘤坏死因子α，gm-csf，gcsf或其片段或变体，或任何上述细胞因子的组合。在其他实施方式中，细胞因子分子选自白细胞介素-2(il-2)，白细胞介素-7(il-7)，白细胞介素-12(il-12)，白细胞介素-15(il-15)，白细胞介素-18(il-18)，白细胞介素-21(il-21)，白细胞介素-23(il-23)或干扰素γ，或其片段或变体，或任何上述细胞因子的组合。细胞因子分子可以是单体或二聚体。在实施方式中，细胞因子分子还包含受体结构域，例如细胞因子受体结构域。在一个实施方式中，细胞因子分子包含如本文所述的il-15受体或其片段(例如，il-15受体α的细胞外il-15结合结构域)。在一些实施方式中，细胞因子分子是il-15分子，例如il-15或如本文所述的il-15超激动剂。如本文所用，与天然存在的细胞因子相比，细胞因子分子的“超激动剂”形式显示出增加的活性，例如增加至少10％，20％，30％。示例性超级激动剂是il-15sa。在一些实施方式中，il-15sa包含il-15和il-15受体的il-15结合片段，例如il-15受体α或其il-15结合片段的复合物，例如，本文所述。在一些实施方式中，细胞因子分子还包含抗体分子(例如，免疫球蛋白fab或scfv片段，fab片段，fab2片段或亲和体片段或衍生物，例如，sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段，单结构域抗体，双特异性抗体或多特异性抗体)。在一个实施方式中，细胞因子分子还包含免疫球蛋白fc或fab。在一些实施方式中，细胞因子分子是il-2分子，例如il-2或il-2-fc。在其他实施方式中，细胞因子激动剂可用于本文公开的方法和组合物中。在实施方式中，细胞因子激动剂是细胞因子受体的激动剂，例如针对细胞因子受体的抗体分子(例如，激动性抗体)，其引发天然存在的细胞因子的至少一种活性。在实施方式中，细胞因子激动剂是细胞因子受体的激动剂，例如针对选自il-15ra或il-21r的细胞因子受体的抗体分子(例如，激动性抗体)。il-15分子在一些实施方式中，细胞因子分子是il-15分子，例如il-15(例如人il-15)的全长，片段或变体。在实施方式中，il-15分子是野生型人il-5，例如，具有seqidno：1的氨基酸序列。在其他实施方式中，il-15分子是人il-5的变体，例如，具有一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方式中，il-15分子包含突变，例如本文seqidno：6中所示的n72d点突变。在一些实施方式中，il-15分子包含与seqidno：6具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列，其中所述序列包含相对于野生型人il-15的n72d突变，并且具有il-15rα结合活性。在其他实施方式中，细胞因子分子还包含受体结构域，例如il-15rα的细胞外结构域，任选地与免疫球蛋白fc或抗体分子偶联。在实施方式中，细胞因子分子是如wo2010/059253中所述的il-15超激动剂(il-15sa)。在一些实施方式中，细胞因子分子包含il-15和与fc融合的可溶性il-15受体α结构域(例如，sil-15ra-fc融合蛋白)，例如，如rubinstein等，pnas103：24p.9166-9171(2006)中所述。il-15分子可以进一步包含多肽，例如细胞因子受体，例如细胞因子受体结构域，和第二异源结构域。在一个实施方式中，异源结构域是免疫球蛋白fc区。在其他实施方式中，异源结构域是抗体分子，例如fab片段，fab2片段，scfv片段或亲和体片段或衍生物，例如，sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段。在一些实施方式中，多肽还包含第三异源结构域。在一些实施方式中，细胞因子受体结构域是第二结构域的n末端，并且在其他实施方式中，细胞因子受体结构域是第二结构域的c末端。野生型il-15受体α序列和该序列的片段和变体如下所述。野生型il-15受体α序列(genbank登录号aai21141.1)野生型il-15受体α胞外结构域(登录号q13261的部分)：同种型cra_dil-15受体α胞外结构域(登录号eaw86418的部分)：野生型il-15受体α序列在上文以seqidno：4提供。il-15受体α含有胞外结构域，23个氨基酸的跨膜区段和39个氨基酸的胞质尾。il-15受体α的胞外结构域以seqidno：3提供。在其他实施方式中，可以使用il-15激动剂。例如，il-15受体的激动剂，例如il-15受体的抗体分子(例如，激动性抗体)，其引发天然存在的细胞因子的至少一种活性。在实施方式中，il-15受体或其片段来自人或非人动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类动物。本文的组合物和方法可包含il-15rα的一部分，例如il-15rα的寿司结构域。在一些实施方式中，多肽包含寿司结构域和第二异源结构域。在一些实施方式中，多肽还包含第三异源结构域。在一些实施方式中，寿司结构域是第二结构域的n末端，并且在其他实施方式中，寿司结构域是第二结构域的c末端。在实施方式中，第二结构域包含fc结构域。il-15受体α序列的片段和变体如下。最小寿司结构域，野生型：延伸的寿司结构域，野生型：最小寿司结构域，l77i：延伸的寿司结构域，l77i：寿司结构域的野生型和l77i突变体形式在本文所述的一种或多种测定中显示出相似的活性。野生型il-15受体α序列在本文中以seqidno：2提供。il-15受体α含有胞外结构域，23个氨基酸的跨膜区段，和39个氨基酸的胞质尾。il-15受体α的胞外结构域以seqidno：3提供。il-15受体α的胞外结构域包含称为寿司结构域的结构域，其结合il-15。寿司结构域以62个氨基酸的最小结构域(seqidno：7)和65个氨基酸的延伸结构域(seqidno：8)提供，其包含最小结构域。如本文所述的寿司结构域可包含相对于野生型寿司结构域的一个或多个突变。例如，il-15ra的残基77是野生型基因中的亮氨酸，但可以突变为异亮氨酸(l77i)。因此，包含l77i的最小寿司结构域(编号指seqidno：2的野生型il-15ra)以seqidno：9提供。包含l77i的延伸寿司结构域(编号指seqidno：4的野生型il-15ra)以seqidno：10提供。在一些实施方式中，多肽的il-15rα部分由seqidno：3的62-171个氨基酸或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的相同性，并具有il-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，多肽的il-15rα部分由seqidno：3的65-171个氨基酸组成或由与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的相同性，并具有il-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，多肽的il-15rα部分由seqidno：3的至多171个氨基酸组成或由与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的相同性，并具有il-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，多肽的il-15rα部分由seqidno：3的62-171，62-160，62-150，62-140，62-130，62-120，62-110，62-100，62-90，62-80，62-70，65-171，65-160，65-150，65-140，65-130，65-120，65-110，65-100，65-90，65-80或65-70个氨基酸组成或由与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并且具有il-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，多肽的il-15rα部分由seqidno：3的62-171，62-160，62-150，62-140，62-130，62-120，62-110，62-100，62-90，62-80，62-70，65-171，65-160，65-150，65-140，65-130，65-120，65-110，65-100，65-90，65-80或65-70个氨基酸组成。在一些实施方式中，寿司结构域由seqidno：7或seqidno：8的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，多肽的il-15rα部分由seqidno：3的62-171个氨基酸组成或由相对于其具有最多1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35或40个的修饰(例如，取代)并且具有il-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，多肽的il-15rα部分由seqidno：3的多达171个氨基酸组成或由相对于其具有多达1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35或40个的修饰(例如，取代)并且具有il-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，多肽的il-15ra部分由seqidno：3的62-171，62-160，62-150，62-140，62-130，62-120，62-110，62-100，62-90，62-80，62-70，65-171，65-160，65-150，65-140，65-130，65-120，65-110，65-100，65-90，65-80或65-70个氨基酸组成或由相对于其具有最多1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35或40个修饰(例如，取代)并具有il-15结合活性的序列组成。在一些实施方式中，多肽的il-15rα部分包含seqidno：3的至少62个氨基酸或包含与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性并具有il-15结合活性的序列，其中所述序列包含相对于野生型il-15ra的l77i突变。在一些实施方式中，多肽的il-15rα部分包含seqidno：3的至少65个氨基酸或包含与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性并具有il-15结合活性的序列，其中所述序列包含相对于野生型il-15ra的l77i突变。在一些实施方式中，多肽的il-15rα部分包含seqidno：3的一部分或包含与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99相同性并具有il-15结合活性的序列，其中所述序列包含相对于野生型il-15ra的l77i突变。在一些实施方式中，寿司结构域包含seqidno：9或seqidno：10的氨基酸序列。在一些实施方式中，多肽的il-15rα部分包含seqidno：3的至少62个氨基酸或包含相对于其具有最多1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35或40个修饰(例如，取代)并且具有il-15结合活性的序列，其中所述序列包含相对于野生型il-15ra的l77i突变。在一些实施方式中，多肽的il-15rα部分包含seqidno：3的一部分或包含相对于其具有最多1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20个修饰(例如，取代)并且具有il-15结合活性的序列，其中所述序列包含相对于野生il-15ra的l77i突变。在实施方式中，多肽的il-15rα部分包含seqidno：3的至少10，20，30，40，50，60，62，65，70，80，90，100，110，120，130，140，150或160个连续氨基酸，或相对于其具有l77i突变的序列。在实施方式中，多肽的il-15rα部分由seqidno：3的10-20，20-30，30-40，40-50，50-60，60-70，70-80，80-90，90-100，100-110，110-120，120-130，130-140，140-150，150-160或160-170个连续氨基酸组成，或由相对于其具有l77i突变的序列组成。在实施方式中，寿司结构域是来自人或非人动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类动物的寿司结构域。在实施方式中，组合物包含，例如，纳米颗粒和/或保留剂，其包含il-15复合物，il-15复合物包含与多肽共价或非共价复合的il-15分子，其中该多肽包含第一结构域，其包含：i)seqidno：3的野生型il-15受体α胞外结构域的至少62个氨基酸，其中多肽的最长连续il-15受体α序列长度不超过171个氨基酸，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性并具有il-15结合活性的序列；ii)seqidno：3的至少62个氨基酸，其中多肽的最长连续il-15受体α序列长度不超过171个氨基酸，或与seqidno：3的相应序列相差不超过1，2，3，4，或5个氨基酸并具有il-15结合活性的序列；iii)seqidno：3的至少62个氨基酸，其中多肽的最长连续il-15受体α序列长度不超过171个氨基酸，并具有il-15结合活性；iv)最小寿司结构域的活性片段，例如il-15结合片段，和seqidno：3的不超过171个连续氨基酸残基，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列；v)最小寿司结构域的活性片段，例如il-15结合片段，和seqidno：3的不超过171个连续氨基酸残基，或与seqidno：3的相应序列相差不超过1，2，3，4，或5个氨基酸的序列；vi)最小寿司结构域的活性片段，例如il-15结合片段，和seqidno：3的不超过171个连续氨基酸残基；vii)延伸的寿司结构域的活性片段，例如il-15结合片段，和seqidno：3的不超过171个连续氨基酸残基，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列；viii)延伸的寿司结构域的活性片段，例如il-15结合片段，和seqidno：3的不超过171个连续氨基酸残基，或与seqidno：3的相应序列相差不超过1，2，3，4，或5个氨基酸的序列；ix)延伸寿司结构域的活性片段，例如il-15结合片段，和seqidno：3不超过171个连续氨基酸残基；或x)seqidno：3的至少62个氨基酸，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并且具有il-15结合活性的序列，其中氨基酸77(编号是指seqidno：4的野生型il-15受体α)是异亮氨酸；xi)seqidno：3的至少62个氨基酸，或与seqidno：3的相应序列相差不超过1，2，3，4或5个氨基酸并且具有il-15结合活性的序列，其中氨基酸77是异亮氨酸；xii)seqidno：3的至少62个氨基酸，具有il-15结合活性，并且其中氨基酸77是异亮氨酸；xiii)最小或延伸的寿司结构域的活性片段，例如il-15结合片段，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的序列，其中氨基酸77是异亮氨酸；xiv)最小或延伸的寿司结构域的活性片段，例如il-15结合片段，或与seqidno：3的相应序列相差不超过1，2，3，4或5个氨基酸的序列，其中氨基酸77是异亮氨酸；或xv)最小或延伸的寿司结构域的活性片段，例如il-15结合片段，其中氨基酸77是异亮氨酸。和任选地，第二异源结构域，例如fc结构域或fab结构域。在一些实施方式中，包含il-15受体或其片段的多肽包含fc结构域。在实施方式中，fc结构域是效应减毒的fc结构域，例如人igg2fc结构域，例如seqidno：11的人igg2结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的相同性的氨基酸序列。在实施方式中，例如，与野生型igg1fc结构域相比，例如，与seqidno：12的野生型igg1fc结构域相比，效应-减毒的fc结构域具有降低的效应活性。在一些实施方式中，效应活性包括抗体依赖性细胞毒性(adcc)。在实施方式中，在adcc测定中，例如，与seqidno：12的野生型igg1fc结构域相比，效应活性降低10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％。在一些实施方式中，效应活性包括补体依赖性细胞毒性(cdc)。在实施方式中，在cdc测定，例如armor等，“重组人igg分子缺乏fcγ受体i结合和单核细胞触发活性(recombinanthumaniggmoleculeslackingfcgammareceptoribindingandmonocytetriggeringactivities.)”eurjimmunol(1999)29：2613-24中描述的cdc测定中，例如，与seqidno：12的野生型igg1fc结构域相比，效应活性降低10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％。在一些实施方式中，fc结构域包含seqidno：12的igg1fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，fc结构域包含seqidno：13的igg2恒定区或其片段，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，fc结构域包含seqidno：14的igg2dafc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在实施方式中，fc结构域包含使用kabat编号系统的a330s和p331s突变中的一种或两种。在实施方式中，fc结构域是例如armor等，“重组人igg分子缺乏fcγ受体i结合和单核细胞触发活性(recombinanthumaniggmoleculeslackingfcgammareceptoribindingandmonocytetriggeringactivities.)”eurjimmunol(1999)29：2613-24中所述的。在一些实施方式中，fc结构域具有二聚化活性。在一些实施方式中，fc结构域是igg结构域，例如igg1，igg2，igg3或igg4fc结构域。在一些实施方式中，fc结构域包含ch2结构域和ch3结构域。在一些实施方式中，纳米颗粒包含具有seqidno：15序列或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施方式中，纳米颗粒包含本文所述的寿司结构域(例如，在seqidno：7中)和本文所述的fc结构域，例如igg2fc结构域(例如，seqidno：11或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列)。在一些实施方式中，纳米颗粒包含seqidno：7的寿司结构域和本文描述的fc结构域，例如igg1fc结构域，例如seqidno：12的fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒包含seqidno：8的寿司结构域和igg2fc结构域，例如seqidno：11的fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒包含seqidno：8的寿司结构域和igg1fc结构域，例如seqidno：12的fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒包含seqidno：7的寿司结构域和seqidno：14的igg2dafc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒包含seqidno：8的寿司结构域和seqidno：14的igg2dafc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，纳米颗粒包含具有seqidno：15序列的寿司-igg2da-fc蛋白或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性的氨基酸序列。在实施方式中，il-15分子是国际申请wo2017/027843中描述的分子，其通过引用全文并入本文。在一些实施方式中，保留剂包含il-15sa。人il-15与可溶性人il-15ra的组合产生称为il-15超级激动剂(il-15sa)的复合物，其具有比单独的人il-15更高的生物活性。可溶性人il-15ra以及细胞外结构域的截短形式已描述于例如(wei等，2001，j.ofimmunol.167：277-282)。人il-15ra的氨基酸序列如本文seqidno：2所示。因此，本公开内容的一些方面涉及il-15sa，其包含人il-15和可溶性人il-15r分子的复合物。在本公开的一些方面，il-15sa包含人il-15和可溶性人il-15ra的复合物，其包含全部或部分胞外结构域，没有跨膜或胞质结构域。在本公开的一些方面，il-15sa包含人il-15和可溶性人il－15ra的复合物，其包含完整的胞外结构域或保留il-15结合活性的胞外结构域的截短形式。本公开的一些方面涉及il-15sa，其包含人il-15和可溶性人il-15ra的复合物，其包含保留il-15结合活性的截短形式的胞外结构域，例如人il-15ra的氨基酸1-60，1-61，1-62，1-63，1-64或1-65。在本公开的一些方面，il-15sa包含人il-15和可溶性人il-15ra的复合物，其包含保留il-15结合活性的截短形式的胞外结构域，例如人il-15ra的氨基酸1-80，1-81，1-82，1-83，1-84或1-85。在本公开的一些方面，1l-15sa包含人il-15和可溶性人il-15ra的复合物，其包含保留il-15结合活性的截短形式的胞外结构域，例如人il-15ra的氨基酸1-180，1-181或1-182。本公开的一些方面涉及1l-15sa，其包含人il-15和可溶性人il-15ra的复合物，其包含保留il-15结合活性的截短形式的胞外结构域并包含寿司结构域。保留il-15活性并包含寿司结构域的截短形式的可溶性人il-15ra可用于本公开的il-15sa。已经描述了人il-15的突变形式，例如在zhu等，2009jofimmunol.183：3598。因此，本公开内容提供任何前述il-15sa复合物，其中人il-15是野生型或突变体il-15，其包含一个或多个突变(例如，一个或多个氨基酸取代，添加或缺失)。相对于用于本公开内容的il-15sa的野生型il-15具有增加的生物活性的示例性il-15突变体包含在氨基酸72处的天冬酰胺至天冬氨酸取代(n72d)。在任何前述实施方式中，本公开涉及包含可溶性人il-15ra的复合物，所述可溶性人il-15ra表达为融合蛋白，例如与il-15的本文所述的fc融合物(例如，人igg1fc)。在一些实施方式中，il-15sa包含与两种人il-15分子复合的二聚人il-15rafc融合蛋白(例如，人igg1fc)。在一些实施方式中，il-15sa细胞因子复合物包含il-15分子，其包含本文seqidno：1或seqidno：6所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，il-15sa细胞因子复合物包含il-15分子，其包含国际申请wo2017/027843的seqidno：4或seqidno：5中所示的氨基酸序列，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，il-15sa细胞因子复合物包含可溶性il-15ra分子，其包含本文的seqidno：7，seqidno：8，seqidno：9或seqidno：10的序列。在一些实施方式中，il-15sa细胞因子复合物包含可溶性il-15ra分子，其包含国际申请wo2017/027843的seqidno：3，seqidno：7或seqidno：8的序列，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，il-15sa是细胞因子复合物，其包含与两个il-15分子复合的二聚il-15rafc融合蛋白。在一些实施方式中，il-15-sa包含二聚il-15rasu(寿司结构域)/fc(seqidno：5)和两个il-15n72d(seqidno：6)分子。在实施方式中，il-15sa包含alt-803，如us20140134128中所述，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，il-15sa包含二聚il-15rasu/fc分子(seqidno：5)和两个il-15分子(seqidno：1)。在一些实施方式中，il-15sa包含可溶性il-15ra分子(例如，seqidno：7或seqidno：8)和两个il-15分子(例如，seqidno：1或seqidno：6)。颗粒，例如，纳米凝胶组合物，例如纳米颗粒(例如纳米凝胶)可包含一种或多种本文公开的蛋白质(例如，生物活性蛋白质，例如治疗性蛋白质)。示例性纳米颗粒(例如，纳米凝胶)及其制备方法描述于题为“用于局部化药剂递送的方法和组合物”的国际公开申请wo2010/059253和题为“无载体生物活性蛋白质纳米颗粒”的国际公开申请wo2015/048498，这两个申请的内容通过引用全文纳入本文。如本文所用的“颗粒”包含多种(例如，至少2种)蛋白质，例如本文所述的多种细胞因子分子。在一些实施方式中，颗粒是直径为1-1000纳米(nm)的纳米颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒的直径范围为20-750nm，或20-500nm，或20-250nm。在一些实施方式中，直径的范围为50-750nm，或50-500nm，或50-250nm，或约100-300nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的直径为约100，约150，约200nm，约250nm或约300nm。在实施方式中，纳米颗粒基本上是球形的。在实施方式中，纳米颗粒具有30nm至1200nm之间，40nm至1100nm之间，50nm至1000纳米之间，例如50-500nm之间，更典型地，在70到400nm之间的平均流体动力学直径(例如，通过动态光散射测量)。在一些实施方式中，纳米颗粒包含纳米凝胶或由其组成，例如本文所述的纳米凝胶。在实施方式中，纳米颗粒中的蛋白质彼此和/或与颗粒的第二组分偶联，例如，共价偶联或交联(例如，通过可降解接头可逆连接的蛋白质)。在实施方式中，蛋白质存在于聚合物或二氧化硅中，例如存在于聚合物基或二氧化硅壳中。在实施方式中，纳米颗粒包括如本文所述的纳米壳。在实施方式中，蛋白质通过可降解接头可逆地连接至官能团或聚合物，或“可逆地修饰”。在一些实施方式中，通过使蛋白质偶联物的官能团(例如，硅烷)在催化剂(例如naf)存在下与交联剂(例如，硅烷-peg-硅烷)聚合，可以形成纳米壳。蛋白质纳米颗粒的示例是“蛋白纳米凝胶”，其是指通过可降解接头彼此交联(例如，可逆地和共价交联)的多种蛋白质(参见例如wo2015/048498的图9a)。在一些实施方式中，纳米凝胶的蛋白质与聚合物(例如亲水性聚合物，例如聚乙二醇(peg))交联(例如，可逆地和共价交联)；参见例如wo2015/048498的图9a)。在一些实施方式中，聚合物可以交联到纳米凝胶的表面(例如，交联到在纳米凝胶表面暴露的蛋白质)。蛋白纳米凝胶的尺寸可以通过至少两种方式确定：基于其“干燥尺寸”和基于其“流体动力学尺寸”。蛋白纳米凝胶的“干燥尺寸”是指作为干燥固体的纳米凝胶的直径。蛋白纳米凝胶的“流体动力学尺寸”是指纳米凝胶作为水合凝胶(例如，水性缓冲液中的纳米凝胶)的直径。纳米凝胶的干燥尺寸可以，例如，通过透射电子显微镜确定，而纳米凝胶的流体动力学尺寸可以，例如，通过动态光散射来确定。在一些实施方式中，纳米凝胶的干燥尺寸小于400nm。在一些实施方式中，纳米凝胶的干燥尺寸小于300nm，小于200nm，小于100nm，小于80nm，小于75nm，小于70nm，小于65nm或小于60nm。在一些实施方式中，纳米凝胶的干燥尺寸为40至90nm，40至80nm，40至70nm，40至60nm，50至90nm，60至80nm，50至70nm或50至60nm。在一些实施方式中，纳米凝胶的干燥尺寸为40nm，45nm，50nm，55nm，60nm，65nm，70nm，75nm，80nm，85nm，90nm或95nm。在一些实施方式中，多个纳米颗粒内的纳米颗粒(例如，纳米凝胶)的平均干燥尺寸小于400nm。在一些实施方式中，这样的多个纳米颗粒的平均干燥尺寸变化不超过5％或10％。在一些实施方式中，多个纳米颗粒内的纳米颗粒(例如，纳米凝胶)的平均干燥尺寸小于300nm，小于200nm，小于100nm，小于80nm，小于75nm，小于70nm，小于65nm，或小于60nm。在一些实施方式中，多个纳米颗粒内的纳米颗粒(例如，纳米凝胶)的平均干燥尺寸为40至90nm，40至80nm，40至70nm，40至60nm，50至90nm，60至80nm，50至70nm，或50至60nm。在一些实施方式中，纳米凝胶的干燥尺寸为40nm，45nm，50nm，55nm，60nm，65nm，70nm，75nm，80nm，85nm，90nm或95nm。在一些实施方式中，多个纳米颗粒内的纳米颗粒(例如，纳米凝胶)的平均流体动力学尺寸小于1000nm。在一些实施方式中，这样的多个纳米颗粒中纳米颗粒的平均流体动力学尺寸具有通过动态光散射测量的小于0.35的多分散指数。在一些实施方式中，多个纳米颗粒中纳米颗粒(例如，纳米凝胶)的平均流体动力学尺寸小于500nm，小于400nm，小于300nm，小于200nm或小于100nm。在一些实施方式中，多个纳米颗粒中纳米颗粒(例如，纳米凝胶)的平均流体动力学尺寸为400至500nm，300至400nm，200至300nm，100至200nm，50至100nm。在一些实施方式中，生物活性蛋白质-聚合物纳米凝胶的干燥尺寸直径小于300nm。例如，生物活性蛋白质-聚合物纳米凝胶的干燥尺寸可以是直径50-200nm。在一些实施方式中，如本文提供的多个蛋白质纳米凝胶具有相似的干燥尺寸(例如，其中70％的纳米凝胶在各自直径的10％，20％，30％，40％，50％或100％之内，并且通过动态光散射测量具有小于0.35的多分散指数)。在一些实施方式中，生物活性蛋白质-聚合物纳米凝胶的流体动力学尺寸直径小于150nm。例如，生物活性蛋白质-聚合物纳米凝胶的流体动力学尺寸可以是直径50-100nm。在一些实施方式中，如本文提供的多个蛋白纳米凝胶具有相似的流体动力学尺寸(例如，其中70％的纳米凝胶在彼此10％，20％，30％，40％，50％或100％的直径范围内并具有通过动态光散射测量的小于0.35的多分散指数)。在一些实施方式中，纳米颗粒以干燥的固体形式，例如冻干形式提供。在其他实施方式中，纳米颗粒以水合形式，例如以水溶液或其他液体溶液形式提供。在其他实施方式中，纳米颗粒以冷冻形式提供。在一些实施方式中，纳米颗粒的蛋白质通过可降解接头(例如，二硫键接头)彼此可逆地连接，使得在生理条件下，接头降解并释放完整的生物活性蛋白质。在其他实施方式中，纳米颗粒的蛋白质通过可降解接头可逆地连接到官能团，使得在生理条件下，接头降解并释放完整的生物活性蛋白质。在每种情况下，蛋白质被认为是可逆修饰的，如下所述。本文中“与另一种蛋白质可逆连接”的蛋白质是指通过可降解接头与另一种蛋白质连接(例如，共价连接)的蛋白质。认为这些蛋白质通过可降解接头彼此连接(例如，交联)。在一些实施方式中，纳米颗粒(例如，纳米凝胶)含有单一(例如，单一类型)生物活性蛋白质(例如，il-15，il-15-fc，il-15fab片段，il-2或il-2-fc，fab片段，fab2片段，scfv片段或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段，重链抗体片段等)，而在其他实施方式中，纳米颗粒包含多于一种(例如，2，3，4，5或更多种)生物活性蛋白质(例如，不同蛋白质的组合，例如il-2和il-15(或il-15sa)或il-15和il-21)。例如，蛋白纳米凝胶可以含有蛋白质a和蛋白质b的组合，其中蛋白质a与蛋白质a连接，蛋白质a与蛋白质b连接和/或蛋白质b与蛋白质b连接。“与官能团可逆连接的”蛋白质或“可逆修饰的”蛋白质在本文中是指通过可降解接头与官能团连接(例如，共价连接)的蛋白质。这种蛋白质在本文中可称为“蛋白质偶联物”或“可逆修饰的蛋白质偶联物”-这些术语在本文中可互换使用。应当理解，蛋白质和聚合物各自含有可通过可逆接头(例如，可降解接头，例如二硫键接头)与蛋白质连接的官能团。如本文提供的蛋白质偶联物和可逆修饰的蛋白质的示例包括但不限于，与另一种蛋白质可逆连接(例如，通过可降解的接头)的蛋白质，与聚合物可逆连接的蛋白质，和与另一种官能团可逆地连接的蛋白质。应理解，术语“蛋白质”包括融合蛋白。可降解接头用于本文所述纳米颗粒的合适的可降解接头(例如交联剂)可包含例如两个n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯基团，其通过对还原性生理环境敏感的含有二硫化物的柔性接头或对酸性生理环境敏感(ph＜7，例如，ph值为4-5，5-6或6至小于7，例如6.9)的可水解接头，或对存在于生物培养基中的一种或多种酶，例如肿瘤微环境中的蛋白酶，例如存在于肿瘤微环境或发炎组织中的基质金属蛋白酶(例如基质金属蛋白酶2(mmp2)或基质金属蛋白酶9(mmp9))敏感的蛋白酶敏感接头连接在一起。对还原性生理环境敏感的交联剂是例如具有含二硫化物的接头的交联剂，其通过nhs基团的存在与蛋白质上的胺基团反应，所述nhs基团将蛋白质交联成高密度蛋白纳米凝胶。本文实施例中使用的交联剂包括双[2-(n-琥珀酰亚胺基-氧基羰基氧基)乙基]二硫化物。在一些实施方式中，可降解接头包含至少一种n-羟基琥珀酰亚胺酯。在一些实施方式中，可降解接头是氧化还原反应性接头。在一些实施方式中，氧化还原反应性接头包含二硫键。在一些实施方式中，本文提供的可降解接头包含至少一种n-羟基琥珀酰亚胺酯，其能够在中性ph(例如，约6至约8，或约7)下与蛋白质反应而基本上不使蛋白质变性。在一些实施方式中，可降解接头是“氧化还原反应性”接头，意味着它们在生理条件下(例如，20-40℃和/或ph4-8)在还原剂(例如谷胱甘肽，gsh)存在下降解，从而从与其可逆连接的化合物中释放完整的蛋白质。根据本公开使用的可降解接头的示例如下：式i的接头含有二硫化物，其在还原剂存在下裂解。例如，在生理条件下，式i的接头的二硫键被谷胱甘肽切割。蛋白质可以通过任何末端或内部-nh2官能团(例如赖氨酸的侧链)与可降解接头连接(例如，共价连接)。因此，在具有式i的可降解接头的蛋白质的可逆修饰期间形成的中间物质如下：本文还提供了包含式iii的可逆修饰的蛋白质偶联物：接头可以在胺基(例如末端胺或内胺)上与目标蛋白质偶联。内胺包括侧链胺，例如赖氨酸胺。本公开还提供了包括式iii的蛋白质偶联物：其中蛋白质是细胞因子分子，例如il-2或il-15分子。通过用硅烷可逆修饰的蛋白质的聚合形成具有高掺入效率(例如，＞约90％)和高蛋白质药物负载效率(例如，＞约80％)的基于二氧化硅的纳米颗粒。因此，本文提供了通过式iii的蛋白质偶联物与交联剂(例如硅烷-peg-硅烷聚合物)聚合形成的纳米颗粒。在其他实施方式中，蛋白质可以通过酶敏感性接头连接。在实施方式中，接头通过酶(例如蛋白酶或酯酶)的作用降解或水解。在一些实施方式中，接头包含通过选自以下的酶切割(例如活化)的底物肽：基质金属蛋白酶mmp-1，mmp-2，mmp-3，mmp-8，mmp-9，mmp-14，纤溶酶，psa，psma，组织蛋白酶d，组织蛋白酶k，组织蛋白酶s，adam10，adam12，adamts，半胱天冬酶-1，半胱天冬酶-2，半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-4，半胱天冬酶-5，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶-7，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9，半胱天冬酶-10，半胱天冬酶-11，半胱天冬酶-12，半胱天冬酶-13，半胱天冬酶-14或tace。在实施方式中，接头包括美国专利申请号2015/0087810，美国专利号8,541,203，美国专利号8,580,244中公开的底物序列。在一些实施方式中，接头包含在以下文章之一中公开的序列：vankempen等，eurcancer(2006)42：728-734；desnoyers，l.r.等，scitranslmed(2013)5：207；rice，j.j.等，proteinsci(2006)15：825-836；boulware，k.t.和daugherty，p.s.procnatlacadsciusa(2006)103：7583-7588；和eckhard，u等，matrixbiol(2015)doi：10.1016/i.matbio.2015.09.003(epub)。本文引用的任何出版物的内容在此通过引用明确纳入。本文进一步提供了纳米颗粒的其他方面和实施方式。在一些实施方式中，本文提供的可逆修饰的蛋白质可以形成或自组装成各种纳米颗粒，包括但不限于蛋白质-亲水性聚合物偶联物(例如，用peg可逆修饰)，蛋白质-疏水性聚合物偶联物(例如，可逆修饰的pla或plga)，本体交联蛋白质水凝胶，交联蛋白质纳米凝胶颗粒，具有不同壳材料(例如二氧化硅)的蛋白质纳米胶囊，蛋白质偶联的纳米颗粒(例如，脂质体，胶束，聚合物纳米颗粒，无机纳米颗粒)，例如，如wo2015/048498中所述。同样地，在一些实施方式中，如本文提供的，彼此交联的蛋白质可以形成或可以自组装成蛋白质纳米颗粒。在一些实施方式中，蛋白质纳米颗粒(例如蛋白质纳米凝胶，包括蛋白质-聚合物纳米凝胶)含有载体蛋白质或其他载体分子。载体蛋白通常促进不同分子的扩散和/或转运，并且可以增加纳米颗粒的稳定性和/或增加纳米颗粒在细胞表面上的稳定性，和/或增加纳米颗粒对细胞表面的亲和力。应当理解，如本文所用，术语“载体蛋白”是指不会对蛋白质纳米颗粒的生物活性蛋白质产生不利影响的蛋白质。在一些实施方式中，载体蛋白是惰性蛋白。在一些实施方式中，载体蛋白或载体分子选自白蛋白，鱼精蛋白，壳聚糖碳水化合物，硫酸乙酰肝素蛋白多糖，天然聚合物，多糖，葡聚糖多聚物，纤维素，纤连蛋白，胶原，纤维蛋白或蛋白多糖。因此，在一些实施方式中，载体蛋白不具有生物活性。在一些实施方式中，本文提供了单分散的多个生物活性蛋白质-聚合物颗粒，例如纳米颗粒，例如纳米凝胶。在实施方式中，纳米凝胶的蛋白质通过可降解接头可逆地和共价地彼此交联，并且其中纳米凝胶的蛋白质与聚合物交联。在一些实施方式中，聚合物交联至纳米凝胶的表面(因此，被认为是表面偶联的)。在一些实施方式中，纳米颗粒(例如，纳米凝胶)包含以下，由或基本上由以下组成：(a)一种或多种通过可降解的接头(例如，二硫化物接头)彼此可逆地和共价地交联的生物活性蛋白质和(b)交联到纳米凝胶的表面暴露的蛋白质的聚合物(例如，通过可降解接头可逆地和共价地交联)。在一些实施方式中，彼此交联的蛋白质的重量百分比大于纳米凝胶的75％w/w(例如，大于80％，85％或90％w/w)。如果纳米凝胶具有相对于彼此相似的尺寸(例如，直径)，则多个纳米凝胶被认为在组合物(例如，水性或其他液体组合物)中是“单分散的”，例如通过动态光散射测量的小于0.35，更优选小于0.3，例如小于0.25或小于0.2多分散指数。如果多个纳米凝胶中的尺寸变化不超过5％-10％，则可以认为多个纳米凝胶具有相对于彼此的相同尺寸。本公开的其他方面提供了包含聚合物和至少75％(例如，约80％)w/w的蛋白质的纳米凝胶，所述蛋白质通过可降解接头彼此可逆地和共价地交联。在一些实施方式中，可降解接头是氧化还原反应性接头，例如二硫化物接头(例如，式i)。本公开的其他方面提供了产生多个生物活性蛋白质纳米凝胶的方法，所述方法包括(a)在允许蛋白质彼此通过可降解接头的可逆共价交联的条件下使蛋白质与可降解接头(例如，二硫化物接头)接触，从而产生多个蛋白质纳米凝胶，和(b)在允许聚合物与蛋白质纳米凝胶的蛋白质交联的条件下使蛋白质纳米凝胶与聚合物(例如聚乙二醇)接触，从而产生多个生物活性蛋白质-聚合物纳米凝胶。在一些实施方式中，(a)的条件包括使蛋白质与可降解接头在水性缓冲液中在4℃至25℃的温度下接触。在一些实施方式中，(a)的条件包括使蛋白质与可降解接头在水性缓冲液中接触30分钟至1小时。在一些实施方式中，(b)的条件包括使蛋白质纳米凝胶与聚合物在水性缓冲液中在4℃至25℃的温度下接触。在一些实施方式中，(b)的条件包括使蛋白质纳米凝胶与聚合物在水性缓冲液中接触30分钟至1小时。在一些实施方式中，水性缓冲液包括磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在一些实施方式中，(a)的条件不包括在高于30℃的温度下使蛋白质与可降解接头接触。在一些实施方式中，(b)的条件不包括在大于30℃的温度下使蛋白质纳米凝胶与聚合物接触。在一些实施方式中，(a)的条件不包括使蛋白质与可降解接头在有机溶剂(例如，醇)中接触。在一些实施方式中，(b)的条件不包括使蛋白质纳米凝胶与聚合物在有机溶剂中接触。在一些实施方式中，蛋白质是细胞因子，生长因子，抗体或抗原。例如，蛋白质可以是如本文所述的细胞因子分子。在一些实施方式中，细胞因子分子是il-2分子，例如il-2或il-2-fc。在一些实施方式中，细胞因子分子是il-15分子，例如il-15或il-15sa。在一些实施方式中，可降解接头是氧化还原反应性接头。在一些实施方式中，氧化还原反应性接头包括二硫键。在一些实施方式中，可降解接头包含式i或由式i组成。在一些实施方式中，聚合物是亲水性聚合物。在一些实施方式中，亲水性聚合物包含聚乙二醇(peg)。例如，亲水性聚合物可以是4-臂peg-nh2聚合物。在一些实施方式中，水性缓冲液中蛋白质的浓度为10mg/ml至50mg/ml(例如，10，15，20，25，30，35，40，45或50mg/ml)。在一些实施方式中，多个生物活性蛋白质-聚合物纳米凝胶是单分散的多个生物活性蛋白质-聚合物纳米凝胶。在一些实施方式中，生物活性蛋白质-聚合物纳米凝胶不包括白蛋白。在一些实施方式中，生物活性蛋白质-聚合物纳米凝胶中蛋白质(例如，生物活性蛋白质，交联蛋白质)的重量百分比为至少75％。在一些实施方式中，生物活性蛋白质-聚合物纳米凝胶中蛋白质的重量百分比为至少80％。在一些实施方式中，生物活性蛋白质-聚合物纳米凝胶中蛋白质的重量百分比为至少85％。在一些实施方式中，生物活性蛋白质-聚合物纳米凝胶中蛋白质的重量百分比为至少90％。在一些实施方式中，蛋白质在生理条件下以其天然构象从纳米凝胶释放并且是生物活性的。在一些实施方式中，释放的蛋白质的比活性为在蛋白质通过可降解接头与另一种蛋白质交联之前该蛋白质的比活性的至少50％(例如，至少55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。本公开内容的一些方面提供通过可降解接头可逆地连接至可聚合官能团的蛋白质。此类蛋白质在本文中被认为是可逆修饰的蛋白质。在一些实施方式中，可聚合官能团包含硅烷和/或可交联聚合物。在一些实施方式中，可交联聚合物包含聚(环氧乙烷)，聚乳酸和/或聚(乳酸-共-乙醇酸)。在一些实施方式中，蛋白质通过可降解接头可逆地连接至硅烷。本公开的其他方面提供了多个本文所述的任何可逆修饰的蛋白质。在一些实施方式中，这种多个可逆修饰的蛋白质是交联的。本公开内容的其他实施方式提供了包含聚合物和至少50％w/w蛋白质的纳米颗粒，所述蛋白质通过可降解接头可逆地连接至可聚合官能团。“w/w”在此是指蛋白质的重量对于纳米颗粒(例如纳米凝胶)的重量。如本文所用，“可聚合官能团”是指可以化学反应形成聚合物链或网络的一组原子和键。“聚合物”是指重复单元的链或网络或不同重复单元的混合物。如本文所用，聚合物本身是官能团。根据本发明使用的可聚合官能团的示例包括但不限于硅烷，环氧乙烷，乳酸，丙交酯，乙醇酸，n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺，二氧化硅，聚(环氧乙烷)，聚乳酸，聚(乳酸-共-乙醇酸)，聚谷氨酸，聚赖氨酸，环糊精和葡聚糖壳聚糖。考虑了其他可聚合官能团，并且可以根据本公开内容使用。然而，应该理解，本文所用的“聚合物”不是蛋白质(是非蛋白质)，肽(是非肽)或氨基酸(是非氨基酸)。术语“聚合物”包括“共聚物”。即，聚合物可包含不同官能团的混合物(例如硅烷-peg-硅烷)，包括较短的聚合物或共聚物。官能团通常在蛋白质相容的中性条件下聚合。因此，在一些实施方式中，官能团的聚合在约ph6至约ph8的至少部分水性溶液中发生。例如，官能团的聚合可在ph6，ph6.5，ph7，ph7.5下发生。在一些实施方式中，官能团的聚合在约ph7下发生。在一些实施方式中，聚合反应由氟化钠，氟化钾或任何其他可溶性氟化物催化。可与蛋白质可逆连接和/或用于形成纳米颗粒(例如，纳米胶囊，纳米凝胶，水凝胶)的示例性聚合物包括但不限于脂族聚酯，聚(乳酸)(pla)，聚(乙醇酸)(pga)，乳酸和乙醇酸(plga)，聚羧酸内酯(pcl)，聚酸酐，聚(邻)酯，聚氨酯，聚(丁酸)，聚(戊酸)和聚(丙交酯-共-己内酯)的共聚物天然聚合物，例如藻酸盐和其它多糖，包括葡聚糖和纤维素，胶原，其化学衍生物，包括取代，化学基团的添加，例如烷基，亚烷基，羟基化，氧化和本领域技术人员常规制备的其它修饰，白蛋白和其他亲水蛋白，玉米醇溶蛋白和其他醇溶蛋白和疏水蛋白，其共聚物和混合物。通常，这些材料通过酶水解或体内暴露于水，通过表面或整体侵蚀而降解。考虑了其他聚合物，并且可以根据本公开使用。在一些实施方式中，蛋白质与亲水性聚合物，例如聚乙二醇(peg)，聚乙二醇-b-聚赖氨酸(peg-pll)和/或聚乙二醇-b-聚精氨酸(peg-parg)可逆地连接。本公开的一些实施方式涉及在其表面上包含聚阳离子的纳米颗粒(例如，纳米凝胶)。聚阳离子是在几个位点具有正电荷的分子或化学复合物。通常，聚阳离子具有总体正电荷。根据本发明使用的聚阳离子的示例包括但不限于聚赖氨酸(聚-l-赖氨酸和/或聚-d-赖氨酸)，聚(精氨酸甘油酯琥珀酸酯)(pags，精氨酸基聚合物)，聚乙烯亚胺，聚组氨酸，聚精氨酸，硫酸鱼精蛋白，聚乙二醇-b-聚赖氨酸(peg-pll)或聚乙二醇-g-聚赖氨酸。在一些实施方式中，将聚阳离子添加到纳米凝胶的表面。在一些实施方式中，将聚阳离子(例如，聚乙二醇-b-聚赖氨酸或peg-pll)添加到纳米凝胶的表面。在一些实施方式中，聚阳离子是聚乙二醇-b-聚赖氨酸。在一些实施方式中，将聚阳离子添加至具有或不具有抗cd45抗体的纳米凝胶中。在实施方式中，纳米颗粒包含polyk30。在实施方式中，纳米颗粒包含聚乙二醇(peg)，聚乙二醇-b-聚赖氨酸(peg-pll)或聚乙二醇-b-聚精氨酸(peg-parg)。在实施方式中，纳米颗粒包含polyk200。在实施方式中，纳米颗粒在纳米颗粒表面上包含至少一种聚合物，阳离子聚合物或阳离子嵌段共聚物。在一些实施方式中，阳离子聚合物包含聚赖氨酸，例如polyk30或polyk200。在一些实施方式中，聚赖氨酸是聚-l-赖氨酸。在实施方式中聚赖氨酸的平均长度为20-30，30-40，40-50，50-100，100-150，150-200，200-250，250-300，300-400或400-500个氨基酸。在实施方式中，纳米颗粒包含聚乙二醇(peg)。在实施方式中，peg具有1-2，2-3，3-4，4-5，5-6，6-7，7-8，8-9或9-10kd的分子量。在一些实施方式中，纳米颗粒包含阳离子嵌段共聚物，其包含peg(例如，peg5k)和聚赖氨酸，例如polyk30或polyk200。在实施方式中，阳离子嵌段共聚物包含peg5k-polyk30或peg5k-polyk200。不希望受理论束缚，在一些实施方式中，纳米颗粒包含低分子量聚赖氨酸(例如，平均长度为10-150，20-100，20-80，20-60，20-40，或约30个氨基酸)显示出优于包含更高分子量聚赖氨酸(例如，平均长度为约200个氨基酸)的纳米颗粒的性质。优异的性质可以是例如低毒性，低聚集性或高细胞负载，或其任何组合。在实施方式中，包含低分子量聚赖氨酸的纳米颗粒显示出对t细胞的低毒性，例如，通过冷冻和解冻后定量活t细胞的数量来测定，例如，使用实施例23的方法。在实施方式中，毒性包括在冷冻和解冻后扩增至少1.2倍，1.4倍，1.6倍，1.8倍，2倍，2.5倍，3倍，4倍或5倍的细胞。在实施方式中，包含低分子量聚赖氨酸的纳米颗粒显示低聚集，例如，如通过动态光散射测量的，例如，如实施例1中所述。在实施方式中，低聚集包含大小为约80nm(例如，70-90nm，60-100nm或50-150nm)的纳米颗粒群。在实施方式中，包含低分子量聚赖氨酸的纳米颗粒显示高细胞负载，如通过加载到活化的幼稚t细胞上的纳米颗粒的平均荧光强度(mfu)测量的，例如，如实施例18中所述。在实施方式中，高细胞负载包含mfu，其比对照纳米颗粒大至少2，5，10，20，50，100，200或500倍，所述对照纳米颗粒除具有polyk200以外在其他方面类似。在其他实施方式中，蛋白质与疏水聚合物可逆地连接，例如聚乳酸(pla)和/或聚(乳酸一共-乙醇酸)(plga)。在一些实施方式中，这些蛋白质-疏水性聚合物偶联物可以自组装成纳米颗粒。在一些实施方式中，本公开的蛋白质偶联物可以交联以形成水凝胶网络，纳米凝胶颗粒或蛋白质纳米凝胶，例如，如wo2015/048498和wo2017/027843中所述，所有这些在本文中被认为是“纳米颗粒”。在一些实施方式中，可聚合官能团包含硅烷和/或可交联聚合物。在一些实施方式中，可交联聚合物包含聚(环氧乙烷)，聚乳酸和/或聚(乳酸-共-乙醇酸)。在一些实施方式中，纳米颗粒包含至少75％w/w的蛋白质，其与可聚合官能团可逆地连接。在一些实施方式中，纳米颗粒包含至少80％w/w的蛋白质，其与可聚合官能团可逆地连接。本文还考虑了包含约50％w/w至约90％w/w可与可聚合官能团可逆连接的蛋白质的纳米颗粒。例如，在一些实施方式中，纳米颗粒可具有约50％w/w，约55％w/w，约60％w/w，约65％w/w，约70％w/w，约75％w/w，约80％w/w，约85％w/w，或约90％w/w与可聚合官能团可逆连接的蛋白质。本公开的其他方面提供了制备纳米颗粒的方法，所述方法包括用可降解接头和可聚合的官能团修饰蛋白质，以及使可聚合的官能团与交联剂和可溶的氟化物聚合。在一些实施方式中，可聚合官能团包含硅烷和/或可交联聚合物。在一些实施方式中，可交联聚合物包含聚(环氧乙烷)，聚乳酸和/或聚(乳酸-共-乙醇酸)。在一些实施方式中，可溶性氟化物是氟化钠。在一些实施方式中，可溶性氟化物是氟化钾。在一些实施方式中，纳米颗粒在其表面上包含一个或多个反应性基团。在实施方式中，其外表面上的一个或多个反应性基团可与有核细胞(例如t细胞)上的反应性基团反应。示例性纳米颗粒反应性基团包括但不限于硫醇反应性马来酰亚胺头基，卤代乙酰基(例如碘乙酰基)，亚氨酸酯基，n-羟基琥珀酰亚胺酯，吡啶基二硫化物基团等。这些反应性基团与有核细胞表面上的基团反应，因此纳米颗粒与细胞表面结合。在实施方式中，当以这种方式进行表面修饰时，纳米颗粒旨在与具有“互补”反应性基团的特定载体细胞一起使用(即，与纳米颗粒的反应性基团反应的反应性基团)。在一些实施方式中，纳米颗粒不会整合到包含细胞表面的脂质双层中。通常，纳米颗粒不会被有核细胞显著吞噬(或基本上内化)。在一些实施方式中，反应性基团是马来酰亚胺，罗丹明或ir783反应性基团。靶向的颗粒在一些实施方式中，颗粒(例如纳米颗粒)包括靶向部分，例如亲和配体。在一些实施方式中，靶向部分位于颗粒的表面上。在一些实施方式中，靶向部分包含配体或抗体分子。在一些实施方式中，纳米颗粒包含对免疫细胞，例如t细胞表面部分特异的抗体分子。因此，在一些实施方式中，纳米颗粒本身不仅仅通过结合有核细胞刺激有核细胞活化。在一些实施方式中，靶向部分增加有核细胞的表面稳定性，例如，降低靶蛋白内化。然而，在其他实施方式中，纳米颗粒通过与有核细胞结合来刺激有核细胞活化(例如，纳米颗粒的结合导致细胞表面部分的交联并且这活化有核细胞)。示例性的靶向部分包括但不限于亲和配体，例如，针对cd45，cd11a(整联蛋白α-l)，cd18(整联蛋白β-2)，cd11b，cd11c，cd25，cd8，cd4或cd2的抗体。在一些实施方式中，靶向部分(例如，抗体分子)结合检查点抑制剂，例如pd-1，pd-l1，lag-3，tim-3或ctla-4。在实施方式中，检查点抑制剂存在于免疫效应细胞，例如t细胞或nk细胞上。纳米颗粒可包含抗cd45抗体。在一些实施方式中，抗cd45抗体是人抗cd45抗体或人源化抗cd45抗体。在一些实施方式中，抗cd45抗体是抗cd45单克隆抗体。在一些实施方式中，单克隆抗cd45抗体是bc8(acct：hb-10507)，4b2，9.4(attc：hb-10508)或gap8.3(attc：hb-12)。因此，在一些实施方式中，纳米颗粒(例如，纳米凝胶)与抗cd45抗体连接。在一些实施方式中，包含细胞因子(例如，il-2，il-15，il-15-sa或其组合)的蛋白质纳米凝胶与抗cd45抗体连接。在一些实施方式中，抗体结合细胞表面受体并且抗体的至少50％(例如，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或至少95％)(例如，抗cd45抗体)保留在细胞表面上至少24小时(例如，至少36小时，或至少48小时)。在一些实施方式中，抗体(例如，抗cd45抗体)以1um，100nm，10nm，1nm，100pm，10pm，1pm，100fm，10fm或1fm或更强的亲和力结合人cd45，例如，通过表面等离子体共振测量。在一些实施方式中，靶向部分结合pd-1。例如，皮迪单抗(pidilizumab)和其他抗pd-1抗体公开于rosenblatt，j.等，(2011)jimmunotherapy34(5)：409-18，us7,695,715，us7,332,582，和us8,686,119，通过引用全文并入。medi0680和其他抗pd-1抗体公开于us9,205,148和wo2012/145493中，其通过引用全文并入。其他抗pd-1抗体包括例如描述于wo2010/027827，wo2011/066342，wo2015/11200，wo2016/092419，wo2015/085847，wo2014/179664，wo2014/194302，wo2014/209804，wo2015/2011，us8,735,553，us7,488,802，us8,927,697，us8,993,731和us9,102,727中的抗体，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，靶向部分结合pd-l1。例如，阿特朱单抗(atezolizumab)和其他抗pd-l1抗体公开于us8,217,149中，其全部内容通过引用并入本文。阿维鲁单抗和其他抗pd-l1抗体公开于wo2013/079174中，其通过引用全文并入。德瓦鲁单抗和其他抗pd-l1抗体公开在us8,779,108中，其全部内容通过引用并入本文。bms-936559和其他抗pd-l1抗体公开于us7,943,743和wo2015/081158，其通过引用全文并入。其他抗pd-l1抗体包括例如在wo2015/181342，wo2014/100079，wo2016/000619，wo2014/022758，wo2014/055897，wo2015/061668，wo2013/079174，wo2012/145493，wo2015/112805，wo2015/109124，wo2015/195163，us8,168,179，us8,552,154，us8,460,927和us9,175,082中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，靶向部分结合lag-3。lag-3抗体可选自例如lag525(诺华公司(novartis))，bms-986016(百时美施贵宝公司(bristol-myerssquibb))，tsr-033(tesaro)，mk-4280(默克公司(merck&co))或regn3767(regeneron)。imp731和其他抗lag-3抗体公开于wo2008/132601和us9,244,059中，其通过引用全文并入。其他抗lag-3抗体包括例如在wo2008/132601，wo2010/019570，wo2014/140180，wo2015/116539，wo2015/2011，wo2016/028672，us9,244,059，us9,505,839中描述的那些，通过引用全文并入。在一些实施方式中，靶向部分结合tim-3。在一些实施方式中，tim-3靶向部分选自mgb453(诺华公司)，tsr-022(tesaro)或ly3321367(礼来公司(elililly))。ape5137，ape5121和其他抗tim-3抗体公开在wo2016/161270中，其通过引用全文并入。其他抗tim-3抗体包括例如在wo2016/111947，wo2016/071448，wo2016/144803，us8,552,156，us8,841,418和us9,163,087中描述的那些，其通过引用全文并入。在一些实施方式中，靶向部分结合ctla-4。抗体伊匹单抗和其他抗ctla-4抗体公开于us6,984,720中，其通过引用并入本文。抗体替西木单抗和其他抗ctla-4抗体公开在us7,411,057中，在此通过引用纳入。纳米颗粒可以共价偶联(或连接或结合，因为这些术语在本文中可互换使用)，或者它们可以与有核细胞非共价偶联。共价偶联通常在纳米颗粒和有核细胞之间提供更稳定(并因此更长)的关联。在一些实施方式中，共价偶联还可以提供稳定性并因此在体内提供更持久的药剂局部递送。非共价偶联包括但不限于对细胞膜的细胞表面和/或脂质双层的吸收。在一些情况下，共价连接可以在两步过程中实现，其中有核细胞首先与带有马来酰亚胺的纳米颗粒一起孵育以允许偶联至细胞表面，然后用硫醇封端的聚(乙二醇)(peg)进行原位peg化以加帽颗粒的剩余马来酰亚胺基团并避免颗粒介导的细胞交联。在一些实施方式中，蛋白质在生理条件下以其天然构象从纳米颗粒释放并且具有生物活性。有核细胞有核细胞是纳米颗粒偶联，例如，共价或非共价偶联的细胞，例如，因此形成有核细胞-纳米颗粒复合物。在实施方式中，纳米颗粒包括蛋白质，例如本文所述的细胞因子分子。在一些实施方式中，如本文所公开的，有核细胞(例如，有核细胞群)共价偶联至纳米颗粒或多个纳米颗粒。在一个实施方式中，有核细胞(例如，有核细胞群)非共价偶联至本文公开的纳米颗粒，例如通过静电相互作用。在一些实施方式中，在从对象分离或纯化后，例如在储存，包括冷冻储存细胞或运输细胞之前，通过使有核细胞与本文公开的纳米颗粒接触来修饰有核细胞。在一些实施方式中，接触步骤在冷冻细胞之前发生。在其他实施方式中，接触步骤在解冻细胞后发生，例如在给予细胞之前。在一个实施方式中，有核细胞包括有核细胞，包括淋巴细胞。在本文所述的一些实施方式中，有核细胞是免疫细胞，例如免疫效应细胞(例如t细胞)。t细胞可以是cd4+或cd8+t细胞。t细胞可以是cd3t细胞。其他合适的细胞包括b细胞，nk细胞，nkt细胞和造血祖细胞，包括但不限于鼠谱系阴性，sca-1阳性和c-kit阳性细胞及其人类对应物。在t细胞，b细胞和造血祖细胞的表面上存在大量的游离巯基(-sh)基团，从而促进纳米胶囊纳米颗粒与这些细胞的偶联。在一些实施方式中，纳米颗粒与有核细胞连接。在一些实施方式中，有核细胞是免疫细胞，例如t细胞，b细胞，nk细胞或nkt细胞。本公开的一些实施方式涉及分离的或纯化的，例如基本上纯化的有核细胞。在一些实施方式中，分离的有核细胞是已经与它们天然存在的环境分离的细胞(即，它们不存在于体内)。体外t细胞是分离细胞的一个示例。应当理解，有核细胞可以从它们的体内环境中分离，与本公开的纳米颗粒偶联，然后在体内重新引入。有核细胞可以从它们的体内环境中分离，与本公开的纳米颗粒结合或偶联，并且有核细胞-纳米颗粒复合物与组分混合以允许复合物冻结并且在解冻时可以重新引入患者，例如，体内。这种有核细胞仍被认为是分离的细胞。在一些实施方式中，有核细胞例如直接或间接地从对象，例如需要免疫疗法的患者获得。在有核细胞是免疫细胞的实施方式中，免疫细胞，例如t细胞，可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术从对象收集的血液，例如血液样品中获得。在一个实施方式中，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采血液成分产品通常含有淋巴细胞，包括t细胞，单核细胞，粒细胞，b细胞，其他有核白细胞，红细胞和血小板。在一个实施方式中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆部分，并任选地将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续加工步骤。在一些实施方式中，有核细胞经基因工程改造以表达一种或多种因子，包括但不限于共刺激分子或包括嵌合受体的受体。在其他实施方式中，有核细胞不是基因工程改造的。在一些实施方式中，有核细胞是分离的并且是天然存在的(例如，它们未经遗传或以其他方式工程改造)。取决于它们的性质和功能，在一些实施方式中，有核细胞(包括基因工程改造的有核细胞)在与纳米颗粒偶联之前被操作。然而，有核细胞不需要进行表面修饰以促进纳米颗粒的偶联。在一些实施方式中，替代地，使用通常存在于有核细胞表面上的反应性基团而不必将反应性基团或其他实体结合到细胞表面上。结果，这种有核细胞在其表面上不需要存在外源实体，例如抗体或抗体片段，以与纳米颗粒偶联。这种操作还可以涉及有核细胞的活化，如对t细胞常规进行的那样。在一些实施方式中，在与纳米颗粒混合之前，有核细胞可在体外扩增和/或活化(或刺激，因为术语在本文中可互换使用)。扩增和活化方案将根据有核细胞类型而变化，但可包括与一种或多种细胞因子孵育，与一种或多种细胞类型一起孵育，以及与一种或多种抗原一起孵育。如果有核细胞是t细胞，则可以通过用针对各种t细胞表面分子的抗体刺激来进行活化，所述t细胞表面分子包括针对细胞表面受体的抗体，例如抗cd3抗体，抗cd28，然后将t细胞与il-2，il-15，il-15超激动剂和任选的共刺激分子如b7，b7.2，cd40等一起孵育。在一些实施方式中，有核细胞，更特别是t细胞，在其细胞表面上未涂覆外源抗体(即，在给予前细胞未在体外与抗体或抗体片段接触)。扩增可以通过涉及掺入放射性标记的核苷酸(例如氚标记的胸苷)的增殖测定来测量。可以通过产生细胞因子如il-2，γ-ifn，il-1，il-4，il-6和tnf等来测量活化。测量扩增和活化的其他方法是本领域已知的，包括使用针对细胞表面受体的荧光标记的抗体，其可以通过流式细胞术监测，例如，抗cd25，cd71，cd28，cd30，cd154，cd69，cd134的抗体，并且可以根据本公开内容使用。可以选择有核细胞以便以较小的体积富集更多数量的此类细胞和/或从组合物中除去其他可能不需要的细胞。选择可涉及阳性或阴性选择，包括例如基于柱或板的富集方案。可以从对象的外周血中收获免疫细胞，例如t细胞，b细胞和nk细胞。造血祖细胞可以从许多来源获得，包括但不限于脐带血，骨髓，流动的外周血，并且在一些情况下，分化的胚胎干细胞。造血祖细胞已在本领域中表征。人体中的此类细胞通常具有最低限度的cd34+表型，尽管它们也可以是cd59+，thyl/cd90+，cd38lo/neg，cd33-，和/或c-kit/cdll7+。它们的特征还在于不表达谱系特异性标志物。它们可以使用亲和柱，磁珠，荧光活化细胞分选(facs)，它们的一些组合等从骨髓，脐带血或外周血中收获。这些细胞具有在移植后重新填充一种或多种造血谱系的能力。优选地，这些细胞重新填充超过一个谱系，甚至更优选地，所有谱系。本文所用的谱系的再增殖或群体是指干细胞分化成一个或多个谱系，使得干细胞的后代对于对象中该谱系的构成做出贡献。然而，它不要求整个谱系区室来自移植的细胞，但是在某些情况下可能发生这种情况。分离的干细胞可以通过根据一种或多种标志物分离异质细胞群来获得，包括但不限于细胞表面标志物。有核细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞(例如人细胞)。或者，它们可以是非哺乳动物细胞。在其他实施方式中，有核细胞可以是原核细胞(例如，细菌细胞)。几种细菌细胞类型特别令人感兴趣。例如，正在研究减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗递送的候选载体(xiang等，immunolrev222：117，2008；和iweala等，jimmunol183(4)：2252，2009)并且工程改造的大肠杆菌细已经显示能够特异性归巢到低氧化肿瘤(cheong等，science314(5803)：1308，2006)。细菌提供新的给药方式和组织部位靶向可能性，例如口服给药和将治疗剂靶向肠和肠相关淋巴组织的能力。就产生现成的即用型细胞-纳米颗粒系统而言，此类微生物载体可提供相对于自体宿主细胞的优势。使用针对哺乳动物细胞描述的相同的化学策略组，可以实现颗粒与微生物的偶联。在一些情况下，临时去除微生物的鞭毛涂层(例如，通过rosu等，jbacteriol188(14)：5196，2006描述的简单机械剪切)可用于实现颗粒与微生物细胞体的最佳偶联。制备纳米颗粒的方法本文提供了制备纳米颗粒的方法。纳米颗粒的示例是蛋白纳米凝胶，例如蛋白纳米凝胶，其含有完整的生物活性蛋白质但不含载体(例如白蛋白，bsa)。在一些实施方式中，产生生物活性蛋白纳米凝胶的方法包括在允许蛋白质通过可降解接头彼此可逆共价交联的条件下使蛋白质与可降解接头接触，从而产生生物活性蛋白纳米凝胶。在一些实施方式中，方法还包括在允许聚合物与蛋白纳米凝胶的蛋白质交联的条件下使蛋白质纳米凝胶与聚合物接触，从而产生生物活性蛋白质-聚合物纳米凝胶。在一些实施方式中，产生多个蛋白纳米凝胶或多种蛋白质-聚合物纳米凝胶。通常，允许蛋白质通过可降解接头可逆共价交联的条件包括使蛋白质与可降解接头在4℃至25℃(例如，4℃，5℃，6℃，7℃，8℃，9℃，10℃，11℃，12℃，13℃，14℃，15℃，16℃，17℃，18℃，19℃，20℃，21℃，22℃，23℃，24℃或25℃)下接触。在一些实施方式中，将蛋白质与可降解接头一起在水性缓冲液(例如pbs)中在4℃至25℃(例如室温)的温度下孵育。在一些实施方式中，蛋白质与可降解接头在水性缓冲液(例如pbs)中在不高于20℃，30℃或40℃的温度下或在约35-45℃的温度下孵育。在一些实施方式中，允许蛋白质通过可降解接头彼此可逆共价交联的条件包括使蛋白质与可降解接头接触30分钟至2小时，或30分钟至1小时(例如，30，35，40，45，50，55或60分钟)。在一些实施方式中，将蛋白质与可降解接头在水性缓冲液(例如pbs)中孵育30分钟至2小时，或30分钟1小时。在一些实施方式中，水性缓冲液中蛋白质的浓度为10mg/ml至50mg/ml。例如，蛋白质在水性缓冲液中的浓度可以是10mg/ml，15mg/ml，20mg/ml，25mg/ml，30mg/ml，35mg/ml，40mg/ml，45mg/ml或50mg/ml蛋白质/水性缓冲液)。在一些实施方式中，生物活性蛋白纳米凝胶或蛋白质-聚合物纳米凝胶中蛋白质的重量百分比为至少75％w/w。例如，生物活性蛋白质-聚合物纳米凝胶中蛋白质的重量百分比为至少80％w/w，至少85％w/w，至少90％w/w，或至少95％w/w。在一些实施方式中，生物活性蛋白纳米凝胶或蛋白质一聚合物纳米凝胶中蛋白质的重量百分比为75％w/w至90％w/w，80％w/w至90％w/w，或85％w/w至90％w/w。允许聚合物与蛋白纳米凝胶的蛋白质交联的条件包括使蛋白纳米凝胶与聚合物在4℃至25℃的温度下接触(例如，4℃，5℃，6℃，7℃，8℃，9℃，10℃，11℃，12℃，13℃，14℃，15℃，16℃，17℃，18℃，19℃，20℃，21℃，22℃，23℃，24℃或25℃)。在一些实施方式中，将蛋白纳米凝胶与聚合物在水性缓冲液(例如pbs)中在4℃至25℃(例如室温)的温度下孵育。在一些实施方式中，蛋白纳米凝胶与聚合物在水性缓冲液(例如pbs)中在不高于30℃的温度下孵育。在一些实施方式中，允许聚合物与蛋白纳米凝胶的蛋白质交联的条件包括使蛋白纳米凝胶与聚合物接触30分钟至2小时，或30分钟至1小时(例如，30，35，40，45，50，55或60分钟)。在一些实施方式中，将蛋白纳米凝胶与聚合物在水性缓冲液(例如pbs)中孵育30分钟至2小时，或30分钟1小时。制备本公开的纳米颗粒的其他方法可以包括用可降解接头和可聚合官能团修饰蛋白质，以及使可聚合官能团与交联剂和可溶性氟化物聚合。本发明的蛋白质可以用可降解接头修饰或偶联，例如，氧化还原反应性接头。在一些实施方式中，修饰可以是共价修饰。wo2015/048498的图3a说明了蛋白质修饰方案的一个示例。在该示例中，蛋白质通过可降解接头与硅烷共价偶联。可聚合官能团可在可溶性氟化物催化剂存在下与交联剂聚合。在一些实施方式中，交联剂是聚合物(例如，硅烷-peg-硅烷)。在一些实施方式中，可溶性氟化物是氟化钠。在一些实施方式中，可溶性氟化物是氟化钾。组合物本文提供了包含蛋白质纳米颗粒(例如，有核细胞-纳米颗粒复合物)的组合物，包括药物组合物。组合物可以以药学上可接受的量和药学上可接受的组合物配制。术语“药学上可接受的”是指不干扰活性成分(例如，纳米颗粒的生物活性蛋白质)的生物活性的有效性的无毒材料。在一些实施方式中，此类组合物可含有盐，缓冲剂，防腐剂和任选的其他治疗剂。在一些实施方式中，药物组合物还可含有合适的防腐剂。在一些实施方式中，药物组合物可以以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。在一些实施方式中，适于胃肠外给予的药物组合物包含纳米颗粒的无菌水性或非水性制剂，在一些实施方式中，其与受体对象的血液等渗。可以根据已知方法配制该制剂。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。在一些实施方式中，本公开的药物组合物可以是无菌的并且含有有效量的纳米颗粒(例如，纳米凝胶)，有或没有有核细胞，单独或与另一种药剂组合，用于在单位重量或体积中产生所需的反应。用途本公开的其他方面提供了优化的产生有核细胞的方法。在一个实施方式中，在一个或多个冷冻和/或解冻循环后，促进(例如，保留)有核细胞(例如免疫细胞)的功能。产生的有核细胞(例如，包括本文公开的纳米颗粒，例如有核细胞-纳米颗粒复合物)可以解冻并给予，例如直接给予于对象。因此，在另一方面，本文公开了向对象(例如人对象)给予如本文所述的有核细胞群的方法。在一些实施方式中，对象是人对象。对象还包括动物，如家畜(例如，狗，猫，兔，雪貂)，牲畜或农场动物(例如，牛，猪，绵羊，鸡和其他家禽)，马(例如纯种马)，实验动物(例如，小鼠，大鼠，兔)等。在一些实施方式中，对象患有疾病或处于患病风险中。在一些实施方式中，对象是患者，例如人类患者。在其他实施方式中，所述疾病是癌症，糖尿病，自身免疫疾病，过敏或过敏性疾病，哮喘或心血管疾病。在实施方式中，对象需要移植。给予本文组合物(例如，有核细胞组合物)的对象可以是正常或健康的对象。或者，它们可能具有或可能有发展可以诊断或可以从一种或多种细胞的递送中受益的病症的风险。这些病症包括癌症(例如，实体瘤癌症)，自身免疫病症，移植排斥等。在实施方式中，癌症是血液癌症。在实施方式中，血液癌症是白血病或淋巴瘤。示例性血液癌症包括但不限于霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(例如，b细胞淋巴瘤，弥漫性大b细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，套细胞淋巴瘤，边缘区b细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，毛细胞白血病)，急性髓性白血病，慢性粒细胞白血病，骨髓增生异常综合征，多发性骨髓瘤或急性淋巴细胞白血病。在实施方式中，癌症不是急性髓性白血病(aml)。在实施方式中，癌症是实体癌。示例性实体癌包括但不限于卵巢癌，直肠癌，胃癌，睾丸癌，肛门癌，子宫癌，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，非小细胞肺癌，小肠癌，食道癌，黑色素瘤，卡波西肉瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌症，头颈部癌，皮肤或眼内恶性黑色素瘤，子宫癌，脑干胶质瘤，垂体腺瘤，表皮样癌，宫颈鳞癌，输卵管癌，子宫内膜癌，癌阴道，软组织肉瘤，尿道癌，外阴癌，阴茎癌，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，脊柱轴肿瘤，新中枢神经系统(cns)的血浆，原发性cns淋巴瘤，肿瘤血管生成，所述癌症的转移性病变或其组合。在一些实施方式中，待治疗的对象与分离有核细胞(例如免疫细胞)的对象相同。在其他实施方式中，待治疗的对象不同于分离有核细胞(例如免疫细胞)的对象。在实施方式中，两个对象患有或已经患有相同类型的癌症。在实施方式中，有核细胞以适于待治疗或预防的疾病的方式给予。给药的数量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重性等因素确定。合适的剂量可以通过临床试验确定。例如，当指示“有效量”或“治疗量”时，医生可以考虑肿瘤大小，感染或转移的程度，对象的年龄，体重和状况的个体差异来确定待给予的药物组合物(或有核细胞)的精确量。在实施方式中，本文所述的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重，例如105至106个细胞/kg体重的剂量给予，包括在这些范围内的所有整数值。在实施方式中，本文所述的药物组合物可以这些剂量多次给药。在实施方式中，本文所述的药物组合物可以使用免疫疗法中描述的输注技术给予(参见，例如，rosenberg等，neweng.j.ofmed.319：1676，1988)。本申请的其他方面和实施方式在以下列举的段落中提供。1.一种组合物，其包含有核细胞，缓冲水性介质溶液和纳米颗粒，所述纳米颗粒包含至少一种促进例如，保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化的试剂，其中组合物是冷冻的，并且在组合物解冻时，任选地由所述纳米颗粒中释放所述试剂并且与在没有纳米颗粒的情况下冷冻和解冻的缓冲水性介质溶液中的有核细胞相比，改善有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化。2.一种组合物，其包含有核细胞，缓冲水性介质溶液和纳米颗粒，所述纳米颗粒包含至少一种保留剂，其促进，例如，保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化，其中在解冻组合物的冷冻制剂时，保留剂任选地从纳米颗粒中释放并且与在没有纳米颗粒的情况下解冻和冷冻的缓冲水性介质溶液中的有核细胞相比，促进，例如，保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化，其中保留剂包含与多肽例如共价或非共价复合的il-15分子，所述多肽包含：第一结构域，其包含seqidno：3或seqidno：4的氨基酸序列，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并且具有il-15结合活性的氨基酸序列，或第一结构域，所述第一结构域包含seqidno：7或seqidno：8的氨基酸序列，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并且具有il-15结合活性的氨基酸序列；和任选地，第二异源结构域，例如抗体分子，例如fab片段，fab2片段，或scfv；重链抗体片段；fc片段；或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段，其中任选地至少部分组合物是冷冻的。3.如实施方式1所述的组合物，其中所述组合物，例如纳米颗粒和/或保留剂，包含il-15复合物，所述il-15复合物包含与多肽例如共价或非共价复合的il-15分子，所述多肽包括il-15受体或其il-15结合片段。4.如实施方式2或3所述的组合物，其中il-15分子包含il-15突变体，例如具有一个或多个氨基酸取代，例如在72位的取代，例如n至d取代的人il-15多肽。5.如实施方式2-4中任一项所述的组合物，其中il-15分子是seqidno：6的il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性。6.如实施方式2-5中任一项所述的组合物，其中包含il-15受体或其片段的多肽包含seqidno：5的寿司-fc多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性。7.如实施方式2-5中任一项所述的组合物，其中包含il-15受体或其片段的多肽包含寿司结构域(例如seqidno：7或seqidno：8)和第二异源结构域，其包含效应-减毒的fc结构域，例如人igg2fc结构域，例如seqidno：11的人igg2结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列。8.如实施方式1-7中任一项所述的组合物，其中保留剂是用于维持有核细胞活力，增殖，细胞毒活性或活化的刺激分子。9.如实施方式1-8中任一项所述的组合物，其中促进干扰素γ产生。10.如实施方式1-9中任一项所述的组合物，其中通过干扰素γ产生来测量活化。11.如实施方式1-10中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含(例如，所述培养基含有)刺激和维持细胞活力和增殖的化合物。12.如实施方式1-11中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含(例如，所述培养基含有)在冷冻和解冻期间保护细胞的化合物。13.如实施方式1-12中任一项所述的组合物，其中保留剂从纳米颗粒的释放发生在1小时至3周，例如1小时至24小时，1天至3天，4天至6天，1周至2周，或2周至3周内发生。14.如实施方式1-13中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒与有核细胞的表面关联。15.如实施方式1-14中任一项所述的组合物，其中有核细胞是免疫效应细胞(例如，淋巴细胞，t细胞，b细胞或自然杀伤细胞)或造血干细胞。16.如实施方式1-15中任一项所述的组合物，其中纳米颗粒通过对有核细胞的静电吸引与细胞表面关联。17.如实施方式1-16中任一项所述的组合物，其中纳米颗粒包含至少一种配体，其中所述配体对有核细胞表面上的蛋白质，碳水化合物或脂质具有亲和性。18.如实施方式1-17中任一项所述的组合物，其中纳米颗粒共价偶联至例如有核细胞的表面。19.如实施方式1-17中任一项所述的组合物，其中纳米颗粒不与有核细胞共价偶联。20.如实施方式1-19中任一项所述的组合物，其中纳米颗粒包含脂质体，蛋白纳米凝胶，核苷酸纳米凝胶，聚合物纳米颗粒，或固体纳米颗粒。21.如实施方式1-20中任一项所述的组合物，其中纳米颗粒包含脂质体。22.如实施方式1-21中任一项所述的组合物，其中纳米颗粒包含蛋白纳米凝胶。23.如实施方式1-22中任一项所述的组合物，其中纳米颗粒在纳米颗粒表面上包含至少一种聚合物，阳离子聚合物，或阳离子嵌段共聚物。24.如实施方式1-23中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒包含阳离子嵌段共聚物，所述阳离子嵌段共聚物含有peg(例如，分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg)和聚赖氨酸(例如，平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸)。25.如实施方式1-24中任一项所述的组合物，其包含化合物，所述化合物使纳米颗粒在溶液中或在细胞表面上稳定和/或增加纳米颗粒与有核细胞表面之间的相互作用，所述化合物例如鱼精蛋白，壳聚糖，碳水化合物，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，天然聚合物，多糖，葡聚糖多聚物，纤维素，纤连蛋白，胶原蛋白，纤维蛋白，或蛋白多糖。26.如实施方式1-25中任一项所述的组合物，其包含细胞因子分子，生长因子分子或共刺激分子。27.如实施方式1-26中任一项所述的组合物，其包含第二保留剂，其包含细胞因子，例如il2，il6，il7，ill2，il15，il17，il18，il21，il-23，il-4，il1α，il1β，il-5，ifnγ，tnfα，ifnα，ifnβ，gm-csf或gcsf，或其变体，例如其超级激动剂。28.如实施方式1-27中任一项所述的组合物，其包含针对共刺激分子的抗体分子或激动剂配体，例如，其中所述共刺激分子选自cd137的激动剂，ox40，cd28，gitr，vista，cd40，或cd3。29.如实施方式1-28中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒包含实体，所述实体减少(例如，抑制，减弱或降低)有核细胞的纳米颗粒内化。30.如实施方式1-29中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒包含针对cd45，cd11a(整联蛋白α-l)，cd18(整联蛋白β-2)，cd11b，cd11c，cd25，cd8或cd4的抗体分子。31.如实施方式1-30中任一项所述的组合物，其包含seqidno：6的il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：5的寿司-fc多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6，或约5kd的peg和平均长度为10-50，20-40，或约30个氨基酸的聚赖氨酸的阳离子嵌段共聚物；和任选地，针对cd45的抗体分子。32.如实施方式1-30中任一项所述的组合物，其包含seqidno：1的il-15多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；寿司-fc多肽，包含seqidno：7或seqidno：8的寿司结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性的，和seqidno：11的fc结构域或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性的氨基酸序列；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸的阳离子嵌段共聚物；和任选地，针对cd45的抗体分子。33.如实施方式1-32中任一项所述的组合物，其中纳米凝胶是高密度蛋白质结构(例如，按重量计大于80％蛋白质)，和/或其中蛋白质通过交联分子交联，所述交联分子在降解后释放天然形式的蛋白质。34.如实施方式1-33中任一项所述的组合物，其中纳米颗粒包含通过对氧化还原(二硫化物)或ph(可水解基团)或酶(蛋白酶)敏感的可逆接头交联的纳米凝胶。35.一种促进，例如，保留或增强从患者分离并进一步经冻融处理的有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化的方法，其中通过与缓冲水溶液和纳米颗粒组合修饰有核细胞，所述纳米颗粒包含至少一种保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化中的一种或多种的试剂，其中所述修饰的有核细胞被冷冻，并且在解冻时，所述保留剂任选地从所述有核细胞释放并且与在没有纳米颗粒的情况下冷冻和解冻的缓冲水性介质溶液中的有核细胞相比，所述纳米颗粒改善了有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化。36.一种促进，例如，保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化的方法，例如在冷冻有核细胞之前，其中已从患者中分离出有核细胞，包括通过以下方式修饰有核细胞：将其与缓冲水性溶液和纳米颗粒组合，所述纳米颗粒包含至少一种保留剂，例如，与在没有纳米颗粒的情况下冷冻和解冻的缓冲水性介质溶液中的有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化相比，所述保留剂保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化。37.一种促进(例如)增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化中的一种或多种的方法，其中有核细胞已从患者中分离并通过与缓冲水溶液，包含至少一种保留剂的纳米颗粒的组合进行修饰，所述保留剂保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化，所述方法包括使修饰的有核细胞经历至少一个冻融循环。38.一种制备有核细胞的冷冻组合物的方法，包括：提供包含有核细胞，缓冲水性介质溶液和多个纳米颗粒的未冷冻组合物，所述纳米颗粒包含至少一种保留剂，例如，在解冻有核细胞的冷冻制剂时，所述保留剂促进，例如，保留或增强有核细胞的活性，增殖，细胞毒活性或活化，任选地，充分降低组合物的温度以使组合物冻结，从而冷冻有核细胞的组合物。39.如实施方式38所述的方法，其中组合物的温度降低至小于0摄氏度。40.如实施方式38或39所述的方法，其中组合物的温度降低至低于负10摄氏度。41.如实施方式37-40中任一项所述的方法，包括将有核细胞的冷冻组合物维持冷冻至少1小时。42.如实施例37-41中任一实施例所述的方法，其中所述提供包括：将有核细胞与包含保留剂的纳米颗粒合并，并任选地将有核细胞与缓冲的水性介质溶液合并。43.如实施方式37-42中任一项所述的方法，其中所述提供包括从另一实体接收纳米颗粒并将纳米颗粒与有核细胞合并。44.如实施方式37-43中任一项所述的方法，其中所述提供包括从另一实体接收有核细胞的未冷冻组合物。45.如实施方式37-44中任一项所述的方法，包括将有核细胞的冷冻组合物提供或释放到另一实体，例如医疗提供者，例如医院，诊所或医生办公室。46.如实施方式37-45中任一项所述的方法，包括解冻有核细胞的冷冻组合物以提供有核细胞的解冻组合物。47.如实施方式37-46中任一项所述的方法，其中在解冻组合物的冷冻制剂时，保留剂从纳米颗粒中释放并且与在没有纳米颗粒的情况下冷冻和解冻的缓冲水性介质溶液中的有核细胞相比促进，例如，保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化。48.如实施方式37-47中任一项所述的方法，其中所述保留剂包含：il-15多肽受体α片段；和任选地，第二异源结构域，例如抗体分子，例如fab片段，fab2片段或scfv；重链抗体片段；fc片段；或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段。49.如实施方式37-48中任一项所述的方法，其中所述保留剂是用于维持有核细胞活力，增殖，细胞毒活性或活化的刺激分子。50.如实施方式37-49中任一项所述的方法，其中干扰素γ产生受到促进。51.如实施方式50所述的方法，其中活化通过干扰素γ产生来测量。52.如实施方式37-51中任一项所述的方法，其中所述组合物包含(例如，所述培养基含有)刺激和维持细胞活力和增殖的化合物。53.如实施方式37-52中任一项所述的方法，其中所述培养基包含在冷冻和解冻期间保护细胞的化合物。54.如实施方式37-53中任一项所述的方法，其中保留剂从纳米颗粒中的释放在1小时至3周，例如1小时至24小时，1天至3天，4天至6天，1周至2周，或2周至3周内发生。55.如实施方式37-54中任一项所述的方法，其中纳米颗粒与有核细胞的表面关联。56.如实施方式37-55中任一项所述的方法，其中有核细胞包含免疫效应细胞(例如淋巴细胞，t细胞，b细胞或自然杀伤细胞)或造血干细胞。57.如实施方式37-56中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒通过对有核细胞的静电吸引而与细胞表面结合。58.如实施方式37-57中任一项所述的方法，其中纳米颗粒包含配体，其中所述配体对有核细胞表面上的蛋白质，碳水化合物或脂质具有亲和性。59.如实施方式37-58中任一项所述的方法，其中纳米颗粒共价偶联至例如有核细胞的表面。60.如实施方式37-58中任一项所述的方法，其中纳米颗粒不与有核细胞共价偶联。61.如实施方式37-60中任一项所述的方法，其中纳米颗粒包含脂质体，蛋白纳米凝胶，核苷酸纳米凝胶，聚合物纳米颗粒，或固体纳米颗粒。62.如实施方式61所述的方法，其中纳米颗粒包含脂质体。63.如实施方式61所述的方法，其中纳米颗粒包含蛋白纳米凝胶。64.如实施方式37-63中任一项所述的方法，其中纳米颗粒在纳米颗粒表面上包含至少一种聚合物，阳离子聚合物，或阳离子嵌段共聚物。65.如实施方式37-64中任一项所述的方法，其中纳米颗粒包含阳离子嵌段共聚物，所述阳离子嵌段共聚物含有peg(例如，分子量为约1-10，2-8，4-6，或约5kd的peg)和聚赖氨酸(例如，平均长度为10-50，20-40，或约30个氨基酸的聚赖氨酸)。66.如实施方式37-65中任一项所述的方法，其中所述组合物包含化合物，所述化合物使纳米颗粒在溶液中或在细胞表面上稳定和/或增加纳米颗粒与有核细胞表面之间的相互作用，所述化合物例如鱼精蛋白，壳聚糖，碳水化合物，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，天然聚合物，多糖，葡聚糖多聚物，纤维素，纤连蛋白，胶原蛋白，纤维蛋白，或蛋白多糖。67.如实施方式37-66中任一项所述的方法，其中保留剂是用于维持有核细胞活力，增殖，细胞毒活性或活化的刺激分子。68.实施方式37-67中任一项的方法，其中所述保留剂包含与多肽例如共价或非共价复合的il-15分子，所述多肽包含：第一结构域，其包含seqidno：3或seqidno：4的氨基酸序列，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性并且具有il-15结合活性的氨基酸序列，或第一结构域，所述第一结构域包含seqidno：7或seqidno：8的氨基酸序列，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并且具有il-15结合活性的氨基酸序列；和任选地，第二异源结构域，例如抗体分子，例如fab片段，fab2片段或scfv；重链抗体片段；fc片段；或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段。69.如实施方式37-68中任一项所述的方法，其中保留剂包含细胞因子分子，生长因子分子，或共刺激分子。70.如实施方式37-69中任一项所述的方法，其中所述保留剂包含细胞因子分子，例如il2，il6，il7，il12，il15，il17，il18，il21，il-23，il-4，il1α，il1β，il-5，ifnγ，tnfα，ifnα，ifnβ，gm-csf或gcsf，或变体，例如其超激动剂。71.如实施方式37-70中任一项所述的方法，其中所述组合物包含针对共刺激分子的抗体分子或激动剂配体，例如，其中所述共刺激分子选自cd137的激动剂，ox40，cd28，gitr，vista，cd40，或cd3。72.如实施方式37-71中任一项所述的方法，其中所述组合物，例如纳米颗粒，包含实体，所述实体减少(例如，抑制，减弱或降低)由有核细胞的纳米颗粒内化。73.如实施方式37-72中任一项所述的方法，其中所述组合物，例如纳米颗粒包含针对cd45，cd11a(整联蛋白α-l)，cd18(整联蛋白β-2)，cd11b，cd11c，cd25，cd8或cd4的抗体分子。74.如实施方式37-73中任一项所述的方法，其中纳米凝胶是高密度蛋白质结构(例如，按重量计大于80％蛋白质)，和/或其中蛋白质通过交联分子交联，所述交联分子在降解后释放天然形式的蛋白质。75.如实施方式37-74中任一项所述的方法，其中纳米颗粒包含通过对氧化还原(例如二硫化物)或ph(例如可水解基团)或酶(例如蛋白酶)敏感的可逆接头交联的纳米凝胶。76.如实施方式37-75中任一项所述的方法，其中纳米颗粒包含seqidno：6的il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：5的寿司-fc多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg的阳离子嵌段共聚物和平均长度为10-50，20-40或约50的聚赖氨酸30个氨基酸；和任选地，cd45的抗体分子。77.一种制备有核细胞的解冻组合物的方法，包括：提供包含有核细胞和包含至少一种保留剂的纳米颗粒的有核细胞的冷冻组合物；和充分加热有核细胞的冷冻组合物以解冻所述有核细胞的冷冻组合物，从而制备有核细胞的解冻组合物。78.如实施方式77所述的方法，其中所述提供包括从另一实体，例如，制备和/或冷冻有核细胞组合物的实体接收冷冻组合物。79.如实施方式77所述的方法，其中所述提供包括：将有核细胞与缓冲水性介质溶液和包含至少一种保留剂的纳米颗粒合并。80.如实施方式77所述的方法，其中所述提供包括从另一实体接收纳米颗粒并将纳米颗粒与有核细胞合并。81.如实施方式77-80中任一项所述的方法，包括在加热有核细胞的冷冻组合物之前，将有核细胞的冷冻组合物维持冷冻至少1小时。82.如实施方式77-81中任一项所述的方法，其中在冷冻组合物解冻时，保留剂从纳米颗粒中释放并且与在没有纳米颗粒的情况下冷冻和解冻的缓冲水性介质溶液中的有核细胞相比促进，例如，保留或增强有核细胞的活力，增殖，细胞毒活性或活化。83.如实施方式77-82中任一项所述的方法，其中保留剂是用于维持有核细胞活力，增殖，细胞毒活性或活化的刺激分子。84.如实施方式77-83中任一项所述的方法，其中促进干扰素γ产生。85.如实施方式84所述的方法，其中通过干扰素γ产生来测量活化。86.如实施方式77-85中任一项所述的方法，其中所述组合物包含(例如，所述培养基含有)刺激和维持细胞活力和增殖的化合物。87.如实施方式77-86中任一项所述的方法，其中所述组合物(例如，培养基)包含在冷冻和解冻期间保护细胞的化合物。88.如实施方式77-87中任一项所述的方法，其中保留剂从纳米颗粒的释放在超过1小时至3周，例如1小时至24小时，1天至3天，4天至6天，1周至2周，或2周至3周内发生。89.如实施方式77-88中任一项所述的方法，其中纳米颗粒与有核细胞的表面关联。90.如实施方式77-89中任一项所述的方法，其中有核细胞是免疫效应细胞(例如淋巴细胞，t细胞，b细胞或自然杀伤细胞)或造血干细胞。91.如实施方式77-90中任一项所述的方法，其中纳米颗粒通过对有核细胞的静电吸引与细胞表面关联。92.如实施方式77-91中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含配体，其中所述配体对有核细胞表面上的蛋白质，碳水化合物或脂质具有亲和性。93.如实施方式77-92中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒共价偶联至例如有核细胞的表面。94.如实施方式77-92中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒不与有核细胞共价偶联。95.如实施方式77-94中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含脂质体，蛋白纳米凝胶，核苷酸纳米凝胶，聚合物纳米颗粒，或固体纳米颗粒。96.如实施方式95所述的方法，其中所述纳米颗粒包含脂质体。97.如实施方式95所述的方法，其中所述纳米颗粒包含蛋白纳米凝胶。98.如实施方式77-97中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒在纳米颗粒表面上包含至少一种聚合物，阳离子聚合物或阳离子嵌段共聚物。99.如实施方式77-98中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含阳离子嵌段共聚物，所述阳离子嵌段共聚物含有peg(例如，分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg)和聚赖氨酸(例如，平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸)。100.如实施方式77-99中任一项所述的方法，其中所述组合物包含化合物，所述化合物使纳米颗粒在溶液中或细胞表面上稳定和/或增加纳米颗粒与有核细胞表面之间的相互作用，所述化合物例如鱼精蛋白，壳聚糖，碳水化合物，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，天然聚合物，多糖，葡聚糖多聚物，纤维素，纤连蛋白，胶原蛋白，纤维蛋白，或蛋白多糖。101.如实施方式77-100中任一项所述的方法，其中所述保留剂是用于维持有核细胞活力，增殖，细胞毒活性或活化的刺激分子。102.如实施方式77-101中任一项所述的方法，其中所述保留剂包含与多肽例如共价或非共价复合的il-15分子，所述多肽包含：第一结构域，包含seqidno：3或seqidno：4的氨基酸序列，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同性并且具有il-15结合活性的氨基酸序列，或者第一结构域，所述第一结构域包含seqidno：7或seqidno：8的氨基酸序列，或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性并且具有il-15结合活性的氨基酸序列；和任选地，第二异源结构域，例如抗体分子，例如fab片段，fab2片段或scfv；重链抗体片段；fc片段；或亲和体片段或衍生物，例如sdab(纳米抗体)片段。103.如实施方式77-102中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含seqidno：6的il-15n72d多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15ra结合活性；seqidno：5的寿司-fc多肽或与其具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％相同性的氨基酸序列，其具有il-15结合活性；包含分子量为约1-10，2-8，4-6或约5kd的peg和平均长度为10-50，20-40或约30个氨基酸的聚赖氨酸的阳离子嵌段共聚物；和任选地，针对cd45的抗体分子。104.如实施方式77-103中任一项所述的方法，其中所述保留剂包含细胞因子分子，生长因子分子或共刺激分子。105.如实施方式77-104中任一项所述的方法，其中所述组合物包含第二保留剂，其包含细胞因子，例如il2，il6，il7，il12，il15，il17，il18，il21，il-23，il-4，il1α，il1β，il-5，ifnγ，tnfα，ifnα，ifnβ，gm-csf或gcsf，或变体，例如其超激动剂。106.如实施方式77-105中任一项所述的方法，其中所述组合物包含针对共刺激分子的抗体分子或激动剂配体，例如，其中所述共刺激分子选自cd137的激动剂，ox40，cd28，gitr，vista，cd40，或cd3。107.如实施方式77-106中任一项所述的方法，其中所述组合物，例如纳米颗粒，包含实体，所述实体减少(例如，抑制，减弱或降低)由有核细胞的纳米颗粒内化。108.如实施方式77-107中任一项所述的方法，其中所述组合物，例如纳米颗粒包含针对cd45的抗体分子，cd11a(整联蛋白a-l)，cd18(整联蛋白β-2)，cd11b，cd11c，cd25，cd8或cd4。109.如实施方式77-108中任一项所述的方法，其中所述纳米凝胶是高密度蛋白质结构(例如，按重量计大于80％蛋白质)，和/或其中蛋白质通过交联分子交联，所述交联分子降解后释放天然形式的蛋白质。110.如实施方式77-109中任一项所述的方法，其中纳米颗粒包含通过对氧化还原(例如二硫化物)或ph(例如可水解基团)或酶(例如蛋白酶)敏感的可逆接头交联的纳米凝胶。111.一种冷冻有核细胞和纳米颗粒的方法，其中所述细胞在低于10摄氏度时冷冻并在至少1小时后解冻，其中所述纳米颗粒包含至少一种在解冻后从纳米颗粒释放的试剂，其与没有纳米颗粒的有核细胞的组合物相比保持程度更高的细胞存活。112.如实施方式111所述的方法，其中所述试剂是用于维持有核细胞活力的刺激分子。113.如实施方式111-112中任一项所述的方法，其中所述有核细胞是淋巴细胞。114.如实施方式111-113中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒与有核细胞的表面关联。115.如实施方式111-114中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒与有核细胞的表面共价偶联。实施例实施例1：形成蛋白纳米凝胶蛋白质在无血清培养基中由悬浮适应的hek293细胞产生，然后通过蛋白a亲和纯化，并将缓冲液交换成达氏磷酸盐缓冲盐水(dpbs)。包含交联蛋白纳米凝胶(背包)的背包蛋白纳米凝胶如下形成。使用过量的可降解交联剂将本文所述的蛋白质或蛋白质复合物交联成蛋白质纳米颗粒。合适的蛋白质复合物是rubinstein等，pnas103：24p.9166-9171(2006)中描述的il-15超级激动剂。在一些实施方式中，蛋白质复合物包含如下的野生型人il-15蛋白质序列：合适的交联剂是双[2-(n-琥珀酰亚胺基-氧基羰基氧基)乙基]二硫化物，其含有通过含有柔性二硫化物的接头连接在一起的两个n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯基。在室温下孵育后，将反应用dpbs稀释至所需的最终浓度。然后使用zeba柱，通过缓冲液交换成dpbs，由接头离去基团(其包含作为交联反应的一部分除去的接头的分子片段)和未反应的接头纯化蛋白纳米凝胶。蛋白纳米凝胶任选地进一步与聚合物，抗体分子或聚合物和抗体分子两者偶联。合适的抗体分子是抗cd45单克隆抗体(克隆bc8；从杂交瘤培养物中纯化；atcc目录号hb-10507)。然后将缓冲液交换的蛋白纳米凝胶用等体积的汉克斯平衡盐溶液(hbss)稀释至所需的最终浓度，用于下游测定，例如与活化的原代t细胞，原代nk细胞，nk细胞系nk-92(atcc目录号crl-2407)，或这些t和nk细胞的修饰版本的结合。通过sds-page，尺寸排阻色谱(sec)和动态光散射(dls)分析评估蛋白纳米凝胶的形成。当形成蛋白纳米凝胶时，游离蛋白质或蛋白质复合物通过可降解接头转化为交联蛋白质。这种交联导致颗粒的流体动力学半径更大，这表现为通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)不能有效迁移的蛋白质颗粒。在使用bioseptmsec-s4000柱(费洛蒙公司(phenomenexinc.))和pbs(ph7.2)作为洗脱液(流速0.5ml/min)在配备有光电二极管阵列(岛津公司(shimadzucorp.))的prominencehplc系统上进行分析，蛋白纳米凝胶将以更快的洗脱时间行进，与更大的分子种类一致。在nanobrookomni粒度分析仪(纳诺布鲁克仪器公司(nanobrookinstrumentscorp.))上通过动态光散射(dls)以90度角分析纳米凝胶尺寸和多分散性。实施例2：分离t细胞，b细胞和nk细胞从健康供体分离t细胞和nk细胞。将一天龄leukopack细胞(生物专业公司(biospecialties，inc.))用dpbs以体积1∶1稀释，并在密度垫(淋巴细胞分离剂(lymphoprep)，干细胞技术公司(stemcelltech.))上在50ml管(15ml淋巴细胞分离剂顶上35ml稀释的leukopack)中分层。在800g离心30分钟后，在淋巴细胞分离剂和dpbs之间的界面处收获单核细胞。将细胞在50mldpbs中洗涤3次以除去残留的淋巴细胞分离剂和细胞碎片。根据制造商的说明，分别使用抗cd3(或抗cd8)和抗cd56偶联的珠(美天旎公司(miltenyi))通过连续磁珠分选来分离t细胞和nk细胞。简而言之，ls柱用3ml冰冷dpbs平衡，而抗体偶联的珠与单核细胞一起孵育(在+4℃下30分钟)。将细胞加载到柱中后，用3ml冰冷dpbs进行3次洗涤，并用5ml冰冷dpbs将细胞从柱中冲出。分离后，将t细胞置于完全培养基(cm-t)(龙沙公司)，glutamaxx(生命技术公司)，20％fbs(生命技术公司)，2.5ug/ml人白蛋白(奥卡医药公司)，0.5ug/ml肌醇(西格玛公司)，补充20ng/ml白细胞介素-2(il-2))中持续至少2小时。分离后，将nk细胞静置于nk完全培养基(cm-nk)(含有重组转铁蛋白(龙沙公司)的xvivo10，glutamaxx(生命技术公司)，5％人血清ab(康宁公司)，补充20ng/ml白细胞介素-2(il-2))中持续至少2小时。实施例3：标记之前t细胞的活化在与蛋白纳米凝胶结合之前，合并的cd4+和cd8+t细胞(其是由实施例2中描述的抗cd3选择产生的主要细胞类型)或分离的cd8+t细胞(均如实施例2中所述获得)首先按照制造商的说明用cd3/cd28dynabeads(赛默飞世尔科技公司(thermofisher)，目录号1132d)活化。将t细胞和cd3/cd28dynabeads在补充有20ng/ml白细胞介素-2(il-2)的cm-t中于37℃和5％co2孵育2天。然后通过磁分离从t细胞中除去cd3/cd28dynabeads。实施例4：蛋白纳米凝胶与t细胞结合和冷冻保存蛋白纳米凝胶(背包枕)与活化的人t细胞结合并经历冻融循环。简言之，如实施例1中所述制备背包枕。为了支持下游流式细胞术分析，使用3质量％alexa-647标记的蛋白质或蛋白质复合物和97质量％未标记的蛋白质或蛋白质复合物产生背包枕。使用alexa-fluor-647标记试剂盒根据制造商的说明书(赛默飞世尔科技公司，目录号a20186，100ug级试剂盒；或目录号a20173，1mg级试剂盒)荧光标记蛋白质或蛋白质复合物。蛋白纳米凝胶合成的所有其他步骤如实施例1中所述进行。用dpbs洗涤根据实施例3制备的活化t细胞，并用蛋白质纳米凝胶背包枕在37℃下以约108个细胞/ml的最终细胞密度孵育1小时。通过倒置或温和涡旋每10-15分钟混合溶液。然后将细胞重悬于含有fbs的细胞冷冻培养基中，所述细胞冷冻培养基含有5％二甲基亚砜(dmso)或无血清冷冻培养基(bambanker，淋巴技术公司(lymphotec，inc.)，目录号bb02)，其密度为107个细胞/ml，并且如制造商所述，转移到低温小瓶中冷冻以在mr.frostytm冷冻容器(乐基因公司(nalgene))中冷冻。在-80℃下在mr.frostytm容器中孵育过夜后，通过在37℃的水浴中孵育将细胞解冻并用dpbs洗涤以除去冷冻培养基和未结合的背包。替代的冷冻长度在下面的其他实施例中描述(例如2小时或2周)。然后将细胞在含20ng/mlil-2的cm-t中在37℃和5％co2下培养。使用具有facsdivatm软件(bd生物科学公司(bdbiosciences))的facscelestatm流式细胞仪通过流式细胞术监测背包枕与t细胞的结合，以量化在冷冻和解冻后背包枕与t细胞的持久结合。实施例5：蛋白纳米凝胶与原代nk细胞和nk-92细胞系的结合蛋白纳米凝胶(背包枕)与原代人nk细胞(如实施例2中所述分离)和nk-92细胞(atcc目录号crl-2407)结合并进行冻融循环。如实施例1中所述进行蛋白纳米凝胶合成。用dpbs洗涤nk细胞，并在37℃下以约108个细胞/ml的最终细胞密度与蛋白纳米凝胶背包枕头孵育1小时。通过倒置或温和涡旋每10-15分钟混合溶液。然后将细胞重悬于无血清冷冻培养基(bambanker，淋巴技术公司，目录号bb02)，其密度为107个细胞/ml，并且如制造商所述，转移到低温小瓶中冷冻以在mr.frostytm冷冻容器(乐基因公司)中冷冻。在-80℃下在mr.frostytm容器中孵育2小时后，通过在37℃的水浴中孵育将细胞解冻并用dpbs洗涤以除去冷冻培养基和未结合的背包。替代的冷冻长度在下面的其他实施例中描述(例如2小时或2周)。然后将细胞在含20ng/mlil-2的cm-t中在37℃和5％co2下培养。实施例6：cd8t细胞在含有il-2的cm-t中的细胞增殖将cd8t细胞与背包枕一起孵育，然后在fbs+5％dmso中冷冻过夜。解冻后，与背包结合的t细胞在含有il-2的cm-t中培养，同时用相同的方式处理对照cd8t细胞，但没有背包。在解冻后的时间点(例如，4小时和48小时)测量活细胞的数量，以量化具有和不具有背包枕的cd8t细胞的恢复速度。实施例7：cd3t细胞在不含il-2的cm-t中的细胞增殖将cd3t细胞与背包枕一起孵育，然后在无血清培养基(bambanker)中冷冻。解冻后，与背包结合的cd3t细胞在不含il-2的cm-t中培养，同时用相同的方式处理对照cd3t细胞，但没有背包。合适的对照包括在不含il-2的cm-t中解冻和培养的cd3t细胞，在含有可溶性il-2(20ng/ml)的cm-t中解冻和培养的cd3t细胞，以及在与蛋白纳米凝胶中使用的相同蛋白质的可溶(非交联)形式中解冻和培养的cd3t细胞。在解冻后的时间点(例如，16小时，2天，7天和9天)测量活细胞的数量。实施例8：nk-92细胞系和原代nk细胞的细胞增殖将nk-92细胞和原代nk细胞与背包枕一起孵育，然后在无血清培养基(bambanker)中冷冻。解冻后，与背包结合的细胞在不含il-2的cm-nk中培养。合适的对照包括在不含il-2的cm-nk中解冻和培养的原代nk细胞和nk-92细胞，在含有可溶性il-2(20ng/ml)的cm-nk中解冻和培养的原代nk细胞和nk-92细胞，在与蛋白纳米凝胶中使用的相同蛋白质的可溶(非交联)形式中解冻和培养的原代nk细胞和nk-92细胞，以及与背包枕结合但未冷冻保存并在不含il-2的cm-nk中培养的nk-92细胞。在解冻后的时间点(例如，16小时，1天，5天，6天和9天)测量活细胞的数量。实施例9：t细胞子集和活化使用以下荧光染料偶联的抗体(bd生物科学公司)通过流式细胞术进一步表征如实施例7中处理的cd3t细胞：cd4，cd8，cd45ra和cd45ro。测量cd8t细胞的比例及其活化状态。实施例10：活化的cd3t细胞针对靶细胞的短期功效如实施例7中处理的cd3t细胞的细胞毒活性在解冻后1天表征。将cd3t细胞与之前用pkh67(西格玛公司)标记的靶细胞(道迪，atcc)以不同的效应物与靶(e∶t)比例共培养。16小时后通过流式细胞术测量靶细胞的杀伤。在含有il-2(20ng/ml)的cm-t中进行共培养16小时。将死细胞用碘化丙啶(pi，bd生物科学公司)染色并通过流式细胞术分析。在将pi+pkh67+细胞的数量除以pkh67+细胞的总数并减去单独培养靶细胞获得的比例(背景靶细胞存活率)后，计算杀伤分数。在离心细胞后收集来自细胞毒性测定的细胞共培养物上清液并储存在-20℃。根据制造商的说明书，通过elisa(rd公司)测量上清液中的ifng浓度。实施例11：活化的cd8t细胞针对靶细胞的长期功效将cd8t细胞与背包枕一起孵育，并冷冻保存或用不含il-2的cm-t培养。在不含il-2的cm-t中培养18天后比较它们的细胞毒活性。将cd8t细胞与之前用pkh67(西格玛公司)标记的靶细胞(道迪，atcc)以不同的效应物与靶(e∶t)比例共培养。16小时后通过流式细胞术测量靶细胞的杀伤。在含有il-2(20ng/ml)的cm-t中进行共培养16小时。将死细胞用碘化丙啶(pi，bd生物科学公司)染色并通过流式细胞术分析。在将pi+pkh67+细胞的数量除以pkh67+细胞的总数并减去单独培养靶细胞获得的比例(背景靶细胞存活率)后，计算杀伤分数。在离心细胞后收集来自细胞毒性测定的细胞共培养物上清液并储存在-20℃。根据制造商的说明书，通过elisa(rd公司)测量上清液中的ifng浓度。实施例12：il-2存在下活化的cd8t细胞针对靶细胞的功效表征如实施例6中处理的cd8t细胞的细胞毒活性。将cd8t细胞与之前用pkh67(西格玛公司)标记的靶细胞(道迪，atcc)以不同的效应物与靶(e∶t)比例共培养。16小时后通过流式细胞术测量靶细胞的杀伤。在含有il-2(20ng/ml)的cm-t中进行共培养16小时。将死细胞用碘化丙啶(pi，bd生物科学公司)染色并通过流式细胞术分析。在将pi+pkh67+细胞的数量除以pkh67+细胞的总数并减去单独培养靶细胞获得的比例(背景靶细胞存活率)后，计算杀伤分数。在离心细胞后收集来自细胞毒性测定的细胞共培养物上清液并储存在-20℃。根据制造商的说明书，通过elisa(rd公司)测量上清液中的ifng浓度。实施例13：原代nk细胞针对靶细胞的功效表征如实施例8中处理的原代nk细胞的细胞毒活性。将原代nk细胞与之前用pkh67(西格玛公司)标记的靶细胞(道迪，atcc)以不同的效应物与靶(e∶t)比例共培养。16小时后通过流式细胞术测量靶细胞的杀伤。在含有il-2(20ng/ml)的cm-t中进行共培养16小时。将死细胞用碘化丙啶(pi，bd生物科学公司)染色并通过流式细胞术分析。在将pi+pkh67+细胞的数量除以pkh67+细胞的总数并减去单独培养靶细胞获得的比例(背景靶细胞存活率)后，计算杀伤分数。在离心细胞后收集来自细胞毒性测定的细胞共培养物上清液并储存在-20℃。根据制造商的说明书，通过elisa(rd公司)测量上清液中的ifng浓度。实施例14：产生il-15蛋白质变体产生两种il-15蛋白质变体。第一il-15变体(下文称为il-15wt/寿司-fc；参见图1a)包含野生型人il-15(seqidno：1)与人il-15受体α(il-15rα；seqidno：5)的寿司结构域的fc融合体的非共价复合物。野生型il-15和il-15rα分别由genbank登录号caa62616.1和aai21141.1给出，其通过引用全文并入本文。第二il-15变体(下文称为il-15n72d/寿司-fc；参见图1b)包括含有n72d点突变(seqidno：6)的人il-15的非共价复合物，其具有人il-15受体α的寿司结构域(il-15rα；seqidno：5)的fc融合体。从无血清培养基中由悬浮液适应的hek293产生蛋白质，然后通过蛋白质a亲和力纯化，并将缓冲液交换成达氏磷酸盐缓冲盐水(dpbs)。人il-15受体α的寿司结构域的fc融合体：含有n72d点突变的人il-15：实施例15：形成蛋白纳米凝胶如下形成包含交联蛋白纳米凝胶(背包)的背包蛋白纳米凝胶。使用25倍摩尔过量的可降解交联剂将浓度为15mg/ml的il-15wt/寿司-fc或il-15n72d/寿司-fc交联到蛋白纳米颗粒中。在该研究中使用的交联剂，双[2-(n-琥珀酰亚胺基-氧基羰基氧基)乙基]二硫化物，含有两个n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯基团，通过如式i所示的含有二硫化物的柔性接头连接在一起。式i：在室温下孵育30分钟后，用dpbs将反应稀释10倍至1.5mg/ml的最终细胞因子浓度。然后使用zeba柱(7,000或40,000mw截止值，可从赛默飞世尔科技公司获得)，通过缓冲液交换成dpbs，由接头离去基团(其包含作为交联反应的一部分被去除的接头的分子片段)和未反应的接头纯化蛋白纳米凝胶。根据制造商的说明使用zeba柱，包括通过用dpbs连续三次洗涤来平衡dpbs中的柱以促进缓冲液交换，然后施加反应产物。细胞因子浓度约为1-1.5mg/ml的缓冲液交换蛋白纳米凝胶用等体积的汉克斯平衡盐溶液(hbss)稀释至约0.5-0.75mg/ml的终浓度，用于下游试验，如与活化的原代t细胞，原代nk细胞，nk细胞系nk-92(atcc目录号crl-2407)或这些t和nk细胞的修饰形式结合。通过sds-page，尺寸排阻色谱(sec)和动态光散射(dls)分析评估蛋白纳米凝胶的形成。当形成蛋白纳米凝胶时，游离的il-15/寿司-fc通过可降解接头转化为交联的蛋白质。这种交联导致颗粒的流体动力学半径更大，表现为通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)无法有效迁移的蛋白质颗粒，参见图2。使用bioseptmsec-s4000色谱柱进行sec分析(在装有光电二极管阵列(岛津公司)的prominencehplc系统上用pbs(ph7.2)作为洗脱液(流速0.5ml/min)的(费洛蒙公司)显示蛋白纳米凝胶以更快的洗脱时间行进，与较大的分子种类一致(图3)。蛋白纳米凝胶(图3)与游离(非交联)蛋白质(图4)的hplc痕量的比较揭示了交联纳米凝胶中剩余最小量的游离蛋白质，表明蛋白质几乎完全转化为交联的纳米凝胶。在nanobrookomni粒度分析仪(纳诺布鲁克仪器公司)上通过动态光散射(dls)以90度角分析纳米凝胶尺寸和多分散性，参见表1。未交联的il-15n72d/寿司-fc的流体动力学直径基于相似大小的分子(igg)的半径估计为约10nm。表1：基于dls的交联的粒度实施例16：在表面上形成具有聚阳离子聚合物的蛋白纳米凝胶如下形成包含具有阳离子聚合物表面的蛋白纳米凝胶的蛋白纳米凝胶(背包枕)。使用25倍摩尔过量的式i中指定的可降解交联剂将浓度为15mg/ml的il-15wt/寿司-fc或il-15n72d/寿司-fc交联到蛋白质纳米颗粒中。在室温下30分钟后，用dpbs将反应稀释10倍至1.5mg/ml的最终细胞因子浓度。然后使用zeba柱(7,000或40,000mw截止值，可从赛默飞世尔科技公司获得)，通过缓冲液交换成dpbs，由接头离去基团(其包含作为交联反应的一部分被去除的接头的分子片段)和未反应的接头纯化蛋白纳米凝胶。根据制造商的说明使用zeba柱，包括通过用dpbs连续三次洗涤来平衡dpbs中的柱以促进缓冲液交换，然后施加反应产物。细胞因子浓度约为1-1.5mg/ml的缓冲液交换蛋白纳米凝胶用然后与以下偶联：聚乙二醇-聚赖氨酸(peg-polyk)嵌段共聚物：peg5k-polyk30(alamanda聚合物目录号050-kc030)，其是包含5千道尔顿(kd)聚乙二醇(peg5k)和30氨基酸聚赖氨酸聚合物(聚赖氨酸30或聚k30)或peg5k-polyk200(alamanda聚合物，目录号050-kc200)的嵌段共聚物。将peg5k-polyk30或peg5k-polyk200在dpbs中重建至10mg/ml，并以50ug/ml的最终嵌段共聚物浓度添加至蛋白纳米凝胶中，并在室温下孵育30分钟。在nanobrookomni粒度分析仪(纳诺布鲁克仪器公司)上通过动态光散射(dls)以90度角分析表面官能化纳米粒子的尺寸和多分散性，参见表1，并且通过尺寸排阻色谱法使用prominencehplc系统上的bioseptmsec-s4000柱(费洛蒙公司)评估相对纳米颗粒的转化率，其使用pbs(ph7.2)作为洗脱液(流速0.5ml/min)，其配备有光电二极管阵列(岛津公司)，参见图5。用等体积的汉克斯平衡盐溶液(hbss)稀释最终的背包枕蛋白纳米凝胶至约0.5-0.75mg/ml的终浓度，用于下游试验，例如与活化的原代t细胞，原代nk细胞，nk细胞系nk-92(atcc目录号crl-2407)，或这些t细胞和nk细胞的修饰形式的结合。实施例17：形成具有表面结合亲和配体的蛋白纳米凝胶如下形成包含具有表面结合亲和配体和阳离子聚合物表面的蛋白纳米凝胶的蛋白纳米凝胶(背包枕)。使用25倍摩尔过量的式i中指定的可降解交联剂将浓度为15mg/ml的il-15wt/寿司-fc或il-15n72d/寿司-fc交联到蛋白纳米颗粒中。在室温下孵育30分钟后，用dpbs将反应稀释10倍至1.5mg/ml的最终细胞因子浓度。然后通过加入抗体至50ug/ml的终浓度将抗cd45单克隆抗体(克隆bc8；从杂交瘤培养物中纯化；atcc目录号hb-10507)与交联蛋白纳米颗粒偶联并在室温下孵育30-60分钟。然后使用zeba柱(7,000或40,000mw截止值，可从赛默飞世尔科技公司获得)，通过缓冲液交换成dpbs，由接头离去基团(其包含作为交联反应的一部分被去除的接头的分子片段)和未反应的接头纯化具有表面偶联的抗cd45抗体的蛋白纳米凝胶。根据制造商的说明使用zeba柱，包括通过用dpbs连续三次洗涤来平衡dpbs中的柱以促进缓冲液交换，然后施加反应产物。细胞因子浓度约为1-1.5mg/ml的缓冲液交换蛋白纳米凝胶用等体积的汉克斯平衡盐溶液(hbss)稀释至约0.5-0.75mg/ml的终浓度，用于下游试验，如与活化的原代t细胞，原代nk细胞，nk细胞系nk-92(atcc目录号crl-2407)或这些t和nk细胞的修饰形式的结合。通过dls分析表面官能化纳米颗粒的尺寸和多分散性(表1)。通过在bioseptmsec-s4000柱(费洛蒙公司)上sec评估抗cd45抗体的掺入效率：游离抗cd45抗体(图6)与抗cd45表面功能化蛋白纳米凝胶(图7)的比较揭示纳米凝胶样品中的游离最小igg，表明抗体与纳米凝胶表面几乎完全偶联。实施例18：形成具有表面上阳离子聚合物和表面结合亲和配体的蛋白纳米凝胶如下形成包含具有表面结合亲和配体和阳离子聚合物表面的蛋白纳米凝胶的蛋白纳米凝胶(背包枕)。使用25倍摩尔过量的式i中指定的可降解交联剂将浓度为15mg/ml的il-15wt/寿司-fc或il-15n72d/寿司-fc交联到蛋白纳米颗粒中。在室温下孵育30分钟后，用dpbs将反应稀释10倍至1.5mg/ml的最终细胞因子浓度。然后通过加入抗体至50ug/ml的终浓度将抗cd45单克隆抗体(克隆bc8；从杂交瘤培养物中纯化；atcc目录号hb-10507)与交联蛋白纳米颗粒偶联并在室温下孵育30-60分钟。然后使用zeba柱(7,000或40,000mw截止值，可从赛默飞世尔科技公司获得)通过缓冲液交换成dpbs，由接头离去基团(其包含作为交联反应的一部分被去除的接头的分子片段)和未反应的接头纯化具有表面偶联的抗cd45抗体的蛋白纳米凝胶。根据制造商的说明使用zeba柱，包括通过用dpbs连续三次洗涤来平衡dpbs中的柱以促进缓冲液交换，然后施加反应产物。然后将约1-1.5mg/ml的缓冲液交换的蛋白纳米凝胶与peg5k-polyk30(alamanda聚合物目录号050-kc030)或peg5k-polyk200(alamanda聚合物目录号050-kc200)偶联。将peg5k-polyk30或peg5k-polyk200在dpbs中重建至10mg/ml，并以50ug/ml的最终嵌段共聚物浓度添加至蛋白纳米凝胶中，并在室温下孵育30分钟。在nanobrookomni粒度分析仪(纳诺布鲁克仪器公司)上通过dls分析表面官能化纳米粒子的尺寸和多分散性(表2)，并且通过sec使用prominencehplc系统上的bioseptmsec-s4000柱(费洛蒙公司)评估相对纳米颗粒的转化率，其使用pbs(ph7.2)作为洗脱液(流速0.5ml/min)，其配备有光电二极管阵列(岛津公司)，图8。表2.添加polyk后纳米颗粒的尺寸。潜在聚合以灰色显示。用等体积的汉克斯平衡盐溶液(hbss)稀释最终的背包枕蛋白纳米凝胶至约0.5-0.75mg/ml的终浓度，用于下游试验，例如与活化的原代t细胞，原代nk细胞，nk细胞系nk-92(atcc目录号crl-2407)，或这些t细胞和nk细胞的修饰形式的结合。将荧光标记的纳米颗粒加载到活化的幼稚t细胞上定量，如下表3中所示。纳米颗粒中聚合物的量和类型平均荧光强度无polyk34,2281mg/mlpeg5kpolyk200561bc81mg/mlpeg5kpolyk2002,7580.1mg/mlpeg5kpolyk20011,1511mg/mlpeg20kpolyk10092,91210mg/mlpeg20kpolyk5026,0481mg/mlpeg5kpolyk30127,92250mg/mlpeg20kpolyk108,726实施例19：分离t细胞，b细胞和nk细胞从健康供体分离t细胞和nk细胞。将一天龄leukopack细胞(生物专业公司)用dpbs以体积1∶1稀释，并在密度垫(淋巴细胞分离剂，干细胞技术公司)上在50ml管(15ml淋巴细胞分离剂顶上35ml稀释的leukopack)中分层。在800g离心30分钟后，在淋巴细胞分离剂和dpbs之间的界面处收获单核细胞。将细胞在50mldpbs中洗涤3次以除去残留的淋巴细胞分离剂和细胞碎片。根据制造商的说明，分别使用抗cd3(或抗cd8)和抗cd56偶联的珠(美天旎公司)通过连续磁珠分选来分离t细胞和nk细胞。简而言之，ls柱用3ml冰冷dpbs平衡，而抗体偶联的珠与单核细胞一起孵育(在+4℃下30分钟)。将细胞加载到柱中后，用3ml冰冷dpbs进行3次洗涤，并用5ml冰冷dpbs将细胞从柱中冲出。分离后，将t细胞置于完全培养基(cm-t)(龙沙公司)，glutamaxx(生命技术公司)，20％fbs(生命技术公司)，2.5ug/ml人白蛋白(奥卡医药公司)，0.5ug/ml肌醇(西格玛公司)，补充20ng/ml白细胞介素-2(il-2))中持续至少2小时。分离后，将nk细胞静置于nk完全培养基(cm-nk)(含有重组转铁蛋白(龙沙公司)的xvivo10，glutamaxx(生命技术公司)，5％人血清ab(康宁公司)，补充20ng/ml白细胞介素-2(il-2))中持续至少2小时。实施例20：标记前t细胞的活化在与蛋白纳米凝胶结合之前，合并的cd4+和cd8+t细胞(其是由实施例19中描述的抗cd3选择产生的主要细胞类型)或分离的cd8+t细胞(均如实施例19中所述获得)首先按照制造商的说明用cd3/cd28dynabeads(赛默飞世尔科技公司(thermofisher)，目录号1132d)活化。将t细胞和cd3/cd28dynabeads在补充有20ng/ml白细胞介素-2(il-2)的cm-t中于37℃和5％co2孵育2天。然后通过磁分离从t细胞中除去cd3/cd28dynabeads。实施例21：蛋白纳米凝胶与t细胞结合和冷冻保存蛋白纳米凝胶(背包枕)与活化的人t细胞结合并经历冻融循环。简言之，如实施例16中所述制备背包枕，其由用聚阳离子聚合物(peg5k-polyk30)表面官能化的il-15n72d/寿司-fc或il-15wt/寿司-fc蛋白纳米凝胶组成。为了支持下游流式细胞术分析，使用3质量％alexa-647标记的il-15n72d/寿司-fc和97质量％未标记的il-15n72d/寿司-fc。使用alexa-fluor-647标记试剂盒根据制造商的说明书(赛默飞世尔科技公司，目录号a20186，100ug级试剂盒；或目录号a20173，1mg级试剂盒)荧光标记il-15n72d/寿司-fc。蛋白纳米凝胶合成的所有其他步骤如实施例16中所述进行。用dpbs洗涤根据实施例20制备的活化t细胞，并用约0.5-0.75mg/ml的相等细胞因子浓度的蛋白质纳米凝胶背包枕在37℃下以约108个细胞/ml的最终细胞密度孵育1小时。通过倒置或温和涡旋每10-15分钟混合溶液。然后将细胞重悬于含有fbs的细胞冷冻培养基中，所述细胞冷冻培养基含有5％二甲基亚砜(dmso)或无血清冷冻培养基(bambanker，淋巴技术公司，目录号bb02)，其密度为107个细胞/ml，并且如制造商所述，转移到低温小瓶中冷冻以在mr.frostytm冷冻容器(乐基因公司)中冷冻。在-80℃下在mr.frostytm容器中孵育过夜后，通过在37℃的水浴中孵育将细胞解冻并用dpbs洗涤以除去冷冻培养基和未结合的背包。替代的冷冻长度在下面的其他实施例中描述(例如2小时或2周)。然后将细胞在含20ng/mlil-2的cm-t中在37℃和5％co2下培养。使用具有facsdivatm软件(bd生物科学公司)的facscelestatm流式细胞仪通过流式细胞术监测背包枕与t细胞的结合，并显示在冷冻和解冻后背包枕与t细胞的持续结合(图9)。实施例22：蛋白纳米凝胶与原代nk细胞和nk-92细胞系的结合蛋白纳米凝胶(背包枕)与原代人nk细胞(如实施例19中所述分离)和nk-92细胞(atcc目录号crl-2407)结合并进行冻融循环。简而言之，如实施例16中所述制备用聚阳离子聚合物(peg5k-polyk30)表面官能化的il-15n72d/寿司-fc蛋白纳米凝胶的背包枕。如实施例16中所述进行蛋白质纳米凝胶合成的所有其他步骤。用dpbs洗涤nk细胞，并在37℃下以约108个细胞/ml的最终细胞密度孵育1小时，其中蛋白质纳米凝胶背包枕头的等效细胞因子浓度为约0.5-0.75mg/ml。通过倒置或温和涡旋每10-15分钟混合溶液。然后将细胞重悬于无血清冷冻培养基(bambanker，淋巴技术公司，目录号bb02)，其密度为107个细胞/ml，并且如制造商所述，转移到低温小瓶中冷冻以在mr.frostytm冷冻容器(乐基因公司)中冷冻。在-80℃下在mr.frostytm容器中孵育2小时后，通过在37℃的水浴中孵育将细胞解冻并用dpbs洗涤以除去冷冻培养基和未结合的背包。替代的冷冻长度在下面的其他实施例中描述(例如2小时或2周)。然后将细胞在含20ng/mlil-2的cm-t中在37℃和5％co2下培养。实施例23：cd8t细胞在含有il-2的cm-t中的细胞增殖将cd8t细胞与il-15n72d/寿司-fc背包一起孵育，然后在fbs+5％dmso中冷冻过夜。解冻后，与背包结合的t细胞在含有il-2的cm-t中培养，同时用相同的方式处理对照cd8t细胞，但没有背包。在解冻后的指定时间测量活细胞数。在冷冻保存活化的cd8t细胞之前，背包的结合促进了cd8t细胞的更快恢复。实际上，在解冻后2天，携带背包的cd8t细胞比在含有il-2的培养基中解冻和培养的cd8t细胞扩增约2倍(图10)。实施例24：cd3t细胞在不含il-2的cm-t中的细胞增殖将cd3t细胞与il-15n72d/寿司-fc或il-15wt/寿司-fc背包一起孵育，然后在无血清培养基(bambanker)中冷冻指定的时间。解冻后，与背包结合的cd3t细胞在不含il-2的cm-t中培养，同时用相同的方式处理对照cd3t细胞，但没有背包。测试的对照是在不含il-2的cm-t(“仅培养基”)中解冻和培养的cd3t细胞，在含有可溶性il-2(20ng/ml)的cm-t的中解冻和培养的cd3t细胞(“il-2(可溶)”)，在含有可溶性il-15n72d/寿司-fc(“il-15n72d/寿司-fc(0.6ug/ml)”)或可溶性il-15wt/寿司-fc(“il-15wt/寿司-fc(12ug/ml)”)的cm-t中解冻和培养的cd3t细胞。在解冻后的指定时间测量活细胞数。在冷冻保存活化的cd3t细胞之前，背包的结合增加了cd3t细胞的扩增。实际上，在一周或9天后，cd3t细胞增殖的增益分别为约5倍至约10倍(图11a-11b)。实施例25：nk-92细胞系和原代nk细胞的细胞增殖将nk-92细胞和原代nk细胞与il-15n72d/寿司-fc或il-15wt/寿司-fc背包一起孵育，然后在无血清培养基(bambanker)中冷冻指定的时间。解冻后，与背包结合的细胞在不含il-2的cm-nk中培养。测试的对照是在不含il-2的cm-nk(“仅培养基”)中解冻和培养的原代nk细胞和nk-92细胞，在含有可溶性il-2(20ng/ml)的cm-nk的中解冻和培养的原代nk细胞和nk-92细胞(“il-2(可溶)”)，在含有可溶性il-15n72d/寿司-fc(“il-15n72d/寿司-fc(0.6ug/ml)”)中解冻和培养的原代nk细胞和nk-92细胞，在可溶性il-15wt/寿司-fc(“il-15wt/寿司-fc(12ug/ml)”)的cm-nk中解冻和培养的nk-92细胞，与il-15n72d/寿司-fc背包结合但不冷冻保存并且在不含il-2的cm-nk(“il-15wt/寿司-fc背包(无冷冻)”)中培养的nk-92细胞。在解冻后的指定时间测量活细胞数。在冷冻保存nk-92和原代nk细胞之前，背包的结合增加了细胞增殖。实际上，在5天后，与用相同方式处理的含有il-2的nk-92培养相比，nk-92细胞增殖的增益分别为约2.5倍。对于背包处理的，不是冷冻保存的nk-92细胞，最大增殖约为4倍。与以相同方式处理的含有il-2的原代nk培养相比，原代nk细胞增殖也增加约5倍(图12a-12b)。实施例26：t细胞子集和活化使用以下荧光染料偶联的抗体(bd生物科学公司)通过流式细胞术进一步表征如实施例24中处理的cd3t细胞：cd4，cd8，cd45ra和cd45ro。用溶液中或作为背包的il-15n72d/寿司-fc处理增加cd8t细胞的比例，而不影响它们的活化状态，以cd45ra+分数测量(图13a-13b)。实施例27：活化的cd3t细胞针对靶细胞的短期功效如实施例7中处理的cd3t细胞的细胞毒活性在解冻后1天表征。将cd3t细胞与之前用pkh67(西格玛公司)标记的靶细胞(道迪，atcc)以不同的效应物与靶(e∶t)比例共培养。16小时后通过流式细胞术测量靶细胞的杀伤。在含有il-2(20ng/ml)的cm-t中进行共培养16小时。将死细胞用碘化丙啶(pi，bd生物科学公司)染色并通过流式细胞术分析。在将pi+pkh67+细胞的数量除以pkh67+细胞的总数并减去单独培养靶细胞获得的比例(背景靶细胞存活率)后，计算杀伤分数。在离心细胞后收集来自细胞毒性测定的细胞共培养物上清液并储存在-20℃。根据制造商的说明书，通过elisa(rd公司)测量上清液中的ifng浓度。与背包结合没有妨碍cd3t细胞发挥其细胞毒活性。相反，与以相同方式处理的含有il-2的cd3t细胞培养物相比，冷冻保存前与il-15n72d/寿司-fc背包的结合改善了cd3t细胞的功效(图14a-14b)。实施例28：活化的cd8t细胞针对靶细胞的长期功效将cd8t细胞与il-15n72d/寿司-fc背包一起孵育，并冷冻保存或返回用不含il-2的cm-t培养。在不含il-2的cm-t中培养18天后比较它们的细胞毒活性。将cd8t细胞与之前用pkh67(西格玛公司)标记的靶细胞(道迪，atcc)以不同的效应物与靶(e∶t)比例共培养。16小时后通过流式细胞术测量靶细胞的杀伤。在含有il-2(20ng/ml)的cm-t中进行共培养16小时。将死细胞用碘化丙啶(pi，bd生物科学公司)染色并通过流式细胞术分析。在将pi+pkh67+细胞的数量除以pkh67+细胞的总数并减去单独培养靶细胞获得的比例(背景靶细胞存活率)后，计算杀伤分数。在离心细胞后收集来自细胞毒性测定的细胞共培养物上清液并储存在-20℃。根据制造商的说明书，通过elisa(rd公司)测量上清液中的ifng浓度。背包与cd8t细胞的结合允许cd8t细胞在不含il-2的培养物中增殖并存活18天，并完全消除冷冻保存对t细胞的负面影响(图15a-15b)。实施例29：il-2存在下活化的cd8t细胞针对靶细胞的功效表征如实施例23中处理的cd8t细胞的细胞毒活性。将cd8t细胞与之前用pkh67(西格玛公司)标记的靶细胞(道迪，atcc)以不同的效应物与靶(e∶t)比例共培养。16小时后通过流式细胞术测量靶细胞的杀伤。在含有il-2(20ng/ml)的cm-t中进行共培养16小时。将死细胞用碘化丙啶(pi，bd生物科学公司)染色并通过流式细胞术分析。在将pi+pkh67+细胞的数量除以pkh67+细胞的总数并减去单独培养靶细胞获得的比例(背景靶细胞存活率)后，计算杀伤分数。在离心细胞后收集来自细胞毒性测定的细胞共培养物上清液并储存在-20℃。根据制造商的说明书，通过elisa(rd公司)测量上清液中的ifng浓度。与在含有il-2的cm-t中培养的解冻的cd8t细胞相比，在冷冻保存之前背包与cd8t细胞的结合并且在解冻后培养期间存在可溶性il-2改善了活化的cd8t细胞的功效(图16a-16b)。实施例30：原代nk细胞针对靶细胞的功效表征如实施例25中处理的原代nk细胞的细胞毒活性。将原代nk细胞与之前用pkh67(西格玛公司)标记的靶细胞(道迪，atcc)以不同的效应物与靶(e∶t)比例共培养。16小时后通过流式细胞术测量靶细胞的杀伤。在含有il-2(20ng/ml)的cm-nk中进行共培养16小时。将死细胞用碘化丙啶(pi，bd生物科学公司)染色并通过流式细胞术分析。在将pi+pkh67+细胞的数量除以pkh67+细胞的总数并减去单独培养靶细胞获得的比例(背景靶细胞存活率)后，计算杀伤分数。在离心细胞后收集来自细胞毒性测定的细胞共培养物上清液并储存在-20℃。根据制造商的说明书，通过elisa(rd公司)测量上清液中的ifng浓度。与在含有il-2的cm-nk中培养的冷冻保存的原代nk细胞相比，在冷冻保存之前背包与原代nk细胞的结合明显改善了原代nk细胞的功效(图17a-17b)。实施例31：分离和活化原代鼠cd8t细胞通过阴性选择从c57b/6小鼠的脾中纯化鼠cd8t细胞。通过在鼠t细胞完全培养基(cm-mt：rpmi，10％fbs，1xpen-strep，1xl-glut，50umβ-巯基乙醇，西格玛公司；its1％，西格玛公司；第0天)中涂覆有抗cd3和抗cd28抗体(分别为be0001-1和be0015-1，bio-xcell)的6孔板上以106/ml的密度接种来活化细胞。孵育一天后，加入鼠il-2(20ng/ml；402-ml，rd系统公司)和鼠il-7(0.5ng/ml；407-ml，rd系统公司)(第1天)。再孵育一天后，将细胞重新接种至0.2×105个细胞/ml(第2天)，然后在后一天(第3天)再次接种至相同的密度。在第4天收获细胞用于背包附着。实施例32：在不含il-2的cm-mt中原代冷冻的鼠cd8t细胞的活力将实施例31中产生的细胞与汉克斯平衡盐溶液(hbss，无背包对照)或包含非功能性il15突变体(il15mut/寿司-fcdabp)或功能性il-15(il15wt/寿司-fcdabp)的背包一起孵育，如实施例4中针对il15/寿司-fc构建体所述。il15mut/寿司-fc2da蛋白包含il-15d8n突变并具有最小的生物活性；来自il15mut/寿司-fc2da的背包用作阴性对照以探索功能活性il-15的需要。如实施例14中对il15/寿司-fc所述产生il15wt/寿司-fcda和il15mut/寿司-fc2da蛋白。如实施例4所述，将细胞在-80℃冷冻5天，然后解冻。在cm-mt中培养解冻的细胞2天(图18a)或3天(图18b)。冷冻前(“冷冻前”)，解冻后立即(“解冻后”)和培养后通过双荧光显微镜评估(吖啶橙/碘化丙啶，目录号cs2-0106；cellometer，nexcelom)细胞的活力。实施例33：在不含il-2的cm-mt中原代冷冻的鼠cd8t细胞的增殖如上所述，将活化的鼠cd8t细胞在包含功能性il15(“t-细胞+il15wt/寿司-fc2dabp”)的背包或hbss(“t细胞”)中孵育。然后将细胞在mr.frosty中在-80℃下冷冻3小时(“f/t”)。解冻后，将细胞在cm-mt中培养，在刚解冻(“0”)后，培养第3天和第6天，在cellometerk2(nexcelom生物科学公司)上通过双荧光显微镜吖啶橙/碘化丙啶(ao/pi)评估活力。将未经冷冻/解冻(“新鲜”)的t细胞和背包的t细胞类似地培养用于比较(参见图19)。数据报告为归一化至第0天活细胞计数的活细胞计数(即与第0天的活细胞计数相比活细胞的“倍数变化”)。实施例34：原代人cd8t细胞在不含il-2的cm-t中的增殖如实施例2和3中所述分离和纯化人cd8t细胞。将细胞在hbss，可溶性(非背包)il15wt/寿司-fc2da，包含il15wt/寿司-fc2da而不含peg5kpolyk30聚阳离子的背包，或包含il15wt/寿司-fc2da和peg5kpolyk30的背包中孵育，如实施例4中所述。洗涤处理过的细胞并直接放入培养物中(图20a)或在解冻和培养前进行冷冻7天(图20b)。在接种前(第0天)和培养的第1，3，5和7天，通过流式细胞计数珠(c36950thermofisher)对细胞进行计数。数据报告为相比第0天细胞计数的倍数增加。实施例35：与il15背包冷冻的cd8t细胞的体内增殖将b16f10鼠黑色素瘤细胞皮内注射到6周龄c57bl/6雌性小鼠(105个细胞/小鼠)的剃毛侧腹中。7天后，将预先与hbss，il15wt/寿司-fc2da背包，或非功能性il15mut/寿司-fc2da背包孵育并在bambanker中冷冻5天的pmel转基因cd8t细胞解冻并静脉内给药(107/小鼠)。在第5天(图21a)或第7天(图21b)，通过流式细胞术对血液中转移的t细胞进行计数。数据报告为每ul血液的供体cd8t细胞数。实施例36：与il15背包冷冻的cd8t细胞的肿瘤靶向切除实施例35中小鼠的肿瘤块并通过流式细胞术分析。作为参考，显示了接受新鲜cd8t细胞(有或没有il15wt/寿司-fc2da背包)的小鼠。数据报告为每mg肿瘤的供体cd8t细胞数(图22)。当前第1页12